專利名稱：擴增自然殺傷t細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用以擴增人Vα24+自然殺傷T(NKT)細胞的方法，以及由本方法獲得的人Vα24+NKT細胞和一種包含人Vα24+NKT細胞地組分的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
NKT細胞是成熟淋巴細胞中的一種獨特亞群，其兼有NK細胞受體和T細胞受體(Annu.Rev.Immunol.，15，535-562，1997；J.Exp.Med.，182，633-638，1995)。鼠NKT細胞表達NK1.1和TCRαβ受體，并且在骨髓(J.Immunol.，145，3209-3215，1990)和肝臟(J.Exp.Med.，180，699-704，1994)中尤為密集。這種細胞表達的TCR所有組成成分非常有限(J.Exp.Med.，180，1097-1106，1994；Int.Immunol.，7，1157-1161，1995)，其中包括一種恒定的α鏈。這些結(jié)果暗示NKT細胞的配體是非多態(tài)的和非經(jīng)典的MHC I類分子，這類分子表現(xiàn)出一種獨特的經(jīng)過TAP(抗原呈遞相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白)-非依賴性途徑的特異性抗原呈遞過程。最近的研究確定，一種MHC Ib類分子CD1d是NKT細胞的配體。新近報道，表達發(fā)生不包括N區(qū)的規(guī)范重排的恒定Vα24 JαQ TCR的人類T細胞與鼠Vα14-Jα281+ NKT細胞類似(J.Exp.Med.，180，1097-1106，1994)。此外，研究顯示，在用α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α-GalCer)預(yù)處理的CD1d抗原呈遞細胞(APCs)的刺激作用下，鼠Vα14-Jα281+細胞和人Vα24 JαQ TCR+NKT細胞可發(fā)生增殖。據(jù)報道，活化的NKT細胞表現(xiàn)出一種對多種腫瘤細胞系的穿孔素依賴性NK-樣細胞毒性(Cancer Res.，59，5102-5105，1999)，以及抑制某些實驗動物模型中的腫瘤轉(zhuǎn)移(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，95，5690-5693，1998)。
十九世紀八十年代，開展了大量的免疫療法臨床試驗，包括在注射或不注射細胞因子的條件下，所進行的LAK(淋巴因子動員性殺傷)細胞療法和TIL(腫瘤浸潤性淋巴細胞)療法試驗。然而，在臨床效果方面，這些臨床試驗的結(jié)果顯示這些細胞療法缺乏前景，因為沒有發(fā)現(xiàn)明顯的臨床療效。十九世紀九十年代，在鑒定人類癌癥免疫應(yīng)答的分子成分方面取得了重要進步。目前，一些不同的免疫療法正被用于臨床試驗，如樹突狀細胞(DC)療法和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)療法。
如上所述，與T細胞、B細胞和NK細胞等其他淋巴樣細胞不同，NKT細胞的特征在于其共表達NK受體和一種恒定的T細胞受體。已知這種新的淋巴細胞系能產(chǎn)生大量的白細胞介素4(IL-4)和γ干擾素(IFN-γ)，并且表現(xiàn)出強的殺腫瘤活性。因此，NKT細胞的這種功能對癌癥的免疫療法非常重要，并且利用這些細胞的能力期望代表一種新的免疫療法。已開展了一些先體外后體內(nèi)擴增Vα24+NKT細胞的研究(Cancer Res.，59，5102-5105，1999；Immunology，99，229-234，2000)。然而，甚至從臍帶血中也很難獲得足夠量的這種細胞以實現(xiàn)免疫治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方法，用以產(chǎn)生足夠量的Vα24+NKT細胞。本發(fā)明的另一個目的是提供Vα24+NKT細胞和適用于細胞療法的包含Vα24+NKT細胞的細胞組分，其中的細胞療法是指一種通過使用細胞來治療疾病的方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種方法，該方法通過使用α-糖基神經(jīng)酰胺，用以從一種單核細胞組分中獲得足夠量的Vα24+NKT細胞，該單核細胞組分可從外周血中獲得，該外周血中的造血干細胞由粒細胞集落刺激因子(G-CSF)所動員(G-PBSCs)。
