昆蟲細胞High Five在培養(yǎng)柞蠶核型多角體病毒中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種利用昆蟲細胞High?Five進行柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)及其重組病毒的增殖培養(yǎng)和克隆篩選。High?Five細胞生長速度較快，貼壁較好，通過High?Five細胞篩選病毒，柞蠶蛹體內(nèi)擴增病毒，可以較快速的實現(xiàn)重組病毒的篩選，在利用我國豐富的柞蠶蛹資源，開發(fā)生物、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生以及相關(guān)科研產(chǎn)品等方面有廣闊的應用前景，且能夠有效提高柞蠶業(yè)的產(chǎn)值，增加農(nóng)民收益。
【專利說明】昆蟲細胞H i gh Five在培養(yǎng)柞蠶核型多角體病毒中的應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領域】，具體涉及利用昆蟲細胞High Five進行柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)增殖培養(yǎng)和克隆篩選。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是世界上柞蠶第一生產(chǎn)大國，柞蠶繭年產(chǎn)量在7萬噸左右，生絲及制成品年出口創(chuàng)匯2億美元。隨著市場需求的變化和技術(shù)的不斷進步，柞蠶的經(jīng)濟價值由過去單一的繭絲經(jīng)濟向繭絲+蠶蛹的經(jīng)濟模式轉(zhuǎn)變。柞蠶以蛹期滯育越冬，可長期保存，并且蛹個體大，可開發(fā)成為高效、低廉的生物反應器，從而提高柞蠶蛹的利用價值，這對柞蠶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。在前期的研究中，我們利用昨蠶核型多角體病毒(Antheraea pernyimultinucleocapsid nucleopolyhedrovirus, ApNPV)建立了作香病毒表達載體系統(tǒng)，并在柞蠶蛹體中成功地表達了綠色熒光蛋白，為柞蠶蛹生物反應器的建立及開發(fā)應用奠定了基礎。
[0003]利用柞蠶病毒表達載體系統(tǒng)進行基因表達及產(chǎn)品開發(fā)，其中一個重要的技術(shù)環(huán)節(jié)是使ApNPV病毒能夠感染體外培養(yǎng)的昆蟲細胞，并在細胞中增殖。因此，一個對ApNPV敏感的昆蟲細胞株(系)對這一系統(tǒng)的應用是必不可少的。我們曾建立了對ApNPV敏感的樗蠶(Philosamia cynthia, Pc)細胞系Pc-Ol,并利用這一細胞系成功地篩選了可表達綠色突光蛋白的重組病毒ApNPV-Λ ph/egfp+。Pc-Ol是目前發(fā)表的唯一可以被ApNPV感染的細胞，屬于半貼壁細胞，細胞分生速度慢，傳代周期長[劉淑珊等，樗蠶蛹(Philosamia cynthia)精巢細胞系的建立。蠶業(yè)科學，1999]，影響重組病毒的篩選進程。因此，尋找可貼壁生長、分生速度較快、可被ApNPV感染的細胞是十分必要的，以解決表達系統(tǒng)存在的不足。
[0004]High Five(BT1-TN-5Bl-4)細胞是源自于粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的昆蟲細胞株(Davis et al.，1992`)，目前已商業(yè)化。High Five細胞可用無血清細胞培養(yǎng)基SF-900TM II SFM或完全TNM-FH培養(yǎng)基進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，群體倍增時間18-24小時，細胞可貼壁生長。High Five 可感染 AcNPV (Autographa califomica nuclear polyhedrosisvires, AcNPV)病毒，并形成病毒空斑，主要用于AcNPV表達載體的重組蛋白表達(Growthand Maintenance of Insect Cell Lines, user guide, Cat#B855_02, Invitrogen)。雖然病毒分類上認為AcNPV和ApNPV同屬于昆蟲桿狀病毒，但它們的細胞宿主有很大差別。AcNPV可感染的細胞宿主較多，包括High Five、Sf9和Sf21等昆蟲細胞，但并不感染Pc-Ol細胞，也不能感染柞蠶蛹；而ApNPV的細胞宿主專一，僅能夠感染Pc-Ol細胞及柞蠶，對Sf9和Sf21細胞均不感染。目前尚沒有High Five細胞用于ApNPV感染的相關(guān)研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決柞蠶核型多角體病毒表達載體系統(tǒng)存在的不足，本發(fā)明首次利用昆蟲細胞High Five進行ApNPV的感染、增殖及克隆。High Five細胞生長速度較快，貼壁較好，有利于病毒的篩選。通過High Five細胞篩選病毒，柞蠶蛹體內(nèi)擴增病毒，可以較快速的實現(xiàn)重組病毒的篩選。
