棉花內(nèi)生真菌cef-714及其在棉花黃萎病防治中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物病理學(xué)，具體地涉及棉花的內(nèi)生真菌CEF-714及其在棉花黃萎病防治中的應(yīng)用，其保藏編號(hào)為：CGMCC?No.8304。CEF-714能夠在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，容易獲得和培養(yǎng)，以利于工廠化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。室內(nèi)抑菌試驗(yàn)表明，CEF-714的代謝產(chǎn)物對(duì)棉花黃萎病菌的抑制效果達(dá)100%，其產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物對(duì)棉花黃萎病菌的抑制效果為77.5%。溫室試驗(yàn)結(jié)果表明，25%的CEF-714培養(yǎng)濾液浸種對(duì)棉花黃萎病的防治效果為60.6%，對(duì)黃萎病有顯著的控制作用，與生產(chǎn)上應(yīng)用較多的枯草芽孢桿菌相比，防治效果提高34.7%左右，對(duì)作物生長無毒負(fù)作用，對(duì)人畜、昆蟲和作物安全，環(huán)境友好。
【專利說明】棉花內(nèi)生真菌CEF-714及其在棉花黃萎病防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物病理學(xué)，具體地涉及棉花的內(nèi)生真菌CEF-714及其在棉花黃萎病防治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]由大麗輪枝菌引起的黃萎病是世界性的棉花重要病害之一，自20世紀(jì)30年代傳入我國以來，發(fā)生危害日趨嚴(yán)重，90年代以來，該病在我國各大棉區(qū)爆發(fā)成災(zāi)，年發(fā)生面積為300萬公頃左右，產(chǎn)量損失約I億公斤皮棉，已成為發(fā)展棉花生產(chǎn)的主要限制因子之一。分析病害發(fā)生危害的原因主要為，輪作倒茬難，缺乏抗病品種，缺乏具有較好防治效果的農(nóng)藥等。
[0003]利用有益微生物控制植物病害的發(fā)生危害具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好的特點(diǎn)。目前利用拮抗微生物防治棉花黃萎病研究較多的是枯草芽孢桿菌，作用機(jī)理是產(chǎn)生桿菌肽等多種抗菌物質(zhì)來抑制病原菌，對(duì)黃萎病的防治具有一定的效果，但是在生產(chǎn)應(yīng)用中存在不少問題，其中最主要的問題是防治效果較低，國內(nèi)登記的枯草芽孢桿菌劑型對(duì)棉花黃萎病的防治效果在45%左右，且在不同年份效果不穩(wěn)定。例如2008年和2009年，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所承擔(dān)國家農(nóng)藥登記試驗(yàn)中(任務(wù)來源于農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥鑒定所)，黑龍江強(qiáng)爾生化技術(shù)開發(fā)區(qū)有限公司生產(chǎn)的1000億活芽孢/克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對(duì)棉花黃萎病的防治效果為46.0%-52.9%，但在2010年大面積試驗(yàn)中防治效果只有32.7%。
[0004]生防菌通?？衫酶?jìng)爭(zhēng)、抗生、寄生和交叉保護(hù)等直接的拮抗機(jī)制抑制植物病害；同時(shí)某些生防菌還能促進(jìn)植物生長，誘導(dǎo)植物對(duì)真菌、細(xì)菌和病毒引起的病害乃至對(duì)線蟲和昆蟲為害的抗性，稱為誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)，又稱獲得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺激或作用下，產(chǎn)生對(duì)隨后病原物侵染的抗性。誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗病性(或免疫作用)優(yōu)于化學(xué)防治和抗病育種，其優(yōu)點(diǎn)如下:(I)免疫作用能有效地防治病毒、細(xì)菌和真菌病害。(2)免疫作用是穩(wěn)定的，它決定幾種不同的機(jī)制，而內(nèi)吸殺菌劑往往具有單一的作用位點(diǎn)，容易產(chǎn)生新的抗藥小種，因而是不穩(wěn)定的。(3)免疫作用是系統(tǒng)的、持久的，瓜類中的免疫作用可通過嫁接，從砧木傳導(dǎo)到接穗。(4)在感病植物中亦具有免疫能力，說明潛在的抗病基因存在于所有的植物中。(5)免疫物質(zhì)，可從免疫植株的化學(xué)提取物中獲得，可在田間噴施或種子處理。