該單核細胞組分包括DCs和T細胞、單核細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞、粒細胞等。當α-糖基神經(jīng)酰胺作用于該組分時，α-糖基神經(jīng)酰胺被呈遞到DC的CD1d分子上，并且由于細胞因子的分泌，使得Vα24+NKT細胞、NK細胞等發(fā)生增殖。當單核細胞組分是從外周血中獲得，該外周血中的造血干細胞由G-CSF所動員時，NKT細胞會發(fā)生更為有效的增殖，并且單核細胞組分會引起更強的免疫應(yīng)答。此外，與從沒有G-CSF動員的外周血中獲得的單核細胞組分(PBMCs)比較，在IL-2和α-糖基神經(jīng)酰胺存在條件下，通過培養(yǎng)可以從造血干細胞由G-CSF所動員的外周血中獲得的單核細胞組分(G-PBSCs)，所促成的NKT細胞的擴增更為持久。
本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)而得以完成，并且提供一些擴增方法和產(chǎn)生方法(包括利用這些方法所獲得的細胞和細胞組分)，以及用于治療癌癥試劑，如下所述
(1)一種用以擴增人Vα24+NKT細胞的方法，該方法包括在一種影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺存在的條件下，培養(yǎng)可以從人外周血中獲得的單核細胞組分(G-PBSCs)，該外周血中的造血干細胞由G-CSF所動員。
(2)一種根據(jù)(1)的方法，其中影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子包括IL-2。
(3)一種用以產(chǎn)生人Vα24+NKT細胞的方法，該方法包括在一種影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺存在的條件下，培養(yǎng)可以從人外周血中獲得的單核細胞組分(G-PBSCs)，該外周血中的造血干細胞由G-CSF所動員，以及從培養(yǎng)細胞中分離人Vα24+自然殺傷T細胞。
(4)一種根據(jù)(3)的方法，其中影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子包括IL-2。
(5)一種用以產(chǎn)生一種包含人Vα24+NKT細胞的細胞組分的方法，該方法包括在一種影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺存在的條件下，培養(yǎng)可以從人外周血中獲得的單核細胞組分(G-PBSCs)，該外周血中的造血干細胞由G-CSF所動員。
(6)一種根據(jù)(5)的方法，該方法進一步包括在腫瘤抗原存在的條件下，培養(yǎng)那些通過在IL-2和α-糖基神經(jīng)酰胺存在的條件下培養(yǎng)而獲得的細胞。
(7)一種根據(jù)(5)或(6)的方法，其中影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子包括IL-2。
(8)一種用于治療癌癥的試劑，該試劑含有作為一種活性成分的由(3)或(4)中定義的方法所獲得的人Vα24+自然殺傷T細胞。
(9) 一種用于治療癌癥的試劑，該試劑含有作為一種活性成分的由(5)-(7)中任一項定義的方法所獲得的含有人Vα24+自然殺傷T細胞的一種細胞組分。
此外，本發(fā)明還提供一種治療癌癥的方法，包括將有效量的人Vα24+NKT細胞或包含人Vα24+NKT細胞的細胞組分給藥于需要癌癥治療的患者，其中的人Vα24+NKT細胞是由(3)或(4)中定義的方法獲得的，而包含人Vα24+NKT細胞的細胞組分則是由(5)至(7)中定義的任一方法獲得的。此外，本發(fā)明提供由(3)或(4)中定義的方法所獲得的人Vα24+NKT細胞或由(5)至(7)中定義的任一方法所獲得的包含人Vα24+NKT細胞的細胞組分在制造用于癌癥治療的試劑中的用途。
附圖簡述


圖1顯示來自PBMCs和G-PBSCs的反應(yīng)于IL-2和α-GalCer所擴增得到的Vα24+NKT細胞的典型流式細胞術(shù)概圖。左圖培養(yǎng)后，中圖有α-GalCer，右圖無α-GalCer。
圖2顯示當在存在α-GalCer和100U/ml IL-2的條件下培養(yǎng)PBMCs或G-PBSCs12天時，培養(yǎng)前和培養(yǎng)后Vα24+NKT細胞的數(shù)量。
圖3顯示α-GalCer活化的Vα24+NKT細胞的FACS圖。在存在α-GalCer和100U/ml的IL-2的條件下培養(yǎng)PBMCs或G-PBSCs12天，并且分析了培養(yǎng)細胞的表型。
圖4顯示α-GalCer活化的Vα24+NKT細胞的抗腫瘤細胞毒活性。利用51Cr釋放測定法來檢測對Molt-4T淋巴瘤(1×104；左圖)和K562髓細胞性白血病(1×104；右圖)的細胞毒性。
