一種nk細(xì)胞的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種NK細(xì)胞的制備方法，該方法利用聚肌胞可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的分化、成熟或者分泌細(xì)胞因子，如IL?12、IL?15、TNFa、IFN?r等，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化增殖的能力。利用聚肌胞還可以促進(jìn)膜結(jié)合型IL?15Ra表達(dá)的能力，IL?15Ra可與IL?15緊密結(jié)合，這種結(jié)合狀態(tài)的IL?15對(duì)NK細(xì)胞有更強(qiáng)烈的促活化和促增殖的效應(yīng)，將聚肌胞用于誘導(dǎo)培養(yǎng)NK細(xì)胞。本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞滿(mǎn)足了臨床應(yīng)用對(duì)細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活性的要求。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種NK細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種NK細(xì)胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自然殺傷細(xì)胞(NaturalKiller cell，NK)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體抗腫瘤、抗病毒等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞通過(guò)非特異性識(shí)別靶細(xì)胞，通過(guò)分泌顆粒酶、穿孔素、細(xì)胞因子等途徑殺傷靶細(xì)胞。同時(shí)NK細(xì)胞表達(dá)Fe yRIIIA，與抗體分子的Fe段結(jié)合，通過(guò)抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的特異性識(shí)別和殺傷。因此，NK細(xì)胞在腫瘤或者病毒性疾病的治療上有很大的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]直接從體內(nèi)分離出來(lái)的NK細(xì)胞往往面臨數(shù)量上和功能上的不足，需要在體外進(jìn)行大量的擴(kuò)增和活化才能回輸?shù)襟w內(nèi)去，達(dá)到治療的效果。NK細(xì)胞的擴(kuò)增和活化主要是通過(guò)以下幾個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)的:
[0004]1、ζ鏈活化途徑。NK細(xì)胞雖不表達(dá)TCR-⑶3復(fù)合物，但部分NK細(xì)胞表達(dá)ζ鏈。ζ鏈和NK表面的IgGFc受體Fe yRin(CD16)形成復(fù)合體。Ig分子和Fe YRin結(jié)合時(shí)，ζ鏈胞內(nèi)段上的ITAM即可發(fā)生酪氨酸磷酸化，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度和IP3水平升高，促進(jìn)細(xì)胞因子合成和ADCC效應(yīng)。外周血中的NK細(xì)胞幾乎均可通過(guò)此途徑活化。部分NK細(xì)胞表達(dá)⑶2分子，還有可能通過(guò)⑶2與⑶58相互作用可使ζ鏈發(fā)生酪氨酸磷酸化，使NK細(xì)胞活化。
[0005]2、IL-2R激活途徑。NK細(xì)胞表面表達(dá)IL-2Rf3y鏈，在IL-2的誘導(dǎo)下，NK細(xì)胞開(kāi)始大量表達(dá)IL_2Ra鏈，βγ鏈與α鏈的結(jié)合有利于形成高親和力IL-2受體，從而使NK細(xì)胞在IL-2的刺激下進(jìn)一步發(fā)生增殖。在IL 2刺激下NK細(xì)胞表達(dá)黏附分子，使NK胞質(zhì)中的顆粒增加并促進(jìn)絲氨酸酯酶mRNA的表達(dá)，從而提高NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
[0006]3、IL-18和11-12激活途徑。11^18和11^12共同作用，通過(guò)胞內(nèi)的11六1而達(dá)到促進(jìn)爾細(xì)胞活化的作用。
[0007]4、IL-15激活途徑。IL-15與IL-2有相似的結(jié)構(gòu)，對(duì)NK細(xì)胞的活化和增殖有促進(jìn)作用。
[0008]5、IL-21激活途徑。IL21分子結(jié)構(gòu)與IL-15相似，協(xié)同IL-15促進(jìn)NK細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞毒活性。
[0009]6、除了上述外加的細(xì)胞因子外，一些Tall樣受體(TLR)激動(dòng)劑如0K432、Poly(1:c)、LPS等作用于樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或NK細(xì)胞本身，誘導(dǎo)這些細(xì)胞的分化、成熟或者分泌細(xì)胞因子，如IL-12、IL-15、TNFa、IFN_r等，促進(jìn)NK細(xì)胞的活化增殖。PoIy (1: c)還可以促進(jìn)膜結(jié)合型IL-15Ra表達(dá)，IL-15Ra可與IL-15緊密結(jié)合，這種結(jié)合狀態(tài)的IL-15對(duì)NK細(xì)胞有更強(qiáng)烈的促活化和促增殖的效應(yīng)。