[0005]植物內(nèi)生真菌資源是個(gè)巨大的寶庫，目前對(duì)內(nèi)生真菌的研究還處于早期階段，所研究的植物類群不過數(shù)百種，僅涉及到很小的一部分。近年來，由于內(nèi)生真菌在病蟲害的生物防治、醫(yī)藥工業(yè)上的用途和范圍逐漸增大，因此有關(guān)內(nèi)生真菌的研究逐漸受到重視。從棉花的內(nèi)生真菌入手，分離篩選對(duì)黃萎病菌具有抑制活性的菌株，獲得對(duì)該病控制效果好的生防菌株，是值得探討的棉花黃萎病防治的新途徑。
[0006]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)多年的研究，從健康棉花的莖桿中獲得一株內(nèi)生真菌，經(jīng)溫室苗期試驗(yàn)對(duì)棉花黃萎病的防治效果達(dá)60.6%，對(duì)棉花黃萎病的防治具有巨大的潛能。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的發(fā)明人為解決現(xiàn)有的拮抗微生物防治棉花黃萎病效果較差的問題，提出并完成本發(fā)明。
[0008]本發(fā)明從棉花的內(nèi)生真菌入手，通過分離、篩選、鑒定、溫室的生物測(cè)定，獲得對(duì)棉花黃萎病具有顯著控制作用的菌株CEF-714 (Leptosphaeria sp.)，其保藏編號(hào)為:CGMCCN0.8304。
[0009]該菌株是一株棉花的內(nèi)生真菌，由于其對(duì)棉花不致病、無毒害作用。因此在分離時(shí)，首先要選擇健康的棉株，最重要的是，在分離過程中，一定要保證樣品的表面消毒徹底，確保分離到的是棉花的內(nèi)生真菌。
[0010]本發(fā)明獲得的生防菌株CEF-714來自棉株體內(nèi)，通過用生防菌株的培養(yǎng)濾液來浸泡棉花種子，使棉花獲得對(duì)黃萎病的抗病性。使用方法簡(jiǎn)單，適宜生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。
[0011]該菌株經(jīng)鑒定是一株小球腔菌屬真菌。從棉花中可以分離到豐富的內(nèi)生真菌。由于微生物的培養(yǎng)性狀容易受培養(yǎng)條件的影響，傳統(tǒng)的以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的分類鑒定有時(shí)候會(huì)受到限制。分子生物學(xué)的發(fā)展給微生物的分類鑒定提供了新的有效措施，因此，以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，結(jié)合分子生物學(xué)的手段，對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行鑒定，最后獲得目的菌株。
[0012]利用棉花的內(nèi)生真菌CEF-714來控制棉花黃萎病在以下三方面產(chǎn)生有益效果。
[0013]UCEF-714能夠在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，容易獲得和培養(yǎng)，用于生物防治的菌株必須能夠在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以利于工廠化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。CEF-714是一株棉花的內(nèi)生真菌，在土壤中廣泛存在。該菌株 在PDA、查氏及玉米沙粒培養(yǎng)基上生長良好，有利于大量繁殖和推廣應(yīng)用。
[0014]2、CEF-714對(duì)棉花黃萎病菌具有較好的抑制效果。在PDA培養(yǎng)基上，CEF-714和棉花黃萎病菌Verticillium dahliae對(duì)扣培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物對(duì)黃萎病菌抑菌效果達(dá)到77.1% ;在同樣條件下采用圓盤濾膜法培養(yǎng)時(shí)，CEF-714產(chǎn)生的非揮發(fā)性代謝物對(duì)黃萎病菌抑菌效果為100%。
[0015]3、CEF-714對(duì)黃萎病控制效果好。將25%的CEF-714查彼克培養(yǎng)發(fā)酵液浸泡感病棉花品種冀棉11的種子(光子)12小時(shí)，將棉花種子播種于蛭石沙土制作的無底紙缽中，于棉苗一片真葉平展時(shí)接種棉花黃萎病強(qiáng)致病力菌株Vd080，棉苗2-3片真葉期調(diào)查黃萎病的發(fā)病情況。用25%的CEF-714發(fā)酵液處理的棉花病情指數(shù)為26.3，未經(jīng)CEF-714發(fā)酵液處理的棉花病情指數(shù)為67.5，CEF-714對(duì)棉花黃萎病的控制效果為60.6%，與生產(chǎn)上應(yīng)用較多的枯草芽孢桿菌相比，防治效果提高34.7%左右。
