一種新化合物球腔烯胺及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新化合物球腔烯胺及其用途，該球腔烯胺具有免疫抑制活性。球腔烯胺是由名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae ZJLQ129發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物球腔菌素氨化衍生而來；名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae ZJLQ129保藏名稱為：Mycosphaerella nawae ZJLQ129，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學；保藏日期：2015年9月9日，保藏號：CCTCC NO：M2015517。CCTCC NO：M201551720150909
【專利說明】
一種新化合物球腔烯胺及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及化學領(lǐng)域，具體地說是從內(nèi)生真菌名和氏球腔菌菌株ZJLQ129分離出 的代謝產(chǎn)物球腔菌素的衍生物，及其用途，名和氏球腔菌菌株ZJLQ129可產(chǎn)生代謝產(chǎn)物二苯 并咲喃類化合物球腔菌素(-)mycousunine，該化合物可衍生獲得球腔稀胺(-)mycousunine amide，球腔稀胺(-)mycousunine amide具有免疫抑制活性。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生真菌(Plantendophyticfungi)是指那些在其生活史的一定階段或全部 階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌，被感染的宿主植物(至少是暫時)不表 現(xiàn)出外在癥狀，可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直 接擴增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生。它是植物微生物系統(tǒng)中的內(nèi)生真菌，廣泛存在于 植物組織內(nèi)，不受外界環(huán)境的影響。它是植物微生物系統(tǒng)中的天然組成成分，在進化過程中 與植物寄主建立了和諧的共生關(guān)系，其次生代謝產(chǎn)物十分豐富。植物內(nèi)生真菌幾乎存在于 所有目前已研究過的植物中，分布廣，種類多。研究表明，感染內(nèi)生菌的植物宿主往往具有 生長快速、抗逆境、抗病害、抗動物危害等優(yōu)勢，比未感染植株更具生存競爭力。在內(nèi)真生 菌-植物宿主-食草動物生態(tài)系統(tǒng)中，植物內(nèi)生真菌扮演著前所未知的重要生態(tài)學作用。發(fā) 揮這些作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是內(nèi)生真菌產(chǎn)生的豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物，它們具有多種生物活 性，在農(nóng)業(yè)和(或）醫(yī)藥業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力。近年來，隨著美國科學家A.Stierle在太 平洋短葉杉上發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤藥物紫杉醇的產(chǎn)生菌，藥用植物和瀕危植物內(nèi)生真菌及其活性 物質(zhì)的研究成為了藥物開發(fā)的重要方向。我國植物資源十分豐富，對其內(nèi)生真菌的研究將 有利于微生物藥物的開發(fā)和珍稀植物資源的保護。
[0003] 常用的免疫抑制劑主要有五類：（1)糖皮質(zhì)激素類，如可的松和強的松；（2)微生物 代謝產(chǎn)物，如環(huán)孢菌素和藤霉素等；（3)抗代謝物，如硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤等；（4)多克隆 和單克隆抗淋巴細胞抗體，如抗淋巴細胞球蛋白和0KT3等；（5)烷化劑類，如環(huán)磷酰胺等。其 中，微生物酵解作為主要合成方法，已有多種產(chǎn)品，如環(huán)孢菌素 CsA類、他克莫司Tacrolimus (FK506)、雷帕霉素 Rapamycin(RPM)及其衍生物SDZ RAD、Mizoribine(MZ)等。以環(huán)孢菌素為 例，七十年代后期瑞士的Borel發(fā)現(xiàn)了一種從霉菌酵解產(chǎn)物里提取的一種只含11個氨基酸 的環(huán)形多肽，取名為環(huán)孢素(CsA)，可以有效地特異性抑制淋巴細胞反應(yīng)和增生。