圖5顯示來自PBMCs和G-PBSCs的反應(yīng)于IL-2和α-GalCer所擴增得到的Vα24+NKT細胞的數(shù)量的逐日變化。
實施本發(fā)明的最佳方式
以下將詳細描述本發(fā)明。
本發(fā)明所述的擴增方法和產(chǎn)生方法的特征在于在一種影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺存在的條件下，培養(yǎng)可以從人外周血中獲得的單核細胞組分(G-PBSCs)，該外周血中的造血干細胞由G-CSF所動員。
制備G-PBSCs的方法，例如，采用以下方法。
當將G-CSF以2-16μg/kg/日的劑量經(jīng)皮下給藥于癌癥患者5-10天時，作為造血干細胞指數(shù)的CD34+細胞的數(shù)量和粒細胞-巨噬細胞集落形成單位(CFU-GM)就會增加，并且大約從第5-6天起，它們都顯示出最大值。因此，起始G-CSF給藥后的4-12天，通過血漿分離置換法來收集含有外周血干細胞的細胞組分(粗制G-PBSCs)。再通過進一步使用密度梯度離心等方法從其中制備一種單核細胞組分(G-PBSCs)。此外，還可以通過類似方法從健康個體中制備G-PBSCs。
從外周血中獲得的單核細胞組分主要包含單核細胞和粒細胞，如單核細胞和淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞和NKT細胞)，并且從其中去除了紅細胞和血小板。
一般而言，來自健康個體的外周血含有0.02％的造血干細胞。與此相比，來自健康個體并且通過G-CSF的給藥引起動員的外周血中，造血干細胞的含量增加至約0.5-1％，而來自癌癥患者并且在化療后通過G-CSF的給藥引起動員的外周血中，造血干細胞的含量增加至約2-7％。因此，與從造血干細胞不由G-CSF動員的外周血中獲得的單核細胞組分相比，從造血干細胞由G-CSF動員的外周血中獲得的單核細胞組分含有更多的造血干細胞。
如果在培養(yǎng)基中加入能影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺，在慣用的培養(yǎng)條件下就可以培養(yǎng)PBSCs。影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺的加入量和培養(yǎng)時間應(yīng)能有效地使Vα24+NKT細胞擴增。盡管依據(jù)所加入的影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子的不同會有所變化，但是通常細胞因子的濃度為50-200U/ml，α-糖基神經(jīng)酰胺的濃度通常為10-200ng/ml，并且培養(yǎng)時間為2-40天。通過利用流式細胞儀對熒光抗體染色的細胞進行分析可以測定Vα24+NKT細胞的擴增情況。
α-糖基神經(jīng)酰胺是一種神經(jīng)鞘糖脂，其中由半乳糖、葡萄糖等構(gòu)成的糖鏈通過α-鍵與神經(jīng)酰胺結(jié)合。其實例包括WO 93/05055(1993年3月18日公開)、WO 94/02168(1994年2月3日公開)、WO 94/09020(1994年4月28日公開)、WO 94/24142(1994年10月27日公開)和WO 98/44928(1998年10月15日公布)所公開的那些內(nèi)容。具體地說，優(yōu)選的是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-N-二十六醇基-2-氨基-1，3，4-十八烷醇。
影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子的實例包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-18。可以僅使用一種細胞因子或?qū)煞N或多種細胞因子結(jié)合使用。優(yōu)選使用的細胞因子包括IL-2，即，IL-2或IL-2與另一種細胞因子的組合。
關(guān)于用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基，應(yīng)提到補加了10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640，其中包含2mM L-谷氨酰胺、1％丙酮酸、2％碳酸氫鹽、100U/ml青霉素，以及100U/ml鏈霉素。
培養(yǎng)單核細胞組分，其中的造血干細胞如上文所述經(jīng)G-CSF動員，這種方法與采用相同方式但不經(jīng)G-CSF動員的PBMCs培養(yǎng)情況相比，可以使Vα24+NKT細胞的數(shù)量顯著增加。