[0016]4、CEF_714為環(huán)境友好型生防菌株。CEF-714是一株分離自健康棉株的內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為小球腔菌屬，該屬約有1351種，大部分是植物腐生菌。也有報(bào)道，小球腔菌屬為銀杏根部內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種。另有報(bào)道從藥用蕨類植物蛇足石杉分離到的小球腔菌能產(chǎn)生石杉?jí)A甲，是目前治療阿爾茨海默癥最具前景的生物堿類藥物。本研究獲得的小球腔菌屬菌株CEF-714分離自棉花，土壤中廣泛存在，對(duì)多數(shù)的作物不致病，解決了具有生防潛力的微生物可能轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【膯栴}，因此對(duì)人畜、昆蟲和作物安全，環(huán)境友好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為CEF-714在PDA上的菌落形態(tài)，其中a為正面，b為反面，c為顯微鏡下觀察到的菌絲及分生孢子；
[0018]圖2CEF-714對(duì)棉花黃萎病的控制作用。a，清水浸種，播種后18天接種大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株Vd080 ；b, 25%的CEF-818培養(yǎng)濾液浸種，播種后18天接種大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株Vd080 ;c，清水浸種，播種后18天用滅菌蒸餾水蘸根。
[0019]內(nèi)生真菌(Leptosphaeria sp.) CEF-714,于2013年10月10日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏編號(hào)是:CGMCC N0.8304。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1菌株的分離
[0021](一)樣品采集
[0022]于6-8月份,選擇健康棉株,取主莖的中上部及果枝15cm。
[0023](二)菌株的分離
[0024]先將采集到的樣品(棉花莖桿)用清水洗凈，去皮，置于直徑為9cm的滅菌的培養(yǎng)皿中，用75%的酒精消毒lmin。再用5.0%的次氯酸鈉進(jìn)行消毒60s，用滅菌水洗3次，每次時(shí)間不少于3min。然后用滅菌的吸水紙沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0.4cm長的小段，置于9cm的培養(yǎng)皿中，25°C培養(yǎng)。用最后一遍清洗液為對(duì)照，檢查消毒是否徹底。每天檢查內(nèi)生真菌的生長情況，發(fā)現(xiàn)有菌落長出，及時(shí)轉(zhuǎn)移至直徑為6cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后觀察其菌落大小、顏色、表面特征、質(zhì)
[0025](三)CER)8111的特征
[0026]1、形態(tài)特征在PDA平板上，菌絲密集短絨毛狀，菌落為正面為淡黃色，邊緣不整齊，齒輪狀，背面深黃色，顯微鏡下觀察，在PDA培養(yǎng)基上和查比克液體培養(yǎng)基中，菌絲為無色透明狀，銳角分支，未見分生孢子(圖1)。
[0027]2、生理特征CEF-714在5_30°C條件下均能生長，最適生長溫度是25°C。
[0028]依據(jù)CEF-714形態(tài)特征、生理特征和分子鑒定結(jié)果，將CEF-714歸屬為Leptosphaeria。
[0029](四)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
[0030]1.PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15_20g，水1000ml，自然pH。稱取削皮的200g馬鈴薯，切成小塊置于鍋中加水煮爛(煮沸20-30min)，用紗布過濾后，濾液中加入葡萄糖和瓊脂繼續(xù)加熱攪勻，稍冷卻后再補(bǔ)水至1000ml，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120°C滅菌20min。25°C，黑暗培養(yǎng)7d。
