專(zhuān)利名稱(chēng)：自然殺傷性t細(xì)胞在角膜移植中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地涉及自然殺傷性T細(xì)胞(NKT)用于治療角膜移植免疫排斥反應(yīng)的用途。
背景技術(shù)：
角膜盲目前仍是我國(guó)主要的致盲眼病之一，對(duì)于其中絕大多數(shù)患者，穿透性角膜移植是唯一有效的復(fù)明手段。由于角膜本身沒(méi)有血管，加之存在前房相關(guān)免疫偏離(Anterior Chamber Associated ImmuneDeviation，ACAID)，使角膜處于相對(duì)免疫赦免狀態(tài)，因此在圓錐角膜、大泡性角膜病變、角膜營(yíng)養(yǎng)不良等植床上進(jìn)行的穿透性角膜移植，術(shù)后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率低，約為10％。而對(duì)于角膜新生血管化、粘連性角膜白斑、二次或多次角膜移植、角膜化學(xué)燒傷、單純皰疹病毒感染等情況下，角膜和前房的屏障功能被破壞，術(shù)后排斥率高達(dá)65％，稱(chēng)為高危角膜移植，是嚴(yán)重影響手術(shù)成功的關(guān)鍵因素，是臨床治療的棘手問(wèn)題。而在我國(guó)，約有超過(guò)200萬(wàn)例角膜盲患者需要進(jìn)行角膜移植，其中有相當(dāng)多的屬于高危角膜移植范疇。例如，北京同仁醫(yī)院眼科(1992年-2001年)進(jìn)行的1789例穿透性角膜移植患者中，有35.2％的患者屬于高危角膜移植患者(high-risk keratoplasty patients)范疇，其中包括角膜新生血管化、粘連性角膜白斑、角膜移植術(shù)后植片混濁、角膜化學(xué)燒傷、年幼患者、眼前節(jié)手術(shù)、聯(lián)合玻璃體切除術(shù)、單純皰病毒感染等。因此，在我國(guó)供體材料十分匱乏的情況下，大量等待手術(shù)復(fù)明的高危角膜移植患者和術(shù)后高排斥率之間的矛盾表現(xiàn)更加突出，需要有更加有效的抗排斥反應(yīng)的藥物來(lái)控制。免疫抑制劑主要用于器官移植和一些具有T細(xì)胞亢進(jìn)的自身免疫病的患者如依賴(lài)性糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、丙型肝炎等，以防止移植后器官被機(jī)體排斥和緩解自身免疫病。到目前為止，接受過(guò)器官移植的患者通常需要終身使用免疫抑制劑，而長(zhǎng)期用藥會(huì)帶來(lái)對(duì)免疫系統(tǒng)抗感染和抗腫瘤作用的損傷。
目前，角膜移植免疫排斥反應(yīng)的治療主要依靠術(shù)后使用免疫抑制劑，糖皮質(zhì)激素是臨床上廣泛應(yīng)用的藥物，雖然價(jià)格相對(duì)低廉，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)引起青光眼、白內(nèi)障等更加嚴(yán)重的后果；新型免疫抑制劑的研究已經(jīng)將CsA、FK506等推向臨床，但長(zhǎng)期應(yīng)用除費(fèi)用昂貴外，所引起的肝腎損傷、感染以及腫瘤等副作用仍是不容忽視的問(wèn)題。因此，尋找有效、應(yīng)用方便、副作用小的免疫治療方法仍是亟待解決的問(wèn)題。
在器官移植中，移植物要在受體中長(zhǎng)期存活，最終需要達(dá)到免疫耐受狀態(tài)。多種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞在其中發(fā)揮重要作用，目前自然殺傷性T細(xì)胞(nature killer T cell，NKT)的功能已引起人們的極大關(guān)注。NKT細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的第四類(lèi)淋巴細(xì)胞，與T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞具有不同的細(xì)胞表型和功能，其最顯著的特征是同時(shí)表達(dá)T細(xì)胞表面受體(TCR)和NK細(xì)胞表面標(biāo)志。NKT細(xì)胞的另一重要特征是CD1限制性。CD1是與MHC-I類(lèi)分子結(jié)構(gòu)相似，而抗原提呈功能卻類(lèi)似MHC-II類(lèi)分子的第三類(lèi)抗原提呈分子，NKT細(xì)胞只識(shí)別由CD1d分子遞呈的脂類(lèi)抗原，人工合成的α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(α-galactosylceramide，α-GalCer)及其類(lèi)似物OCH等能以CD1d限制的和TCR介導(dǎo)的方式激活NKT細(xì)胞。
NKT細(xì)胞可以在肝臟、脾臟以及外周血中檢測(cè)到，但在不同部位分布極不均衡。目前對(duì)人類(lèi)NKT細(xì)胞的研究大部分局限于外周血，Kadowaki等已經(jīng)從臍帶血和成年人血中成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出NKT細(xì)胞。