對T細胞， 尤其是TH細胞有較好的選擇性抑制作用，而對其他的免疫細胞的抑制作用則相對較弱，因 此在抗器官移植排斥中取得了很好的療效;也用于自身免疫病的治療，因此是一種具有很 高臨床使用價值的免疫抑制劑。經(jīng)10年的臨床試驗應(yīng)用研究證實其抗排斥反應(yīng)作用較其他 藥物強而且副作用小的多。故于八十年代末被批準正式注冊投入市場應(yīng)用。CsA近20年的臨 床應(yīng)用顯示了神奇的效果，使得除小腸移植外，肝、腎、心及心/肺、胰移植的病人/移植物一 年存活率達70 - 85%，而在此之前僅30 - 50% XsA相關(guān)性神經(jīng)毒性癥狀的發(fā)生率大約為 10-28%，是影響患者預(yù)后的一種較為重要的因素。輕度以頭痛、肢體震顫、感覺障礙等多 見，中度以視力障礙為主。CsA相關(guān)神經(jīng)毒性的重癥表現(xiàn)發(fā)生率極低。
[0004] 植物內(nèi)生真菌作為與植物共生的真菌，其在與植物共生的過程中，發(fā)展擁有與普 通致病菌不同的天然代謝產(chǎn)物。分離植物中存在的新的內(nèi)生真菌，探索該菌的次生代謝產(chǎn) 物活性，是一個新的開發(fā)方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種新化合物(-)mycousunine amide，中文名球腔稀胺。同時提供了 上述名球腔稀胺(-)mycousunine amide的用途，球腔稀胺具有免疫抑制活性。球腔稀胺是 由名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae ZJLQ129發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物球腔菌素（_) mycousunine衍生而來。一種新型名和氏球腔菌Mycosphaere 1 la nawae ZJLQ129保藏名稱 為:Mycosphaerella nawae ZJLQ129,保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國 武漢武漢大學;保藏日期:2015年9月9日，保藏號:CCTCC N0:M2015517。
[0006] 本發(fā)明提供一種新化合物球腔烯胺，球腔烯胺為黃色針晶，乙腈溶液中旋光度值 為-136°，高分辨質(zhì)譜分子量為376.1399,分子式為C19H21O7N，。
[0007] 優(yōu)選的，本發(fā)明的球腔烯胺絕對構(gòu)型為（4&1?，糾34)-6- &〇6七71-2-(1-aminoethy1idene)_7，9-dihydroxy-4a_methoxy-8，9b_dimethy1_4，4a_dihydrodibenzo [b，d]furan_l，3(2H，9bH)_dione〇
[0008] 更為優(yōu)選的，球腔稀胺(-)mycousunine amide通過球腔菌素(-)mycousnine氨化 衍生而來。
[0009] 進一步，球腔烯胺的制備方法為:取純品球腔菌素200mg，于三頸瓶中，冰鹽浴中至 〇°C，通入氨氣反應(yīng)30分鐘，樣品濃縮至干，取濃縮后的樣品7克用甲醇溶解，加14g硅膠拌樣 上柱，加入洗脫劑為石油醚:氯仿：甲醇=18:4:1，200-300目硅膠柱層析分離，獲得新化合 物球腔稀胺150mg。
[0010] 本發(fā)明還提供了球腔菌素 （-)m y c 〇 u s u n i n e的來源，為名和氏球腔菌 Mycosphaerella nawae ZJLQ129的次生代謝產(chǎn)物。
[0011] 其中，名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae ZJLQ129,保藏名稱為： Mycosphaerella nawae ZJLQ129,保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武 漢武漢大學;保藏日期:2015年9月9日，保藏號:CCTCC N0:M2015517。
[0012] 上述優(yōu)選的，球腔稀胺(-)mycousunine amide化合物具有免疫抑制活性。優(yōu)選的， 在2nM濃度下球腔稀胺(-)mycousunine amide對刀豆蛋白A(Con A)誘導的T細胞增殖的免 疫抑制率為32.4±6.2%。
[0013] 本發(fā)明中球腔稀胺、球腔稀胺(-)mycousunine amide或(-)mycousunine amide為 同一化合物;球腔菌素、球腔菌素(_)mycousnine或(-)mycousnine為同一化合物。
[0014] 免疫抑制：是指對于免疫應(yīng)答的抑制作用，或者說是對機體的免疫反應(yīng)具有抑制 作用。免疫抑制劑能抑制與免疫反應(yīng)有關(guān)細胞(T細胞和B細胞等巨噬細胞）的增殖和功能， 能降低抗體免疫反應(yīng)。