在以前的使用LAK細胞和TILs的臨床試驗中，將10×1010-11個效應(yīng)細胞給予患者。根據(jù)本發(fā)明，不同的是，例如，從經(jīng)G-CSF完成動員的外周血中平均收集8-40×109個單核細胞，將所收集的細胞在IL-2和α-糖基神經(jīng)酰胺存在條件下培養(yǎng)12天后，就可以獲得1×109-10個自體Vα24+NKT細胞。所得細胞的數(shù)量與以前臨床研究中所用細胞數(shù)量相當，并且可有效的用于臨床免疫療法。
因此，根據(jù)本發(fā)明的擴增方法，已知具有殺滅多種類型腫瘤能力的Vα24+NKT細胞可有效地增殖以達到實用程度。同樣，使用本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的含有Vα24+NKT細胞的細胞組分也能引起強免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，在培養(yǎng)那些通過在影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺存在的條件下培養(yǎng)而獲得的細胞后，優(yōu)選在一種腫瘤抗原存在條件下培養(yǎng)細胞。
如果培養(yǎng)基中加入了腫瘤抗原，就可以在培養(yǎng)PBSCs的慣用條件下完成腫瘤抗原存在條件下所進行的培養(yǎng)。腫瘤抗原的加入量和培養(yǎng)時間當充分，使得細胞組分包含的DCs有效地誘導(dǎo)CTL，該細胞組分通過在影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺存在條件下培養(yǎng)獲得。盡管依據(jù)腫瘤抗原類型的不同會有所變化，但是通常腫瘤抗原的濃度為10-10000μg/ml，培養(yǎng)時間為2-14天。確定CTL誘導(dǎo)的方法可以有前體頻率分析(Sharrock CE et al.Immunology Toda 11281-286，1990)、ELISPOT方法(Pass Hetal.Cancer J Sci Am 4316-323，1998)，以及四聚物方法(RomeroP et al.，J Exp Med 1881641-1650，1998)等。
通過在腫瘤抗原存在條件下進行培養(yǎng)，細胞組分中的CTL被誘導(dǎo)，因此，該細胞組分也可以引起對腫瘤抗原的特異性免疫應(yīng)答。
實現(xiàn)從培養(yǎng)細胞中分離Vα24+NKT細胞的方法可以是一些常用方法，如磁珠法。
本發(fā)明用以治療癌癥的試劑包括，作為活性成分的通過本發(fā)明的方法獲得的人Vα24+NKT細胞或一種包含人Vα24+NKT細胞的細胞組分。
通過本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的人Vα24+NKT細胞應(yīng)能強效地引起腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答，并同時清除腫瘤細胞。
在影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺存在條件下，與通過培養(yǎng)不經(jīng)G-CSF動員的單核細胞組分PBMCs所得到的細胞組分比較，通過本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的包含人Vα24+NKT細胞的細胞組分中，NKT細胞的擴增更為持久。
此外，在腫瘤抗原存在條件下，通過進一步實施培養(yǎng)所獲得的包含人Vα24+NKT細胞的細胞組分能通過該組分中的DCs誘導(dǎo)CTL從而引起腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答。也就是說，該細胞組分既可以通過擴增人Vα24+NKT細胞而有效地引起非腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答，又可以引起腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答。據(jù)報道，依據(jù)腫瘤組織部分(即，腫瘤細胞)的不同，主要組織相容性抗原(MHC)的表達水平也不同。由于能引起兩種免疫應(yīng)答，該細胞組分中的腫瘤抗原特異性CTL應(yīng)能攻擊表達MHC的腫瘤細胞，并且非腫瘤抗原特異性NKT細胞應(yīng)能攻擊低水平表達MHC或不表達MHC的腫瘤細胞。因此，將該實施方案的細胞組分應(yīng)用于癌癥治療是很有利的。
因此，將由本發(fā)明所述產(chǎn)生方法獲得的人Vα24+NKT細胞或含有人Vα24+NKT細胞的細胞組分作為癌癥治療劑的一種活性成分是很有利的。
