一種mhc限制性殺傷t細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及擴(kuò)增【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種MHC限制性殺傷T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法：分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞；臍帶血單個(gè)核細(xì)胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPMI-1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同的細(xì)胞因子在培養(yǎng)細(xì)胞的4個(gè)階段使用。使用臍血中提取的MNC細(xì)胞作為原料，通過添加細(xì)胞因子，經(jīng)過15天的擴(kuò)增培養(yǎng)獲得擴(kuò)增10-15倍的CTL，并且具有旺盛的殺瘤活性，使臍血可以作為腫瘤過繼免疫治療所需T淋巴細(xì)胞的來源；該方法能夠獲得較其他方法數(shù)量更多的CTL，并且體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)與熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞毒性增強(qiáng)。
【專利說明】一種MHC限制性殺傷T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及擴(kuò)增【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種MHC限制性殺傷T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
[0002]【背景技術(shù)】
腫瘤過繼免疫治療是指通過向腫瘤患者輸注抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)以達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞治療腫瘤的目的，過繼免疫治療是腫瘤生物治療的重要組成部分，在腫瘤的治療中起著積極的作用，其中常見的細(xì)胞種類包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)的T細(xì)胞(cytokine induced killor, CIK 細(xì)胞)、自然殺傷細(xì)胞(Nature killor, NK 細(xì)胞)和殺傷性T細(xì)胞(cytotoxic T cell，CTL)。其中CTL是機(jī)體特異性抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，是腫瘤免疫治療中較為理想的效應(yīng)細(xì)胞種類。CTL是一類具有CD3+CD8+表面標(biāo)志、具有MHC I限制性的T細(xì)胞，可以特異性地快速性殺傷靶細(xì)胞。雖然CTL受MHC I類分子限制性，T細(xì)胞過繼免疫療法須使用患者自身的血液進(jìn)行，但HLA與患者相同或部分相同的健康個(gè)體也可獲得特異性的CTL。近年來的研究成果肯定了來自患者體內(nèi)或經(jīng)體外腫瘤抗原刺激的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞過繼免疫療法，但該方法仍有不足之處:患者在疾病狀態(tài)下免疫細(xì)胞功能低下，而且經(jīng)連續(xù)放化療之后，使體外擴(kuò)增難度進(jìn)一步增加。因此尋找功能健全的免疫細(xì)胞來源非常必要。
[0003]臍帶血干細(xì)胞是目前的研究熱點(diǎn)，其來源豐富，獲取方便，含有豐富的造血干細(xì)胞和免疫細(xì)胞；同時(shí)臍血造血干細(xì)胞具有多向分化潛能，在造血因子的作用下可以分化擴(kuò)增。目前技術(shù)已能長時(shí)間儲(chǔ)存臍血，經(jīng)深低溫長期儲(chǔ)存的臍血經(jīng)過多種細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)分化，可產(chǎn)生大量免疫細(xì)胞如CIK細(xì)胞和NK細(xì)胞，用于腫瘤過繼免疫治療，但有關(guān)擴(kuò)展臍血CTL的報(bào)道尚不多見。
[0004]雖然很多研究結(jié)果顯示臍血特異性的CTL的殺傷活性較成人外周血CTL低，但臍血T細(xì)胞前體和輔助T細(xì)胞前體的含量與成人外周血相當(dāng)，受異種抗原刺激的增殖反應(yīng)強(qiáng)，仍然可作為過繼免疫治療的來源。如臍血T淋巴細(xì)胞分泌IFN-Y低于成人，但在IL-2刺激后，兩者無明顯差異。經(jīng)PHA-P刺激后能夠使臍血T淋巴細(xì)胞活化，有文獻(xiàn)報(bào)道，臍血淋巴細(xì)胞對不同濃度的植物血凝集素(PHA)和刀豆蛋白A的增殖反應(yīng)與成人相同或高于成人，所以臍血T淋巴細(xì)胞可望成為腫瘤過繼免疫治療的主要替代細(xì)胞來源。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種MHC限制性殺傷τ細(xì)胞(ctl，表型為ra3+ra8+)的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下步驟得到的:
一種MHC限制性殺傷T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(1)分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞；
(2)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPM1-1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同的細(xì)胞因子在培養(yǎng)細(xì)胞的4個(gè)階段使用，
第一階段為第I天，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的Y-1FN, 10-100ng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10-1000IU/mL 的 IL-4 進(jìn)行培養(yǎng)；
第二階段為第2天，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的SCF，lO-lOOng/mL的FLT-3L，lO-lOOng/mL 的 anti_CD3, lO-lOOng/mL 的 anti_CD28 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng);
第三階段為第5-8天，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的SCF, lO-lOOng/mL的FLT-3L, lO-lOOng/mL 的 IL-15 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng)；
第四階段為第9-15天，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的IL-15和100_1000IU/mL的IL-2進(jìn)行培養(yǎng)。
[0007]一種MHC限制性殺傷T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(1)分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞；