[0010]現(xiàn)有的NK細(xì)胞擴(kuò)增和活化培養(yǎng)體系誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)低、存活時(shí)間短、活性低，不能滿(mǎn)足臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011 ]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有NK細(xì)胞擴(kuò)增和活化培養(yǎng)體系誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)低、存活時(shí)間短、活性低，不能滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的問(wèn)題，提供了一種NK細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，該方法利用聚肌胞[Poly(1:C)]可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的分化、成熟或者分泌細(xì)胞因子，如IL-12、IL-15、TNFa、IFN-r等，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化增殖的能力。利用聚肌胞還可以促進(jìn)膜結(jié)合型IL-15Ra表達(dá)的能力，IL-15Ra可與IL-15緊密結(jié)合，這種結(jié)合狀態(tài)的IL-15對(duì)NK細(xì)胞有更強(qiáng)烈的促活化和促增殖的效應(yīng)，將聚肌胞用于誘導(dǎo)培養(yǎng)NK細(xì)胞。利用該方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞滿(mǎn)足了臨床應(yīng)用對(duì)細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活性的要求。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0013]步驟一，采集患者外周血，分離并收集外周血單個(gè)核細(xì)胞并用NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中，并加入2%熱滅活自體血漿；
[0014]步驟二:培養(yǎng)第I天加入0.l-lOOOyg/ml聚肌胞;培養(yǎng)第2天加入CD16單抗l-200ng/ml、10-5000IU/ml IL_2、0.1-lOOng/ml IL_18、0.1-lOOng/ml IL-15;第5天根據(jù)細(xì)胞增殖情況，調(diào)整細(xì)胞密度，加入2%熱滅活自體血漿、10-5000IU/ml IL_2、0.l-100ng/ml IL-18,0.1-lOOng/ml IL_15、0.01-100ng/ml IL-12；
[0015]步驟三:以后每2-3天補(bǔ)液一次，根據(jù)細(xì)胞增殖情況，調(diào)整細(xì)胞密度，加入2 %熱滅活自體血漿、10-5000IU/ml IL_2、0.l-100ng/ml IL_18、0.卜100ng/ml IL_15、0.01-lOOng/ml IL-12；
[0016]步驟四:培養(yǎng)至15-20天，回收細(xì)胞。
[0017]優(yōu)選的，步驟一至步驟三添加的聚肌胞的濃度為10yg/ml，CD16單抗的濃度為20ng/ml，IL-2 的濃度為 500IU/ml、IL-18 的濃度為 10ng/ml、IL-15 的濃度為 10ng/ml、IL-12的濃度為lng/ml。
[0018]優(yōu)選的，培養(yǎng)過(guò)程中調(diào)整細(xì)胞密度為IX 106/mlo
[0019]優(yōu)選的，利用本發(fā)明的技術(shù)方案培養(yǎng)的NK細(xì)胞用于惡性腫瘤的治療。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有有益效果為:本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞滿(mǎn)足了臨床應(yīng)用對(duì)細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活性的要求。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為實(shí)施例1-3與對(duì)比例1-3NK細(xì)胞第5-20天的增殖曲線的結(jié)果；
[0022]圖2為實(shí)施例1-3與對(duì)比例1-3得到的NK細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；
[0023]圖3為實(shí)施例1-3與對(duì)比例1-3得到的NK細(xì)胞比例的結(jié)果；
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些【具體實(shí)施方式】。
[0025]實(shí)施例1
[0026]步驟一:用ficolI淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，收集分離液上層血漿，56°C滅活30分鐘，離心后取上清得到熱滅活自體血漿；中間層單個(gè)核細(xì)胞用生理鹽水洗2次后得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。取PBMC用NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(購(gòu)自英普樂(lè)孚生物技術(shù)(上海)有限公司)調(diào)整細(xì)胞濃度為2X10%1，加入2%熱滅活自體血漿，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
[0027]步驟二:
[0028]培養(yǎng)第I天加入10yg/ml Poly(1:C) (Sigmaaldrich，P9582_50MG);