【附圖說明】
[0015] 圖1:球腔菌素(-)mycousunine結(jié)構(gòu)式圖
[0016] 圖2:球腔稀胺(-)mycousunine amide結(jié)構(gòu)式圖
[0017] 圖3:球腔稀胺(-)mycousunine amide絕對構(gòu)型圖
[0018] 圖4:球腔稀胺(-)mycousunine amide(化合物2)選擇性抑制T細胞增殖。（A):刀豆 蛋白A(Con A)誘導的T細胞增殖。（B):脂多糖(LPS)誘導的B細胞增殖。（C):PANC-1和A549細 胞增殖?？v坐標為細胞相對增殖率，η = 4，與對照組(OnM組)比較，bP〈0.01和7〈0.001。
[0019] 圖5: (A和B):球腔稀胺(-)mycousunine amide(化合物2)抑制⑶3+T細胞增殖?？v 坐標表示⑶3+T細胞的比例。n = 3，與對照組比較，bP〈0.01和。P〈0.001。（C):化合物2的細胞 毒性?？v坐標表示細胞存活率，η = 4，與對照組(OnM組)比較，aP〈0.05，bP〈0.01和叩〈0.001。 [00 20]圖6:球腔稀胺(-)mycousunine amide(化合物2)抑制活化T細胞中細胞因子的分 泌?？v坐標表示細胞因子的濃度，η = 3，與對照組比較，aP〈0.05，bP〈0.01和叩〈0.001。
【具體實施方式】
[0021 ] 球腔稀胺是通過名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)ZJLQ129發(fā)酵產(chǎn)生的 代謝產(chǎn)物球腔菌素衍生化得到的，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說 明。
[0022] 本發(fā)明中的主要儀器包括：3K-30高速臺式離心機，德國Sigma;RE-6000A旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)器，上海亞榮;玻璃層析柱;LCQ-Advantage型質(zhì)譜儀，美國Finnigan; DRX- 500型核磁共振 儀，德國Bruker公司。MC0-15AC型細胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司；SpX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海 博訊實業(yè)有限公司；1700型電子天平，德國Sartorius公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州安 泰空氣技術(shù)有限公司；LD5-2A型離心機，北京醫(yī)用離心機廠；1-13型離心機，德國SIGMA公 司;MH-1型微量振蕩器，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；680型酶聯(lián)免疫檢測儀，美 國Bio-Rad公司；synergy-2SLFPA全波長多功能酶標儀，美國BioTek公司；XDS-1B型生物倒 置顯微鏡，重慶光學儀器廠；1X73研究級倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；5804R型高速 冷凍臺式離心機，德國Eppendorf公司；PTC-200PCR儀，美國Bio-Rad公司；ABIPRISM·甚7900 熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；NanoDrop?ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光 光度計:美國賽默飛公司;FACS Calibur型流式細胞儀:美國Becton Dickson公司。
[0023] 本發(fā)明中的主要試劑包括:柱層析硅膠(200-300目），青島海洋化工廠;柱層析凝 膠（Sephadex LH-20)，Pharmacia公司。刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖LPS、醋酸地塞米松、3_ [4，5-dimethylthylthiazol_2-yl ]_2，5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)、臺酸藍、 二甲基亞砜溶液(DMS0)購自Sigma公司；環(huán)孢菌素 A(CsA)由華東醫(yī)藥股份有限公司饋贈； RPMI1640細胞培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液購自Thermo Fisher公司；新生牛血清購自杭州四季青 生物工程有限公司；100 X青鏈霉素溶液和Hank' s液購自江蘇碧云天生物工程研究所;含 