(2)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPM1-1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同的細(xì)胞因子在培養(yǎng)細(xì)胞的4個(gè)階段使用，
第一階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-50ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的
Y-1FN, 5-50ng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10_500IU/mL 的 IL-4 進(jìn)行培養(yǎng)；
第二階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 10-50ng/mL 的 SCF, 10_50ng/mL 的 FLT-3L，lO-lOOng/mL的 ant1-CD3, lO-lOOng /mL 的 anti_CD28 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng)；
第三階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-50ng/mL的SCF, 10-50ng/mL的FLT-3L，5_50ng/mL的 IL-15 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng)；
第四階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5-50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2進(jìn)行培養(yǎng)。
[0008]所述的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，優(yōu)選
第一階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/mL的GM-CSF，50ng/mL的\ -1FN, 10ng/mL的IL-15, 2ug/mL 的 PHA-P 和 100IU/mL 的 IL-4 進(jìn)行培養(yǎng)；
第二階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的ant1-CD3, 50ng/mL 的 anti_CD28 和 1000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng)；
第三階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2進(jìn)行培養(yǎng)；
第四階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2進(jìn)行培養(yǎng)。
[0009]所述的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，優(yōu)選在每個(gè)階段中保持細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL。
[0010]所述的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，優(yōu)選培養(yǎng)發(fā)生在37°C、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。
[0011]所述的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，優(yōu)選分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞的步驟包括:臍帶血用淋巴細(xì)胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
1)使用臍血中提取的MNC細(xì)胞作為原料，通過添加細(xì)胞因子，經(jīng)過15天的擴(kuò)增培養(yǎng)獲得擴(kuò)增10-15倍的CTL，并且具有旺盛的殺瘤活性，使臍血可以作為腫瘤過繼免疫治療所需T淋巴細(xì)胞的來源；
2)該方法能夠獲得較其他方法數(shù)量更多的CTL，并且體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)與熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞毒性增強(qiáng)。[0013]【專利附圖】
【附圖說明】
圖1是CTL細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和增殖直方圖，A為培養(yǎng)前CTL細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(X 200)；B為培養(yǎng)后CTL細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；
圖2是流式細(xì)胞術(shù)檢測實(shí)施例1細(xì)胞表型在培養(yǎng)前后的變化，其中A、D、G為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后CD3CD8表型變化圖；B、E、H為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后CD4CD25表型變化圖；C、F、I為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后⑶3⑶56表型變化圖；
圖3是流式細(xì)胞術(shù)檢測實(shí)施例2細(xì)胞表型在培養(yǎng)前后的變化，其中A、D、G為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后CD3CD8表型變化圖；B、E、H為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后CD4CD25表型變化圖；C、F、I為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后⑶3⑶56表型變化圖；
圖4是流式細(xì)胞術(shù)檢測實(shí)施例3細(xì)胞表型在培養(yǎng)前后的變化，其中A、D、G為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后CD3CD8表型變化圖；B、E、H為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后CD4CD25表型變化圖；C、F、I為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后⑶3⑶56表型變化圖；
圖5是實(shí)施例1誘導(dǎo)得到的CTL細(xì)胞殺傷活性檢測結(jié)果(CCK8法)，A為直接提取的臍血MNC細(xì)胞，B為經(jīng)過培養(yǎng)的CTL細(xì)胞；
圖6是實(shí)施例1誘導(dǎo)得到的CLT細(xì)胞內(nèi)TNF- a、GM-CSF, IFN- y、granzymeA、granzymeB、GM-CSF、granulysin、perforin等相關(guān)細(xì)胞因子基因的表達(dá),實(shí)體柱為擴(kuò)增前結(jié)果，空白柱為擴(kuò)增后結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明:
實(shí)施例1:由臍血體外誘導(dǎo)培養(yǎng)CTL細(xì)胞
(I)足月正常分娩之臍血取自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科(產(chǎn)婦知情同意，并經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)同意)，用含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血袋收集，24h內(nèi)實(shí)驗(yàn)。輸血傳播傳染病檢測合格的臍帶血用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，待培養(yǎng)。
[0015]第一階段(第I天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/mL的GM-CSF，50ng/mL的
Y-1FN, 10ng/mL 的 IL-15, 2ug/mL 的 PHA-P 和 100IU/mL 的 IL-4 得到個(gè)性化培養(yǎng)基 1，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X 1O6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)；
第二階段(第2-4天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF，20ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的ant1-CD3, 50ng/mL的anti_CD28和1000IU/mL的IL-2到個(gè)性化培養(yǎng)基2，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)；
第三階段(第5-8天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF，20ng/mL的FLT-3L，IOng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到個(gè)性化培養(yǎng)基3，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)；
第四階段(第9-15天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到個(gè)性化培養(yǎng)基4，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)，得到CTL細(xì)胞。
[0016]上述細(xì)胞培養(yǎng)置于37°C、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔I天通過臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)并檢測細(xì)胞免疫表型和活性。共培養(yǎng)15天后收獲細(xì)胞。細(xì)胞總數(shù)平均由培養(yǎng)前平均細(xì)胞數(shù)4.6 X IO7達(dá)到個(gè)性化培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)7 X IO8,增殖率平均為1522%。圖1是CTL細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察圖，A:為培養(yǎng)前CTL細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(X 200) ；B為培養(yǎng)后CTL細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，可見細(xì)胞聚集成克隆球(X 200)。
[0017]實(shí)施例2:由臍血體外誘導(dǎo)培養(yǎng)CTL細(xì)胞
(I)足月正常分娩之臍血取自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科(產(chǎn)婦知情同意，并經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)同意)，用含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血袋收集，24h內(nèi)實(shí)驗(yàn)。輸血傳播傳染病檢測合格的臍帶血用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，待培養(yǎng)。
[0018]第一階段(第I天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10ng/mL的GM-CSF，10ng/mL的
Y-1FN, 5ng/mL的IL-15, lug/mL的PHA-P和10IU/mL的IL-4得到個(gè)性化培養(yǎng)基1，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)；
第二階段(第2-4天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10ng/mL的SCF，10ng/mL的FLT-3L，IOng/mL的ant1-CD3, 10ng/mL的anti_CD28和1000IU/mL的IL-2到個(gè)性化培養(yǎng)基2，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)；
第三階段(第5-8天) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10ng/mL的SCF，10ng/mL的FLT-3L，5ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到個(gè)性化培養(yǎng)基3，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)；
第四階段(第9-15天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到個(gè)性化培養(yǎng)基4，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)，得到CTL細(xì)胞。
[0019]上述細(xì)胞培養(yǎng)置于37°C、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔I天通過臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)并檢測細(xì)胞免疫表型和活性。共培養(yǎng)15天后收獲細(xì)胞。細(xì)胞總數(shù)平均由培養(yǎng)前平均細(xì)胞數(shù)4.7 X IO7達(dá)到個(gè)性化培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)2.32 X 108，增殖率平均為493%。
[0020]實(shí)施例3:由臍血體外誘導(dǎo)培養(yǎng)CTL細(xì)胞
(I)足月正常分娩之臍血取自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科(產(chǎn)婦知情同意，并經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)同意)，用含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血袋收集，24h內(nèi)實(shí)驗(yàn)。輸血傳播傳染病檢測合格的臍帶血用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，待培養(yǎng)。