[0029]培養(yǎng)第2天加入20ng/mlCD16單抗(eb1science，16-0167-85)、500IU/ml IL-2、10ng/mlIL_18(R&D systems,B001-5)、lOng/ml IL_15(R&D systems，247_ILB_025);
[0030]培養(yǎng)第5天根據(jù)細(xì)胞增殖情況，用含2%自體血漿NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為lX106/mUpA500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL-15； lng/ml IL_12(R&Dsystems，219-1L-025)
[0031]步驟三:每2-3天補(bǔ)液一次，根據(jù)細(xì)胞增殖情況，用含2%自體血漿NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為lX106/mUpA500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL_15、lng/ml IL-12；
[0032]步驟四:細(xì)胞培養(yǎng)至15-20天，收集細(xì)胞，生理鹽水洗2次，用于回輸患者體內(nèi)或者凍存。
[0033]實(shí)施例2?3
[0034]NK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的操作過(guò)程同實(shí)施例1的，不同之處在于:Poly(1:C)、CD16單抗、IL-2、IL-18、IL-15、IL-12 的濃度不同。
[0035]實(shí)施例2:Poly(1:C)的濃度為0.lyg/ml、CD16單抗的濃度為1.0ng/ml、IL-2的濃度為 10IU/ml、IL-18的濃度為0.lng/ml、IL-15的濃度為0.lng/ml、IL-12的濃度為0.01ng/ml。
[0036]實(shí)施例3:Poly(1:C)的濃度為1000yg/ml、CD16單抗的濃度為200ng/ml、IL-2的濃度為 5000IU/ml、IL-18 的濃度為 100ng/ml、IL-15 的濃度為 100ng/ml、IL-12 的濃度為 10ng/ml ο
[0037]對(duì)比例I
[0038]步驟一:用ficolI淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，收集分離液上層血漿，56°C滅活30分鐘，離心后取上清得到熱滅活自體血漿；中間層單個(gè)核細(xì)胞用生理鹽水洗2次后得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。取PBMC用NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(購(gòu)自英普樂(lè)孚生物技術(shù)(上海)有限公司)調(diào)整細(xì)胞濃度為2X10%1，加入2%熱滅活自體血漿，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
[0039]步驟二:
[0040]培養(yǎng)第I天加入20ng/mlCD16單抗(eb1science，16-0167-85)、500IU/ml IL-2、10ng/mlIL_18(R&D systems,B001-5)、10ng/ml IL_15(R&D systems，247_ILB_025);
[0041 ]培養(yǎng)第5天根據(jù)細(xì)胞增殖情況，用含2%自體血漿NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為lX106/mUpA500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL-15； lng/ml IL_12(R&Dsystems，219-1L-025)
[0042]步驟三:每2-3天補(bǔ)液一次，根據(jù)細(xì)胞增殖情況，用含2%自體血漿NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為lX106/mUpA500IU/ml IL-2、10ng/mlIL-18、10ng/ml IL_15、lng/ml IL-12；
[0043]步驟四:細(xì)胞培養(yǎng)至15-20天，收集細(xì)胞，生理鹽水洗2次，用于回輸患者體內(nèi)或者凍存。
[0044]對(duì)比例2
[0045]按照專(zhuān)利一種外周血NK細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)方法，專(zhuān)利號(hào):201610242598.4公開(kāi)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)NK細(xì)胞。
[0046]對(duì)比例3
[0047]按照專(zhuān)利US30030068306A1公開(kāi)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)NK細(xì)胞。
[0048]增殖實(shí)驗(yàn)
[0049]分別對(duì)實(shí)施例1-3和對(duì)比例1-3培養(yǎng)第5天、10天、15天、20天的細(xì)胞采樣計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0050]結(jié)論:本發(fā)明實(shí)施例1的NK細(xì)胞培養(yǎng)方法誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖倍數(shù)比對(duì)比例更高，增殖速度更快。
[0051 ] 殺瘤對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0052]將上述細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)第15天的淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以K562細(xì)胞為靶細(xì)胞。