在聯(lián)合獨立分離自另一種細胞群的經(jīng)腫瘤抗原處理而活化的DC s的條件下，由本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的人Vα24+NKT細胞可以用于細胞療法，如癌癥治療。獲得活化DCs的方法有，用GM-CSF和IL-4或IL-3處理包含在PBSCs中的單核細胞，或者是用GM-CSF或IFNα處理CD34陽性造血干細胞。
本發(fā)明用于治療癌癥的試劑的給藥途徑可包括靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥和淋巴節(jié)內(nèi)給藥。試劑的形式可包括一種在生理鹽水或林格氏液等中的懸浮液。依據(jù)給藥途徑不同，給藥量也不同，如果是皮下給藥，劑量為0.1-5ml，或者，如果是靜脈內(nèi)給藥，劑量可高達300ml。Vα24+NKT細胞的給藥量通常以每平方米體表面積給藥105-1010個細胞。所需治療的疾病可包括多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、腎癌、肝癌，以及胰腺癌等。此外，本發(fā)明的試劑還適用于病毒性疾病，如CML和HIV。
根據(jù)本發(fā)明，通過使用α-糖基神經(jīng)酰胺可先體外后體內(nèi)地產(chǎn)生大量的自體Vα24+NKT細胞。該細胞數(shù)量之大足以使其滿足用于臨床領(lǐng)域的要求。此外，培養(yǎng)的Vα24+NKT細胞顯示出對腫瘤具有強殺腫瘤活性，無論該腫瘤是否表達MHC。在本發(fā)明中，與PBMCs比較，通過α-糖基神經(jīng)酰胺的刺激，G-PBSCs顯示出在體外非常有效地擴增人Vα24+NKT細胞的能力。無論是來自健康個體還是癌癥患者，G-PBMCs都能擴增至相同的程度。
實施例
下文將結(jié)合實施例以詳細描述本發(fā)明。
實施例1.人Vα24+NKT細胞的擴增
(1)PBMCs的制備和G-PBSCs的制備
來自健康個體的400ml全血制備出的血沉棕黃層(粗制PBMCs)由日本紅十字血液中心提供。含有PBSCs的細胞組分(粗制G-PBSCs)來自經(jīng)過化療的患者，并且這些患者在化療后接受G-CSF以100-250μg/人/天的劑量經(jīng)皮下給藥6-10天(表1)，方法是在最后一次注射G-CSF后2-24小時內(nèi)，用COBE SpectraTM細胞分離器(LAKE WOOD，CO USA 80215)來完成血漿分離置換法(造血干細胞生物學(xué)和治療學(xué)應(yīng)用。Levit DJ，Mertelsmann R(eds)，Marcel Dekker，Inc.，New York，1995，611-630)。
使用Lymphosepal密度梯度培養(yǎng)基(Immuno-BiologicalLaboratories Gunm，Japan)從所獲得的粗制PBMCs和粗制G-PBSCs中制備出單核細胞組分(分別稱為“PBMCs”和“G-PBSCs”)。
表1.患者特征
NSGCT非-精原細胞瘤性生殖細胞腫瘤
Vα24+NKT細胞的體外活化和擴增
在100U/ml IL-2和100ng/mlα-糖基神經(jīng)酰胺的存在條件下，用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(1)中所得的PBMCs和G-PBSCs，該RPMI-1640中補加了2mM L-谷胺酰胺、1％丙酮酸、2％碳酸氫鹽、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素(GIBCO BRL)。37℃條件下，在含有5％CO2的水-汽飽和空氣中孵育這些細胞。分別在第0天(d0)和第12天(d12)檢測這些培養(yǎng)細胞的數(shù)量和特性。所用的α-糖基神經(jīng)酰胺是由KirinBeer Kabushiki Kaisha制備的，即(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-N-二十六醇基-2-氨基-1，3，4-十八烷醇；被稱為“α-半乳糖基神經(jīng)酰胺”。
按照如下方法，用FACScan血細胞計數(shù)器(Becton Dickinson，Sunyvale，CA)來進行培養(yǎng)細胞的流式細胞術(shù)。異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗Vα24(C15)、藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗Vβ11(C21)、PE偶聯(lián)的抗CD3、PE偶聯(lián)的抗CD56、PE偶聯(lián)的抗CD83和PE偶聯(lián)的抗CD8來自Immunotech(Marseilelles Cedex，F(xiàn)rance)。