[0031]2.查彼克(Czapek)液體培養(yǎng)基 KNO3, 2.0Og ;K2HP04，1.0Og ;KCI，0.50g ;MgSO4.7Η20，0.50g ；FeS04.7H20, 0.01g ;蔗糖，30.0Og ;加水至 1000ml，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120°C滅菌20min。置搖床150rpm，25°C，黑暗條件震蕩培養(yǎng)7d。
[0032]3.玉米粉沙土培養(yǎng)基將2份玉米粉和1份沙土加適量水(將培養(yǎng)基捏在手中不滴水)混勻，悶半小時(shí)后，放入克氏瓶中，120°C滅菌30min。25°C，黑暗培養(yǎng)14d。
[0033]實(shí)施例2CEF-714對(duì)棉花黃萎病菌的抑制作用
[0034]1、試驗(yàn)方法
[0035]對(duì)扣培養(yǎng)法。在直徑90mm培養(yǎng)皿的皿蓋和皿底分別倒入一定量的PDA培養(yǎng)基，皿蓋培養(yǎng)基稍少些。凝固后，在皿蓋中心接入5μ I的青霉CEF-714菌液(查彼克液體培養(yǎng)7d)，在皿底中心接種5 μ I的黃萎病病原菌菌液(查彼克液體培養(yǎng)7d)。放入25°C恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)，以僅接種病原菌的培養(yǎng)皿為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)4次。每天觀察病原菌及青霉菌絲的生長狀況，接入黃萎病菌7d后采用十字交叉法測(cè)量病原菌的菌落直徑，計(jì)算青霉CEF-714揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生長的抑制率。圓盤濾膜法。在直徑為9cm的PDA平板上，平鋪上直徑略大于9cm的雙層玻璃紙(硝酸纖維素膜)，在平板中央接種5μ I的青霉CEF-714菌液(查彼克液體培養(yǎng)7d)，25°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d后去玻璃紙，再在平板中央接種5 μ I的黃萎病菌Vd080菌液(查彼克液體培養(yǎng)7d)，25°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d。以不含CEF-714代謝產(chǎn)物的PDA平板接種棉花黃萎病菌Vd080為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)4次，用十字法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算抑制率。
[0036]2、試驗(yàn)結(jié)果
[0037]對(duì)扣培養(yǎng)結(jié)果表明，經(jīng)CEF-714處理的棉花黃萎病菌菌落直徑為1.4cm，未經(jīng)CEF-714處理的菌落直徑為6.lcm, CEF-714揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生長的抑制率為77.1%。
[0038]圓盤濾膜法培養(yǎng)結(jié)果表明，經(jīng)CEF-714處理的棉花黃萎病菌停止生長，菌落直徑為0.0cm，未經(jīng)CEF-714處理的菌落直徑為6.lcm, CEF-714分泌的代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生長的抑制率為100%。
[0039]表1 CEF-714對(duì)棉花黃萎病菌的抑制作用
【權(quán)利要求】
1.棉花內(nèi)生真菌CEF-714，其特征在于，其保藏編號(hào)為:CGMCCN0.8304。
2.權(quán)利要求1所述棉花內(nèi)生真菌CEF-714用于抑制棉花黃萎病菌的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述棉花內(nèi)生真菌CEF-714用于控制棉花黃萎病的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述棉花內(nèi)生真菌CEF-714的培養(yǎng)方法，其特征在于，在PDA培養(yǎng)基、查彼克液體培養(yǎng)基或玉米 沙土培養(yǎng)基上25 °C黑暗培養(yǎng)7天。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103642704SQ201310692474
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】朱荷琴, 馮自力, 李志芳, 王玲飛, 趙麗紅, 師勇強(qiáng), 鄭綋爽 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所