NKT細(xì)胞具有多種生物學(xué)功能，既產(chǎn)生Th1型的細(xì)胞因子如IL-2和IFN-γ，也產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子如IL-4和IL-10，還可產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如穿孔素，顆粒酶等。因此，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，NKT細(xì)胞是具有雙重作用的細(xì)胞，其調(diào)節(jié)作用主要依賴(lài)于它在免疫起始階段所接受的刺激。
然而，在本申請(qǐng)之前，還沒(méi)有將NKT細(xì)胞直接用于治療角膜移植免疫排斥反應(yīng)。發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，將NKT細(xì)胞用于治療角膜移植免疫排斥反應(yīng)，可明顯延長(zhǎng)角膜植片的存活時(shí)間，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供自然殺傷性T細(xì)胞(NKT)在制備治療哺乳動(dòng)物器官移植免疫排斥反應(yīng)藥物中的用途，其中，所述的器官移植包括角膜移植、心臟移植、腎移植、胰島移植、皮膚移植等，優(yōu)選地是角膜移植，更優(yōu)選地是高危角膜移植；其中，該抗排斥反應(yīng)藥物可用于哺乳動(dòng)物，其中哺乳動(dòng)物選自人、猴、狗、貓、大鼠、小鼠等，更優(yōu)選地，所述的哺乳動(dòng)物是人。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供含有NKT細(xì)胞的藥物組合物，其含有有效量的NKT細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體，例如緩沖液、培養(yǎng)液、防腐劑等。NKT細(xì)胞可從哺乳動(dòng)物的脾臟、肝臟、外周血中分離，并經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得，或者從臍帶血和外周血中分離并經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增獲得。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的藥物組合物適用于各種給藥方式，例如靜脈內(nèi)給藥、結(jié)膜下給藥等。若有特殊治療要求，本發(fā)明的藥物組合物還可包含其他活性藥理成分，例如抗生素等，這種相伴使用有利于治療。
在本發(fā)明的藥物組合物中。NKT細(xì)胞的用量可以在一個(gè)較大范圍內(nèi)變動(dòng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)一些已知的因素，諸如病人體重、年齡、給藥途徑等很容易地加以確定。
與其它免疫抑制劑相比，本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)點(diǎn)是具有有效、應(yīng)用次數(shù)少，副作用小的特點(diǎn)，從而減少了長(zhǎng)期用藥的副作用，長(zhǎng)期應(yīng)用不會(huì)引起青光眼、白內(nèi)障等更加嚴(yán)重的后果，不會(huì)引起的肝腎損傷、感染以及腫瘤等副作用；另外NKT細(xì)胞存在于多種器官和組織中，如可在肝臟、脾臟、外周血中檢測(cè)到，可便于分離獲得，并且也可從臍帶血和血液中誘導(dǎo)培養(yǎng)出NKT細(xì)胞，為臨床治療高危角膜移植提供了新的方法。


圖1、體外培養(yǎng)3周后的大鼠脾臟淋巴細(xì)胞(濃度1×106/ml)。
圖2、流式細(xì)胞儀分選NKT細(xì)胞亞群的結(jié)果。圖2A淋巴細(xì)胞群(濃度1×106/ml)；圖2BNKT細(xì)胞群(濃度5×105/ml)。
圖3、術(shù)后第10天角膜植片外眼像。圖3A對(duì)照組角膜植片混濁，發(fā)生免疫排斥反應(yīng)圖；3B試驗(yàn)組角膜植片清亮，沒(méi)有發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。
圖4、術(shù)后第10天角膜植片組織病理學(xué)檢查(×200)的結(jié)果。圖4A對(duì)照組角膜植片水腫增厚，大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)；圖4B試驗(yàn)組角膜植片輕水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1NKT細(xì)胞的制備在無(wú)菌條件下，將2只Lewis純系大鼠(雌性，8～10周齡，體重160～200克，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所)的脾臟取出，置于含有10ml RPMI-1640培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌玻璃棒研磨，使脾臟破裂，并用250目無(wú)菌不銹鋼網(wǎng)(購(gòu)自河北鉆石金屬網(wǎng)業(yè)有限公司)過(guò)濾，使淋巴細(xì)胞通過(guò)并形成細(xì)胞懸液。將該懸液通過(guò)25號(hào)的細(xì)注射器針頭形成單細(xì)胞懸液。按照每只脾臟加入2ml 8.7g/L NH4Cl的方法，分別加入經(jīng)高壓滅菌的紅細(xì)胞裂解液(139.6mmol/L NH4Cl、16.96mmol/L Tris，用1mol/L HCl調(diào)pH至7.2)裂解紅細(xì)胞。