10 %滅火胎牛血清和1 X青鏈霉素溶液的RPMI1640細胞培養(yǎng)液即為完全培養(yǎng)液;40μπι孔間 細胞濾網(wǎng)購自 Biologix 公司；抗體 FITC-anti-CDSJE-anti-CDLPE-anti-CDSJE-anti-CDeg 和 PE-anti-CD25 購自 eBioscience 公司； 小鼠細胞因子 （IL-2 和 IFN-γ )Elisa 檢測試劑 盒購自武漢博士德生物工程公司；Trizol購自Invitrogen公司；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購自 Fermentas公司；SYBR Green PCR試劑盒購自TIANGEN公司；PCR引物及其他PCR試劑購自上 海生工生物工程技術(shù)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0024] 實施例一、名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)ZJLQ129的獲得
[0025] 名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)ZJLQ129的分離培養(yǎng)與鑒定：
[0026] 在實驗室中按下列條件和步驟分離培養(yǎng)，即可獲得本發(fā)明所述的名和氏球腔菌菌 株ZJLQ129:
[0027] 1)從我國浙江龍泉自然保護區(qū)采集，將采集的拔葜葉子用濃度0.5% (w/v)的次氯 酸鈉進行表面消毒l〇min，然后無菌水漂洗后置于無菌濾紙上吸干水。菝葜，也稱金剛藤，百 合科菝葜屬，多年生藤本落葉攀附植物。生于山坡林下，分布于中國長江以南各地，攀援灌 木，葉薄革質(zhì)或堅紙質(zhì)，干后通常紅、褐色或近古銅色，圓形、卵形或其他形狀，長3-10厘米， 寬1.5-6(-10)厘米，下面通常淡綠色，較少蒼白色;葉柄長5-15毫米，約占全長的1/2-2/3具 寬0.5-1毫米(一側(cè)）的鞘，幾乎都有卷須，少有例外，脫落點位于靠近卷須處，根狀莖粗厚， 堅硬，為不規(guī)則的塊狀，粗2-3厘米。莖長1-3米，少數(shù)可達5米，疏生刺。
[0028] 2)用無菌刀片把表面消毒過的菝葜葉子切成lcm左右大小的組織片，將組織片移 接在含100μg/ml氨芐青霉素和鏈霉素的2%(w/v)水瓊脂平板上，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 條件:25°C，16小時光照，8小時黑暗；
[0029] 3)待菌絲長出后，將單菌絲頂端移接到PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25°C培養(yǎng)，連續(xù)純 化3次，獲得純培養(yǎng)。本發(fā)明的名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae ZJLQ129CCTCC N0:M2015517)具有如下特性:PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，20-25d菌落直徑為2-3cm，60-66d菌落直徑為3-4cm，生長速率減小。PDA培養(yǎng)基上于25°C，12小時黑暗交替培養(yǎng)， 菌落呈不規(guī)則形，無氣生菌絲，菌絲初期為灰色，后期變?yōu)榛液谏趁婧驼婢邪櫿?，?落邊緣不整齊，無色素分泌;子囊座為黑色，不產(chǎn)生孢子，菌絲有隔膜。名和氏球腔菌菌株 ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae ZJLQ129CCTCC N0:M2015517)，它屬于真菌界（Fungi)， 雙核亞界（Dikarya)，子囊菌門（Ascomycota)，盤菌亞門（Pezizomycotina)，子囊菌綱 (Ascomycetes)，盤菌目（Pezizales)，盤菌科(Pezizaceae)，球腔菌屬(Mycosphaerella)。
[0030] 4)菌種鑒定:將ZJLQ129進行beta-tubulin基因測序，并利用BLAST程序進行比對， 利用PAUP程序進行系統(tǒng)發(fā)育分析。
[0031]將菌株菌絲在液氮中研成粉末，取100mg粉末裝于1.5mL離心管中，采用DNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN)按廠商的程序提取基因組DNA。采用通用引物BT1(5'_ AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3，）和BT22(5 '-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3，）擴增beta-tubulin 基因，PCR體系：DNA模板（100ng/yL)5 · OyL，10 X PCR緩沖液（含25mmol/L MgCl2)5 · OyL， dNTPs(5mmol/L)1.0yL，引物（50yg/mL)各0.5yL，Taq DNA聚合酶（2U/yL)lyL，加水補足50μ L，混勻后在BI0RAD公司S1000型號的PCR儀上進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件:94°C3min;94°C 30s，53°C50s，72°C90s，35 個循環(huán)；72°C 10min。