[0021 ] 第一階段(第I天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入100ng/mL的GM-CSF，100ng/mL的
Y-1FN, 50ng/mL 的 IL-15, 5ug/mL 的 PHA-P 和 500IU/mL 的 IL-4 得到個(gè)性化培養(yǎng)基 1，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)；
第二階段(第2-4天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入50ng/mL的SCF, 50ng/mL的FLT-3L，IOOng/mL的ant1-CD3, 100ng/mL的anti_CD28和2000IU/mL的IL-2到個(gè)性化培養(yǎng)基2，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)；
第三階段(第5-8天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入50ng/mL的SCF, 50ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的IL-15和2000IU/mL的IL-2到個(gè)性化培養(yǎng)基3，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)；
第四階段(第9-15天)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入50ng/mL的IL-15和2000IU/mL的IL-2到個(gè)性化培養(yǎng)基4，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL，進(jìn)行培養(yǎng)，得到CTL細(xì)胞。
[0022]上述細(xì)胞培養(yǎng)置于37°C、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔I天通過臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)并檢測細(xì)胞免疫表型和活性。共培養(yǎng)15天后收獲細(xì)胞。細(xì)胞總數(shù)平均由培養(yǎng)前平均細(xì)胞數(shù)4. 9 X 107達(dá)到個(gè)性化培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)6. 1 X 108，增殖率平均為1244%。
[0023]誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果鑒定 1.免疫表型鑒定
分別用PE標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體⑶3、⑶25，F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體⑶8、 CD56、CD4，分別以相應(yīng)PE-小鼠IgGl和FITC-小鼠IgGl、FITC_小鼠IgG2b作為同型對照 抗體，使用流式細(xì)胞儀對直接分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞和經(jīng)過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行 檢測。實(shí)施例1、2、3的檢測結(jié)果分別見圖2，圖3，圖4，其中A、D、G為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后 ⑶3⑶8表型變化圖；B、E、H為CTL細(xì)胞培養(yǎng)前后⑶4⑶25表型變化圖；C、F、I為CTL細(xì)胞 培養(yǎng)前后CD3CD56表型變化圖。
[0024]經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測顯示，直接分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞流式分型的結(jié)果95%以上均 為CD3-CD8-雙陰性，而在體外培養(yǎng)15d后，經(jīng)過實(shí)施例1體外誘導(dǎo)培養(yǎng)收獲的CTL細(xì)胞 CD3+CD8+細(xì)胞的比例高達(dá)82. 77%，CD4+CD25+細(xì)胞僅有1. 44%，同時(shí)還含有少量的CD3-CD56+ 細(xì)胞（0. 45%)。實(shí)施例2和實(shí)施例3體外誘導(dǎo)培養(yǎng)收獲的CTL細(xì)胞OT3+ra8+細(xì)胞的比例也 達(dá)到53. 34%和76. 35%。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果與培養(yǎng)成本，我們認(rèn)為實(shí)施例1為最優(yōu)。
[0025]2.細(xì)胞殺傷活性檢測（CCK-8法）
收集對數(shù)生長期K562細(xì)胞、Hela細(xì)胞為靶細(xì)胞，并調(diào)整密度為1 X 105個(gè)/mL。將經(jīng)過 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)收獲的CTL細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以直接分離的臍血MNC細(xì)胞作為對照組。根據(jù) 不同效靶比，調(diào)整CTL細(xì)胞密度為1 X 105/ml和1 X 106/mL兩組，分別按效靶比（1:1，10:1) 將CTL細(xì)胞與靶細(xì)胞（各lOOul)混合，同時(shí)設(shè)相應(yīng)的僅靶細(xì)胞對照孔，僅CTL細(xì)胞對照孔 和培養(yǎng)基空白對照孔，終體積均為200ul/孔，每組均設(shè)8個(gè)平行孔。37°C 5% C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，在培養(yǎng)的3h和6h分別取下一排孔，加入10ul CCK-8并混勻，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 小時(shí)后，測定每孔450nm波長處的0D值。
[0026]細(xì)胞毒活性的計(jì)算方法：求出8個(gè)平行孔的平 均值，按以下方法計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞毒活性，以殺傷率％表示： 細(xì)胞毒活性=1-(效靶細(xì)胞作用孔0￡)值-效應(yīng)細(xì)胞孔OD值卜靶細(xì)胞孔OD值xl 00%
比較不同效靶比、不同時(shí)間點(diǎn)下對照組細(xì)胞及CTL細(xì)胞對Hela細(xì)胞和HK562細(xì)胞的殺 傷活性，結(jié)果見圖5，CTL細(xì)胞殺傷活性檢測結(jié)果（CCK8法）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過培養(yǎng)的CTL 細(xì)胞比直接提取的臍血MNC細(xì)胞殺傷力顯著增高，而且效靶比越高、殺瘤時(shí)間越長，殺傷效 果就越好。直接提取的MNC細(xì)胞殺傷效果平均值為61. 88%，最低32. 45%，最高71. 96% ;培 養(yǎng)的CTL細(xì)胞殺傷效果均能達(dá)到80%以上，平均值為90. 33%，與對照組相比有顯著提高。