室溫下作用5分鐘后，加入經(jīng)高壓滅菌的GNK緩沖液(8g/L NaCl、0.4g/L KCl、1.77g/L Na2HPO4.2H2O、0.6g/LNaH2PO4.H2O、0.2g/L葡萄糖、0.01g/L酚紅)終止紅細(xì)胞裂解。1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘后，去除上清液，用RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞反復(fù)洗2次，然后將脾臟淋巴細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(每孔加入100μL濃度為1×105/mL的大鼠脾臟淋巴細(xì)胞)，于RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每孔加入10μL IL-7(50ng/mL)和10μL IL-15(50ng/mL)(美國(guó)RnD公司)后在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，刺激其增殖活化。3周后，獲得1×106/mL濃度的淋巴細(xì)胞(圖1)。在培養(yǎng)液中加入抗大鼠NK單克隆熒光抗體(R-PE標(biāo)記的抗大鼠CD161抗體)和抗大鼠TCRα單克隆抗體(FITC標(biāo)記的抗大鼠TCR-α抗體)(上述兩種抗體均購(gòu)自美國(guó)RnD公司)，4℃孵育30分鐘后，用磷酸鹽緩沖液—牛血清白蛋白溶液(北京中山生物試劑公司)洗滌2次，去除多余抗體，使用FACSVantage流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)分選出TCR-α+/CD161+雙陽(yáng)性細(xì)胞，即所要的NKT細(xì)胞。經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分選后，獲得濃度為5×105/mL的TCR-α+/CD161+雙陽(yáng)性NKT細(xì)胞(圖2A，B)實(shí)施例2用NKT細(xì)胞治療大鼠角膜移植排斥反應(yīng)(1)建立大鼠正位穿透性角膜移植的模型參照Williams KA，Coster DJ.Penetrating corneatransplantation in the inbred rata new model.Invest ophthalmolVis Sci，1985；26(1)23-30，制備大鼠正位穿透性角膜移植模型8只Fisher344純系大鼠作為供體，16只Lewis純系大鼠作為受體。供體和受體均為雌性，8～10周齡，160～200克。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所(中國(guó)北京)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置遵照ARVO聲明中有關(guān)眼科和視覺(jué)科學(xué)研究中動(dòng)物使用的規(guī)定。
受體術(shù)眼術(shù)前15分鐘以1％阿托品滴眼液和復(fù)方托品酰胺滴眼液充分散瞳，每只大鼠肌肉注射30mg鹽酸氯胺酮和1mg地西泮進(jìn)行麻醉。手術(shù)在顯微鏡下進(jìn)行，常規(guī)無(wú)菌操作。首先以3.0mm環(huán)鉆在供體角膜中央劃痕，用寶石前房穿刺刀切穿角膜全層后，用角膜剪沿劃痕剪下供體角膜植片，置于Optisol液(購(gòu)自北京同仁眼庫(kù))中備用。于受體右眼行穿透性角膜移植，用直徑2.5mm的環(huán)鉆鉆取中央?yún)^(qū)角膜，方法同前，將植片置于植床，以10-0尼龍線(xiàn)間斷縫合8針，線(xiàn)結(jié)暴露不埋藏。前房?jī)?nèi)注入小氣泡，恢復(fù)前房。術(shù)畢散瞳，結(jié)膜下注射硫酸妥布霉素2000U，結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏后瞼緣縫合。24小時(shí)后剪開(kāi)眼瞼縫線(xiàn)用藥。手術(shù)后出現(xiàn)并發(fā)癥者(如前房出血，感染，虹膜前粘連，或前房消失)，不計(jì)入統(tǒng)計(jì)之列。所有動(dòng)物術(shù)后均每日用0.25％氯霉素及復(fù)方托品酰胺滴眼液點(diǎn)眼，2次/日，共一周。角膜植片縫線(xiàn)在整個(gè)觀(guān)察期內(nèi)保留，不去除。
(2)分組與治療受體大鼠被隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，每組8只大鼠。治療組每只大鼠在角膜移植手術(shù)結(jié)束時(shí)結(jié)膜下注射0.1ml濃度為5×105/ml NKT細(xì)胞，對(duì)照組用同樣的方法結(jié)膜下注射0.1ml生理鹽水。
(3)角膜植片排斥反應(yīng)的觀(guān)察術(shù)后每日在裂隙燈顯微鏡下觀(guān)察角膜植片情況直到排斥反應(yīng)發(fā)生，之后隔日觀(guān)察。根據(jù)植片的混濁情況對(duì)植片進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下(參照Holland EJ，Chan CC，Wetzig RP，et al.Clinical andimmuno-histologic studies of corneal rejection in the ratpenetrating keratoplasty model.Cornea，1991，10(5)374-380.)0植片清亮，無(wú)混濁；