FITC偶聯(lián)的PE偶聯(lián)的抗CD161、PE偶聯(lián)的抗IL-2Rβ、PE偶聯(lián)的抗HLA-DR和PE偶聯(lián)的抗CD4來自Becton Dickinson。PE偶聯(lián)的抗CD86來自Pharmingen(San Diego，CA)。PE偶聯(lián)的抗CD57來自SIGMA(SaintLouis，Missouri)，并且用作為同種型對照。收集培養(yǎng)細胞并以1×105/ml的密度重懸于10％胎牛血清(FCS)-RPMI1620培養(yǎng)基中。用MRX-150高速冷凍微量離心機(TOMY SEIKO CO.，LTD.Tokyo，Japan)以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心3分鐘，將這些細胞重懸于50μl含有1μl上述抗體的PBS中，4℃孵育30分鐘。然后用PBS清洗細胞兩次，再重懸于PBS中，并且在進行分析之前4℃貯存。顯示為FSC、SSC、FL-1的數(shù)據(jù)是指Vα24或CD4，顯示為FL-2的數(shù)據(jù)是指Vβ11、CD8、CD3。
Vα24+NKT細胞在第0天和第12天之間的變化顯示在圖1中。來自PBMCs的Vα24+NKT細胞反應(yīng)于IL-2和α-糖基神經(jīng)酰胺而擴增。來自由五位不同供體提供的一系列PBMCs的數(shù)據(jù)顯示在表2中。盡管在第0天時Vα24+NKT細胞占總細胞數(shù)量的0.03-0.14％，但這一百分比在第12天增加了1.4-6.1倍。對于來自G-PBSCs的Vα24+NKT細胞，第12天的擴增顯示出32-1414倍的增加量(圖1，表3)。這一擴增比在PBMCs中觀測到的擴增高出至少10倍(圖2)。圖3顯示Vα24+NKT細胞在第12天的表型。這些細胞中，超過98％的細胞表達TCR Vβ11，73.33％的細胞表達CD4或CD8，而小于5％的Vα24+NKT細胞分別表達CD57、CD83、IL-2Rβ和HLA-DR(圖3)。此外，盡管源于PBMCs的Vα24+NKT細胞的數(shù)量在第12天后逐漸減少，但是源于G-PBSCs的Vα24+NKT細胞直到培養(yǎng)的第30天仍繼續(xù)擴增(圖5)。表2.由α-GalCer引起的來自正常PBMCs的Vα24+NKT細胞的擴增
d0第0天，d12第12天
α-GalCer(+)有α-GalCer，α-GalCer(-)無α-GalCer表3.由α-GalCer引起的來自正常G-PBSCs的Vα24+NKT細胞的擴增
d0第0天，d12第12天
α-GalCer(+)有α-GalCer，α-GalCer(-)無α-GalCer
此外還確證了來自健康個體的G-PBSCs能以與來自癌癥患者的G-PBSCs相同的程度進行擴增。
從上述結(jié)果可清晰的看出，通過使用G-PBSCs，經(jīng)過短期培養(yǎng)就可以產(chǎn)生至少108個Vα24+NKT細胞。
實施例2評定Vα24+NKT細胞對人腫瘤細胞的細胞毒活性
用FACS Vantage細胞分類系統(tǒng)從第12天的培養(yǎng)細胞中純化出人Vα24+NKT細胞，并且對這些細胞對腫瘤細胞的細胞毒活性和這些細胞的細胞因子產(chǎn)生活性，均加以評定。
利用以下靶細胞系對α-GalCer活化的Vα24+NKT細胞的細胞毒性進行了三次重復(fù)測定，這些靶細胞系為Molt-4淋巴瘤細胞系和K562髓細胞性白血病細胞系(ATCC，Pockville，MD)。以每1×106個細胞用100μl Ci鉻酸鈉(NEN Life Science Products，Inc.，BostonMA02118)來標記靶細胞1小時。將純化的α-GalCer活化的Vα24+NKT細胞或Vα24-NKT細胞作為效應(yīng)細胞，并按指定的效應(yīng)細胞(E)/靶細胞(T)比將這些細胞接種到圓底96孔板中的51Cr標記的每個靶細胞上。在5％CO2的條件下，37℃培養(yǎng)6小時后，用γ計數(shù)器對裂解的靶細胞所釋放的放射性進行計數(shù)。由公式(樣品的cpm-本底cpm)/(最大cpm-本底cpm)×100來計算特異裂解百分比。由僅有靶細胞的上清液來計算本底cpm，并通過往靶細胞中加入1M HCl來計算最大釋放量。以三次計算的平均值加上標準差的形式來表示數(shù)據(jù)(圖4)。
發(fā)現(xiàn)超過78％的培養(yǎng)細胞表達恒定的Vα24+/Vβ11+TCR。如圖4所示，這些細胞對K562腫瘤細胞和Molt-4腫瘤細胞表現(xiàn)出強細胞毒活性。