[0027]3、Real-time RT-PCR法檢測相關(guān)基因表達(dá)
取直接分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞和經(jīng)過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)收獲的CTL細(xì)胞，各1 X 106個(gè)細(xì) 胞。按Trizol試劑盒說明提取總RNA;進(jìn)行RT-PCR獲得cDNA,檢測顆粒酶（granzyme )A、顆粒酶 B、GM-CSF、顆粒溶素(Granulysin )、IFN-y、TGF-betal、TNF-a 和穿孔素 (perforin )基因的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參基因。采用SYBR Green Dye I法在PCR儀MX 3000P進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，以直接分離的臍血MNC細(xì)胞作為對照組并將其結(jié)果設(shè)為1，見圖 6。
[0028]結(jié)果顯示TNF- a、GM_CSF和IFN_ y等相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平水平均有不 同程度增加，與對照組相比較，其中IFN-y、TGF-betal上調(diào)較為明顯（P〈0. 05)，其余因子均大幅上調(diào)(P〈0.01)。[0029]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種MHC限制性殺傷T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟: (1)分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞； (2)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPM1-1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同的細(xì)胞因子在培養(yǎng)細(xì)胞的4個(gè)階段使用， 第一階段為第I天，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的Y-1FN, lO-lOOng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10-1000IU/mL 的 IL-4 進(jìn)行培養(yǎng)； 第二階段為第2天，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的SCF，lO-lOOng/mL的FLT-3L，lO-lOOng/mL 的 anti_CD3, lO-lOOng/mL 的 anti_CD28 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng); 第三階段為第5-8天，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的SCF, lO-lOOng/mL的FLT-3L, lO-lOOng/mL 的 IL-15 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng)； 第四階段為第9-15天，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的IL-15和100_1000IU/mL的IL-2進(jìn)行培養(yǎng)。
2.—種MHC限制性殺傷T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟: (1)分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞； (2)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPM1-1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同的細(xì)胞因子在培養(yǎng)細(xì)胞的4個(gè)階段使用， 第一階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-50ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的Y-1FN, 5-50ng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10_500IU/mL 的 IL-4 進(jìn)行培養(yǎng)； 第二階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 10-50ng/mL 的 SCF, 10-50ng/mL 的 FLT-3L，lO-lOOng/mL的 ant1-CD3, lO-lOOng/mL 的 anti_CD28 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng)； 第三階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-50ng/mL的SCF, 10-50ng/mL的FLT-3L，5_50ng/mL的 IL-15 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng)； 第四階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5-50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2進(jìn)行培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于 第一階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/mL的GM-CSF，50ng/mL的\ -1FN, 10ng/mL的IL-15, 2ug/mL 的 PHA-P 和 100IU/mL 的 IL-4 進(jìn)行培養(yǎng)； 第二階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的ant1-CD3, 50ng/mL 的 anti_CD28 和 1000IU/mL 的 IL-2 進(jìn)行培養(yǎng)； 第三階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2進(jìn)行培養(yǎng)； 第四階段在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2進(jìn)行培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于在每個(gè)階段中保持細(xì)胞密度為5 X IO6個(gè)/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)發(fā)生在37°C、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞的步驟包括:臍帶血用淋巴細(xì)胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞 。
【文檔編號】C12N5/0783GK103740643SQ201410026036
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】明奕, 張海燕, 李棟 申請人:山東省齊魯干細(xì)胞工程有限公司