[0053]首先配制效應(yīng)細(xì)胞溶液:取培養(yǎng)至15天的NK細(xì)胞，用含2%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基洗2次，用含2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基配成lxl06/ml細(xì)胞懸液。靶細(xì)胞K562細(xì)胞用2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基洗一次，用含2%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基配成Ix1Vml細(xì)胞懸液。按效靶比10:1接種到96孔板內(nèi)，同時(shí)設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞孔和靶細(xì)胞孔，按每種培養(yǎng)基3個(gè)復(fù)孔，37度5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)。用MTT法測(cè)吸光度值，計(jì)算殺瘤率。結(jié)果見(jiàn)圖2
[0054]殺瘤率％ = 1-(試驗(yàn)孔-效應(yīng)細(xì)胞孔)/靶細(xì)胞孔。
[0055]結(jié)論:本發(fā)明實(shí)施例1培養(yǎng)的NK細(xì)胞殺傷活性高于對(duì)比例各組。
[0056]流式表型對(duì)比
[0057]取實(shí)施例1-3，對(duì)比例1-3培養(yǎng)至第20天的細(xì)胞，每個(gè)實(shí)施例的細(xì)胞分成3管，每管細(xì)胞數(shù)I X 106。按NK細(xì)胞檢測(cè)試劑盒操作(BD b1science，貨號(hào)340300)用I3BS溶液洗2次。加入300ulPBS溶液重懸細(xì)胞，第一管作為空白對(duì)照，另外兩管按說(shuō)明書(shū)分別加入流式熒光抗體。避光4度孵育20分鐘。孵育完后，每管加入ImlPBS溶液，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清，重復(fù)清洗一次。加入500ulPBS溶液重懸細(xì)胞，上機(jī)分析，得到NK細(xì)胞百分比，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0058]結(jié)論:本發(fā)明實(shí)施例1所培養(yǎng)的細(xì)胞NK細(xì)胞比例高于對(duì)比例各組。
[0059]應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施方式中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。
[0060]上文所列出的一系列的詳細(xì)說(shuō)明僅僅是針對(duì)本發(fā)明的可行性實(shí)施方式的具體說(shuō)明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種NK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括下述步驟: 步驟一，采集患者外周血，分離并收集外周血單個(gè)核細(xì)胞并用NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中，并加入2%熱滅活自體血漿； 步驟二: 培養(yǎng)第I天加入聚肌胞； 培養(yǎng)第2天加入CD16單抗、IL-2、IL-18、IL-15; 第5天根據(jù)細(xì)胞增殖情況，調(diào)整細(xì)胞密度，加入IL-2、IL-18、IL-15、IL-12和2 %熱滅活自體血漿； 步驟三:以后每2-3天補(bǔ)液一次，根據(jù)細(xì)胞增殖情況，調(diào)整細(xì)胞密度，IL-2、IL-18、IL-15 、IL-12和2% 熱滅活自體血漿； 步驟四:培養(yǎng)至15-20天，回收細(xì)胞。2.如權(quán)利要求1所述的一種NK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)過(guò)程中添加的聚肌胞的濃度為0.l-1000yg/ml，CD16單抗的濃度為l-200ng/ml，IL-2的濃度為 10_5000IU/ml、IL-18的濃度為0.l-100ng/ml、IL-15的濃度為0.l-100ng/ml、IL-12的濃度為0.01-100ng/ml。3.如權(quán)利要求2所述的一種NK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)過(guò)程中調(diào)整細(xì)胞密度為I XlOfVml ο4.如權(quán)利要求3所述的一種NK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，利用本發(fā)明的技術(shù)方案培養(yǎng)的NK細(xì)胞用于惡性腫瘤的治療。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK106085958SQ201610633811
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月4日 公開(kāi)號(hào)201610633811.4, CN 106085958 A, CN 106085958A, CN 201610633811, CN-A-106085958, CN106085958 A, CN106085958A, CN201610633811, CN201610633811.4
【發(fā)明人】武寧, 謝志明
【申請(qǐng)人】英普樂(lè)孚生物技術(shù)(上海)有限公司