[0032] PCR擴增產(chǎn)物用Axygen柱式DNA膠回收試劑盒進行純化。純化的ITS rDNA PCR擴增 產(chǎn)物分別用擴增引物對ITS1和ITS4測序，純化的beta-tubulin擴增產(chǎn)物測序。測序由上海 生工生物工程服務(wù)有限公司完成。測得的序列在GenBank上進行BLAST搜索?；贐LAST結(jié) 果，用軟件Clustal X 1.81將菌株ZJLQ129的序列與GenBank上球腔菌屬的相關(guān)序列進行比 對，然后進行系統(tǒng)發(fā)育分析。以上結(jié)果表明菌株ZJLQ1 29可以定名為名和氏球腔菌 Mycosphaerella nawae。
[0033]實施例二、球腔稀胺前體球腔菌素(-)mycousunine的制備和結(jié)構(gòu)鑒定
[0034] 1)名和氏球腔菌菌株(1}^〇8。1^6^113仙￥36)2幾 (>)129發(fā)酵培養(yǎng)，依次進行以下 步驟：
[0035] 將ZJLQ129菌餅(直徑為0.5厘米)共10個接入500ml PDB中于25 °C，200轉(zhuǎn)搖床上培 養(yǎng)10天，培養(yǎng)液在無菌條件下粉碎，加入500ml PDB中培養(yǎng)，每瓶接入菌絲液25ml，共接40瓶 即20L，于室溫下靜置培養(yǎng)2周后過濾分別獲得發(fā)酵液與菌絲體。其中發(fā)酵液用乙酸乙酯萃3 次后萃取液濃縮得浸膏1.72g(A部分），菌絲體用丙酮浸泡過夜后濃縮至小體積，獲得浸膏 1.76(B部分）。合并二部分得浸膏3.5g(C部分）。
[0036] 其中上述培養(yǎng)基或培養(yǎng)液的成分如下：
[0037] PDA培養(yǎng)基：即馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar)去皮馬鈴薯200g，切成 小塊，加水煮沸20min，以紗布濾去固體殘渣，濾液加水補足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解， 再加入15g溶化的瓊脂粉，分裝，121°C滅菌20min備用。
[0038] PDB培養(yǎng)液：即馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose broth):去皮馬鈴薯200g，切成小 塊，加水煮沸20min，以紗布濾去固體殘渣，濾液加水補足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解，分 裝，121°C滅菌20min備用。
[0039] 2)化合物的制備：
[0040]取上述浸膏C 3.5g加15g硅膠拌樣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。另外，用200-300硅膠950克 干法裝柱，將拌樣后的樣品上樣后進行柱層析分離，依次用石油醚：乙酸乙酯4:1(體積比）， 石油醚：乙酸乙酯3: 2(體積比），石油醚：乙酸乙酯3: 7(體積比），乙酸乙酯，乙酸乙酯：甲醇 4:1(體積比）分別進行梯度洗脫分離，每500ml接收1個流分，共接收31個流分，將接收的樣 品進行硅膠薄層層析，以茴香醛顯色劑顯色后，將Rf值為0.46且茴香醛噴霧顯色為藍色的 流分合并，獲得Fr8這一部分。茴香醛顯色劑的配方如下:茴香醛(對甲氧基苯甲醛）1:廣譜。 配制方法：135乙醇+5mL濃硫酸+1.5mL of冰醋酸+3.7mL茴香醛，劇烈攪拌，使混合均勻。茴 香醛（對甲氧基苯甲醛）2:砲稀，桉樹腦（cineoles)，withanolides，出油柑堿 (acronycine)。配制方法:茴香醛:HCl〇4:丙酮:水（1:10:20:80) aFrS部分(Rf值=0.46)共 1.70g采用凝膠柱層析分離純化，以氯仿：甲醇1:1 (v/v)為洗脫機洗脫反復分離，硅膠薄層 層析檢測，以茴香醛顯色劑顯色后，合并組分相同的流分，最終獲得純品300mg，記為化合物 (1)?；衔?1)是從名和氏球腔菌株ZJLQ129中分離獲得的代謝產(chǎn)物。
[0041] 3)化合物(1)球腔菌素(-)mycousunine的鑒定過程如下：