1植片輕度淺層非基質(zhì)層混濁，虹膜紋理清晰可見(jiàn)；2植片輕度深基質(zhì)層混濁，虹膜紋理模糊可見(jiàn)；3植片中度基質(zhì)層混濁，虹膜紋理看不清；4植片重度基質(zhì)混濁，只可見(jiàn)瞳孔；5植片完全混濁，前房看不入；評(píng)分在2分或以上者被判定為發(fā)生了免疫排斥反應(yīng)。
(4)角膜植片組織病理學(xué)染色檢查角膜移植后第10天，每組處死3只大鼠，取其眼球，固定在10％的福爾馬林溶液中，石蠟包埋后切片，每張切片5μm厚。染色時(shí)將石蠟切片在二甲苯中脫蠟5-10分鐘后換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。之后依次放入無(wú)水乙醇5分鐘，90％乙醇2分鐘，70％乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。然后將切片放入蘇木素染色液(北京中山生物試劑公司)中作用5-10分鐘后，浸入自來(lái)水中沖洗去多余的染色液，約10分鐘。用蒸餾水再洗滌5秒鐘后，放入95％乙醇中5秒，之后放入伊紅染色液(北京中山生物試劑公司)中染色30秒后，用95％乙醇脫水2分鐘，換用新鮮的95％乙醇再脫水2分鐘，二甲苯透明5分鐘，換用新鮮的二甲苯，再透明5分鐘。用中性樹(shù)膠封片后在顯微鏡下觀(guān)察。
(5)結(jié)果見(jiàn)表1不同組別之間角膜植片的存活時(shí)間采用單因素方差分析進(jìn)行比較。
表1.植片存活時(shí)間的比較

接受供體角膜植片的所有受體均符合觀(guān)察條件。除了每組3只大鼠用于取材外，其余每組5只大鼠均完成了整個(gè)觀(guān)察。對(duì)照組角膜植片平均存活時(shí)間為8.00±1.58天，而NKT細(xì)胞治療組植片平均存活時(shí)間為26.00±1.34天，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組(表1)。
角膜移植術(shù)后第10天，對(duì)照組所有植片均發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，表現(xiàn)為植片重度混濁水腫，新生血管長(zhǎng)入角膜植片。而在NKT細(xì)胞治療組，所有植片均未發(fā)生排斥反應(yīng)，植片清亮，虹膜新生血管清晰可見(jiàn)(圖3A、B)。
組織病理學(xué)檢查也證明對(duì)照組所有植片均發(fā)生排斥反應(yīng)，角膜植片明顯水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，新生血管長(zhǎng)入；而在NKT細(xì)胞治療組，所有角膜植片均未發(fā)生排斥反應(yīng)，僅僅前部基質(zhì)輕度水腫，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞，未見(jiàn)新生血管長(zhǎng)入(圖4A、B)。
由上述結(jié)果可知NKT細(xì)胞結(jié)膜下注射，明顯延長(zhǎng)了大鼠角膜植片的存活時(shí)間，可治療高危角膜移植免疫排斥反應(yīng)。
通過(guò)上述具體的實(shí)施例，更容易理解本發(fā)明。上述實(shí)施例只是舉例描述，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.自然殺傷性T細(xì)胞在制備治療哺乳動(dòng)物器官移植免疫排斥反應(yīng)藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述的器官移植是角膜移植。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述的角膜移植是高危角膜移植。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的用途，其中所述的哺乳動(dòng)物是人。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了自然殺傷性T(nature killer T cell，NKT)細(xì)胞在制備治療哺乳動(dòng)物器官移植免疫排斥反應(yīng)藥物中的用途，其中器官移植包括角膜移植、心臟移植、腎移植、胰島移植、皮膚移植等，優(yōu)選地是角膜移植，更優(yōu)選地是高危角膜移植；其中該藥物可用于哺乳動(dòng)物，其中哺乳動(dòng)物選自人、猴、狗、貓、大鼠、小鼠等，更優(yōu)選地哺乳動(dòng)物是人。與其它免疫抑制劑相比，本發(fā)明的藥物具有應(yīng)用次數(shù)少，局部使用副作用小、療效確切等特點(diǎn)，從而減少了長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素引起青光眼、白內(nèi)障、肝腎損傷、感染以及腫瘤等副作用，而且該藥物容易獲得，使用方便，為臨床治療高危角膜移植提供了新的方法。
文檔編號(hào)A61P37/06GK101028285SQ20071000102
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日
發(fā)明者潘志強(qiáng), 接英 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院, 北京市眼科研究所