用磁性細胞分類儀從單核細胞中分離出CD14+細胞。為了獲得來源于單核細胞的DCs，在50ng/ml重組人(rh)GM-CSF、1000U/ml rhIL-4和500U/ml rhTNF-α(SIGMA，St Louis，MO)存在的條件下，用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞，該RPMI-1640中補加了2mM L-谷胺酰胺、1％丙酮酸、2％碳酸氫鹽、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素(GIBCO BRL，Gaithersburg)以及10％FCS(DainipponPharmaceutical Co.，Ltd.)。37℃條件下，在含有5％CO2的水-汽飽和空氣中孵育這些細胞。挑選出的Vα24+NKT細胞與來自同一供體的源自單核細胞的DCs一起孵育24小時。用ELISA系統(tǒng)(DIACLONE，BESANCON，F(xiàn)RANCE)測定培養(yǎng)液上清中的IFN-γ和IL-4。
在自體的來自單核細胞的DCs存在條件下，進行48小時培養(yǎng)后，用ELISA測定Vα24+NKT細胞的細胞因子分泌。同時，還確定了Vα24+NKT細胞分泌IFN-γ，但Vα24+NKT細胞分泌IL-4卻不能確定。
工業(yè)實用性
根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)過短期培養(yǎng)就可以產(chǎn)生大量的Vα24+NKT細胞。此外，還可以獲得一種細胞組分，其中的Vα24+NKT細胞可進行擴增。通過使用全部組分，預(yù)期可得到一種能引起廣泛免疫應(yīng)答的細胞療法，而用傳統(tǒng)細胞療法不能實現(xiàn)這個目的。
權(quán)利要求
1.一種用以擴增人Vα24+自然殺傷T細胞的方法，該方法包括在一種影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺(α-GlyCer)存在的條件下，培養(yǎng)可以從人外周血中獲得的單核細胞組分(G-PBSCs)，該外周血中的造血干細胞由粒細胞集落刺激因子所動員。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子包括白介素2。
3.一種用以產(chǎn)生人Vα24+自然殺傷T細胞的方法，該方法包括在一種影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺存在的條件下，培養(yǎng)可以從人外周血中獲得的單核細胞組分(G-PBSCs)，該外周血中的造血干細胞由粒細胞集落刺激因子所動員，以及從培養(yǎng)細胞中分離人Vα24+自然殺傷T細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子包括白介素2。
5.一種用以產(chǎn)生一種包含人Vα24+自然殺傷T細胞的細胞組分的方法，該方法包括在一種影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子以及α-糖基神經(jīng)酰胺存在的條件下，培養(yǎng)可以從人外周血中獲得的單核細胞組分(G-PBSCs)，該外周血中的造血干細胞由粒細胞集落刺激因子所動員。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，該方法進一步包括在腫瘤抗原存在的條件下，培養(yǎng)那些通過在影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子和α-糖基神經(jīng)酰胺存在的條件下培養(yǎng)而獲得的細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中影響淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子包括白介素2。
8.一種用于治療癌癥的試劑，該試劑含有作為一種活性成分的由權(quán)利要求3或4中定義的方法所獲得的人Vα24+自然殺傷T細胞。
9.一種用于治療癌癥的試劑，該試劑含有作為一種活性成分的由權(quán)利要求5-7中任一項定義的方法所獲得的含有人Vα24+自然殺傷T細胞的一種細胞組分。
全文摘要
在一種能使淋巴細胞增殖和/或活化的細胞因子和α－糖基神經(jīng)酰胺存在條件下，通過培養(yǎng)一種可以從人外周血獲得的單核細胞組分而擴增人Vα24+自然殺傷T細胞，該外周血中的造血干細胞是被粒細胞集落刺激因子動員的。利用本方法擴增的含有人Vα24+自然殺傷T細胞的細胞組分可作為一種有效的癌癥治療劑。
文檔編號A61P35/00GK1444648SQ0181342
公開日2003年9月24日 申請日期2001年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月6日
發(fā)明者若杉尋 申請人:麒麟麥酒株式會社