[0042] 化合物（1)，見圖 1，黃色針晶，mp 86-89°C(Me0H);HRESIMS m/z:376.1158M+ (calcd for Ci9H2〇〇8 376.1158)? NMR(400MHz，CDCl3)，3.17(lH，d，J=18Hz，H-4a)，3.31 (1H， d，J=18Hz，H-4b)，1.63(3H，s，H-10)，2.56(3H，s，H-12)，2.59(3H，s，H-14)，2.04(3H， s，H-15)，3.54(3H，s，H-16).13CMffi(100MHz，CDCl3)197.7(sa-C)，110.7(s，2-C)，194.6 (s，3-C)，37.9(t，4-C)，51.3(q，4a-C)，156.6(s，5a-C)，101.8(s，6-C)，163.4(s，7-C)， 107.2(s，8-C)，159.1(s，9-C)，105.3(s，9a-C)，59.8(s，9b-C)，17.3(q，10-C)，202.4(s，n-〇,27.4(9，12-〇,201.0(8，13-〇,31.2(9，14-〇,7.2(9，15-〇,51.3(9,016)?；衔铮?) 的分子量與核磁共振氫譜與碳譜數(shù)據(jù)與松蘿酸很相似，說明該化合物為二苯并呋喃類化合 物?；衔?比松蘿酸多了一個甲氧基(SC 51.4，δΗ 3.56，s 3H)，一個ABq亞甲基0C 37.9， δΗ 3.17d，J=18.0，SH 3.31d，J=18.0)，但少了一個苯環(huán)叔碳及對應(yīng)氫質(zhì)子信號（SC98.2， δΗ 5.98，s 1H)，說明化合物1的4a位被甲氧基取代，而4號位為亞甲基，化合物（1)的1H NMR 及13C NMR與文獻中（-)-mycousnine的數(shù)據(jù)一致，因此將化合物（1)鑒定為(-)mycousnine， 中文名球腔菌素。
[0043] 實施例三:化合物(2)球腔稀胺(-)mycousunine amide的獲得和命名
[0044] 1、化合物(2)是化合物(1)通過氨化反應(yīng)得到的，具體如下：
[0045] 取純品球腔菌素200mg，于三頸瓶中，冰鹽浴中至0°C，通入氨氣反應(yīng)30分鐘，樣品 濃縮至干，取濃縮后的樣品7克用甲醇溶解，加14g硅膠拌樣上柱，加入洗脫劑為石油醚:氯 仿：甲醇=18:4:1，200-300目硅膠柱層析分離，獲得新化合物球腔烯胺150mg。
[0046] 2、化合物(2)球腔稀胺(-)mycousunine amide的鑒定：
[0047] 化合物（2)為化合物（1)的氨化反應(yīng)產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)式見圖2,黃色針晶，旋光度： [a]h -136° (c = 0.1 ,MeCN)mp HRESIMS m/z : 376.1399 [M+H] + ( calcd for C19H21O7N 376.1399)。比化合物（1)的分子量少了1。咕匪1?(5001抱，〇)(：13)，13〇匪1?(1251抱，〇)(：13)見 表1。通過比較化合物（1)與(2)的 1H及13C NMR數(shù)據(jù)，確定其結(jié)構(gòu)為(-)mycousnine amide。為 了進一步驗證其結(jié)構(gòu)及絕對構(gòu)型，對化合物(2)進行X-ray分析。最終確證化合物(2)的絕對 構(gòu)型為（4aR，9bS，E)_6_acety 1_2_( 1-aminoethyl idene)_7，9-dihydroxy-4a-methoxy-8， 9b-dimethyl-4,4a-dihydrodibenzo[b，d]furan-l，3(2H，9bH)_dione，圖3為化合物（2)的 絕對構(gòu)型。
[0048] 表 1 化合物2的 13C NMR與1H NMR數(shù)據(jù)(ΟΧη3，δρρπι;Ηζ)
[0051] 實施例四：化合物(2)球腔稀胺(-)mycousunine amide的免疫抑制活性測定：
[0052] 實驗方法如下：1、供試品化合物（2) (-)mycousnine enamine配制:化合物（2)(-) mycousnine enamine純度>99%?；衔铮?)先以DMS0溶解為50mM濃度，-20°C冷凍保存。臨 用前再采用RPMI1640細胞培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。稀釋液中DMSO的含量5 0.2%，對細胞的 生物活性沒有影響。
[0053] 2、細胞株和實驗動物來源:PANC-1和A549細胞購自中國科學院上海細胞庫。培養(yǎng) 于含10 %滅活胎牛血清，100IU/mL青霉素、100yg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco ' S modified eagle medium)中；放置于37°C，5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長80%以 上融合程度時，用0.25 %胰酶消化傳代。雌性SPF級C57BL/6小鼠，6周齡，18-22g，購于上海 西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物購得后飼養(yǎng)一周，適應(yīng)環(huán)境后再進行實驗。實驗 動物的處理程序按照浙江省醫(yī)學科學院實驗動物福利倫理委員會的規(guī)定執(zhí)行。
[0054] 3、單個脾細胞懸液制備：小鼠無菌取脾，研磨后，加適量Hank's液混懸，以40μπι孔 間細胞濾網(wǎng)濾過，1500rpm離心5分鐘，棄上清，加 Hank's液重復洗滌2次。收集脾細胞，加 RPMI1640完全培養(yǎng)液混懸制成單個脾細胞懸液。以0.4 %臺酚藍拒染法記數(shù)，活細胞數(shù)不少 于 95%。
[0055] 4、Con A誘導的T細胞增殖和LPS誘導的B細胞增殖實驗測定：于96孔平底培養(yǎng)板 中，每孔加 l〇〇yL脾細胞懸液(5X10 6cell/ml)，并加入50μ1 Con A溶液(2μg/ml)或LPS溶 液(2μg/ml)，最后加入不同濃度(0、2、10、50、250恤)供試藥物的稀釋液5(^1，每個濃度重 復4孔，另設(shè)正常細胞對照孔。37 °C，5 %C02培養(yǎng)44小時后，各孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μ1， 繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心（1800rpm，5min)，棄去各孔上清，分別加酸性DMS0溶液(4%lmol/l HC1) 150μ1，避光振蕩15min，測定0D490nm，以絲裂原作用孔(藥物濃度0)的增殖率計為100%，計 算藥物作用后的相對細胞增殖率。MTT是一種粉末狀化學試劑，全稱為3-(4,5)_ dimethylthiahiazo(-z_yl )_3，5_di-phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3_(4，5_ 二 甲基噻唑-2 )-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍，是一種黃顏色的染料。MTT法的檢測 原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚 (Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMS0)能溶解細胞中的甲饋， 用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞 數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值(0D值），來判斷活細胞增殖數(shù)量，0D值越大，細胞活性越強， 增值率越高。
[0056] 5、PANC-1和A549細胞增殖實驗測定:取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整濃度至1 X 105個/ mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中l(wèi)OOyL/孔。培養(yǎng)24小時后，加入ZJLQ129稀釋液至總體積為200 yL，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，采用上述ΜΤΤ法測定細胞增殖率。
[0057] 6、細胞毒性測定：于96孔平底培養(yǎng)板中，每孔加100yL脾細胞懸液（5X106cell/ ml)，并加入50μ1不同濃度供試藥物的稀釋液，再加入RPMI1640培養(yǎng)液50μ1，復4孔，37°C， 5 % C02培養(yǎng)48小時，按前述MTT法測定細胞存活率。
[0058] 7、⑶3+T細胞比例測定:于24孔平底培養(yǎng)板中，每孔加 lml脾細胞懸液(5X 106cell/ ml)，并加入Con A溶液（2μg/ml)和不同濃度的供試藥物溶液各0.5ml，各濃度復3孔。置37 °C，5%⑶2分別培養(yǎng)24小時和48小時后，收集細胞，以FITC-anti-CD3標記。PBS洗滌去除未 結(jié)合的熒光抗體，置流式細胞儀測定熒光標記細胞的比例。
[0059] 8、細胞因子的生產(chǎn)測定：于24孔平底培養(yǎng)板中，每孔加 lml脾細胞懸液（5 X 106cell/ml)，并加入Con A溶液(2μg/ml)和不同濃度的供試藥物溶液各0.5ml，各濃度復3 孔。置37°C，5%C02培養(yǎng)24和48小時后，收集培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒檢測細胞因子IL-2 和IFN-γ的含量。
[0060] 上述實驗結(jié)果表明：
[0061 ] 觀察化合物(2)對Con A誘導T細胞增殖的影響。結(jié)果如圖4A所示，與CsA-樣，化合 物(2)在極低濃度(2nM)即能顯著抑制T細胞的增殖，在2nM濃度下球腔稀胺(-)mycousunine amide對刀豆蛋白A(Con A)誘導的T細胞增殖的免疫抑制率為32.4±6.2%。在受試濃度范 圍內(nèi)（2~250nM)呈較好的濃度依賴關(guān)系?；衔铮?)的半數(shù)有效濃度（EC50)為26.97 土 6.00nM，CsA的EC50為18.27±4.60nM。但在該濃度范圍內(nèi)，化合物(2)和CsA對LPS誘導的B細 胞增殖卻沒有任何影響（圖4B)。甚至在提高濃度100倍以后(25μΜ)，化合物(2)對人胰腺癌 細胞PANC-1和肺癌細胞Α549的增殖均沒有任何影響（圖4C)。
[0062]化合物(2)對脾細胞的細胞毒性測定表明（圖5C)，化合物(2)在6.25μΜ時開始表現(xiàn) 微弱的細胞毒性(細胞存活抑制率為8.5%)，半數(shù)毒性濃度(1^5())為120.37±17.97以1;(^ 在6.25μΜ時細胞存活抑制率為43.7%，TC 5〇為16.17±4.80μΜ。根據(jù)上述獲得的EC5q值，依次 設(shè)定3、30、300nM三個濃度，對T細胞的特定表面抗原⑶3分子進行FITC標記，采用流式細胞 技術(shù)進一步觀察化合物(2)對T細胞增殖的影響。結(jié)果顯示（圖5A、B):化合物(2)能明顯抑制 Con A引起的脾細胞中T細胞比例的增加，并呈現(xiàn)較好的濃度依賴關(guān)系和時間依賴關(guān)系。
[0063] IL-2和IFN-γ是T細胞活化產(chǎn)生的主要細胞因子，也是T細胞活化的主要標志。進 一步測定IL-2和IFN-γ的細胞分泌情況發(fā)現(xiàn)，化合物2在3nM以上即能濃度依賴性地顯著降 低ConA引起的IL-2和IFN- γ分泌。
[0064] 以上結(jié)果充分表明：化合物2在極低濃度即能選擇性地抑制Τ細胞增殖和活化，其 活性并非其細胞毒性引起。雖然抑制Τ細胞增殖的作用強度不如CsA，但細胞毒性明顯弱于 CSA2JLQ129的治療指數(shù)（Therapeutic index，TI，TC5q/EC5〇) (4463.5)遠大于CsA(885.0)。 因此，化合物2具有高效、低毒、高選擇性的特征，具有較好的研究開發(fā)前景。
[0065]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種新化合物球腔烯胺，其特征是:所述球腔烯胺為黃色針晶，乙腈溶液中旋光度值 為-136°，高分辨質(zhì)譜分子量為376.1399,分子式為C19H21O7N。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新化合物球腔烯胺，其特征是:所述的球腔烯胺由球腔菌素氨 化衍生而來。3. 如權(quán)利要求2所述的新化合物球腔烯胺，其特征是:所述的化合物球腔烯胺的制備方 法為:取純品球腔菌素200mg，于三頸瓶中，冰鹽浴中至0°C，通入氨氣反應(yīng)30分鐘，樣品濃縮 至干，取濃縮后的樣品7克用甲醇溶解，加14g硅膠拌樣上柱，加入洗脫劑為石油醚:氯仿：甲 醇=18:4:1，200-300目硅膠柱層析分離，獲得新化合物球腔烯胺150mg。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的新化合物球腔烯胺，其特征是:所述的球腔菌素為名和氏球腔 菌Mycosphaerella nawae ZJLQ129的次生代謝產(chǎn)物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新化合物球腔烯胺，其特征是：所述的名和氏球腔菌 Mycosphaerella nawae ZJLQ129,保藏名稱為：Mycosphaerella nawae ZJLQ129,保藏單 位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學;保藏日期:2015年9月9日，保 藏號：CCTCC N0:M2015517。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的新化合物球腔烯胺的用途，其特征是:所述的球腔烯胺 具有免疫抑制活性。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的新化合物球腔烯胺的用途，其特征是:所述的球腔烯胺在2nM 濃度下對刀豆蛋白A誘導的T細胞增殖的免疫抑制率為32.4±6.2%。
【文檔編號】A61K31/343GK106045954SQ201610343856
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】王麗薇, 唐婷, 鄭威, 章初龍, 林福呈, 馮曉曉, 陳峰陽
【申請人】杭州師范大學