[0006]本發(fā)明的一方面在于保護昆蟲細胞High Five在培養(yǎng)柞蠶核型多角體病毒中的應用。所述的柞蠶核型多角體病毒不僅限于自然界分離的野毒株，還包括經(jīng)過基因重組的柞蠶核型多角體病毒。
[0007]對于本發(fā)明所述的上述應用，優(yōu)選的方案是,利用昆蟲細胞High Five進行昨蠶核型多角體病毒或其重組病毒的感染、增殖；或利用昆蟲細胞High Five篩選柞蠶核型多角體重組病毒。其具體方案如下:
[0008]本發(fā)明上文所述的技術(shù)方案中，所述的柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒在HighFive細胞中的增殖方法為:
[0009](1)High Five細胞用完全ΤΝΜ---培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后用吸管輕輕吹打，制成約0.5~1XlO6Ail細胞懸液，再轉(zhuǎn)至細胞培養(yǎng)板中，28°C培養(yǎng)1~2小時，使細胞密度占培養(yǎng)板的80%左右；
[0010](2 )將柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒樣品，用昆蟲無血清細胞培養(yǎng)基SF-900?II SFM,按1:100的體積比稀釋，過濾除菌后獲得柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒的病毒液；
[0011](3)將步驟(1)制備的High Five細胞中的培養(yǎng)基棄去,加入等體積的步驟(2)制備的柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒的病毒液；靜置28°C培養(yǎng)箱中I小時；
[0012](4)將步驟(3)制備的病毒液棄去，加入二倍體積的完全ΤΝΜ---培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)72~96小時。
[0013]利用上述方法，本發(fā)明的實施例中的數(shù)據(jù)表明，柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒(ApNPV-Δ ph/egfp+)在High Five細胞中能夠有效增殖，能夠在顯微鏡下觀察到被感染細胞中病毒包含體的形成，或在熒光顯微鏡下觀察到被感染細胞中產(chǎn)生的綠色熒光。
[0014]本發(fā)明上文所述的技術(shù)方案中，所述的柞蠶核型多角體重組病毒在High Five細胞中的篩選方法為:
[0015](a)將有重組病毒和野生病毒混合感染的柞蠶蛹體液，用昆蟲無血清細胞培養(yǎng)基SF-900? II SFM按照1:100的體積比稀釋，過濾除菌；再將此無菌病毒液10倍梯度稀釋，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7不同濃度病毒液；
[0016](b)分別取步驟(a)制備的梯度稀釋的病毒液感染High Five細胞，1小時后棄去病毒液，加入等體積的2%的低熔點瓊脂糖，待其凝固后，加入等體積的完全TNM-FH培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)4~5天，顯微鏡下觀察病毒發(fā)生情況；
[0017](C)取出上層培養(yǎng)液，選最低病毒濃度感染的細胞孔，用玻璃吸管將個別感染有標記的野生病毒的細胞挑出。將其余的細胞懸浮在少量細胞培養(yǎng)基中，振蕩離心后取上清，注射感染柞蠶蛹，每頭50~lOOul，置22°C，10~12天。使重組病毒得到繁殖擴增，用顯微鏡觀察或PCR檢測方法分析篩選病毒的純度。如需要，可重復此步驟再進行一輪病毒篩選。
[0018]本發(fā)明的實施例中，利用柞蠶核型多角體病毒表達載體系統(tǒng)進行犬干擾素基因的重組病毒的構(gòu)建和表達，其試驗結(jié)果有效的證明，經(jīng)重組病毒感染后，不論是在柞蠶蛹體液，還是在柞蠶蛹組織中均可檢測到犬干擾素基因的表達。證明昆蟲細胞High Five可用于柞蠶核型多角體病毒及相關(guān)重組病毒的培養(yǎng)和篩選。也能夠利用High Five細胞-柞蠶蛹或柞蠶幼蟲實現(xiàn)柞蠶核型多角體病毒及其重組病毒較快速的擴增。在利用我國豐富的柞蠶蛹資源，開發(fā)生物、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生以及相關(guān)科研產(chǎn)品等方面有廣闊的應用前景。一旦得到廣泛應用，將有助于提高柞蠶業(yè)的產(chǎn)值，增加農(nóng)民收益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]本發(fā)明附圖4幅:
[0020]圖1:柞蠶核型多角體病毒感染昆蟲細胞High Five，并形成病毒包含體，其中箭頭所示為病毒包含體；
[0021]圖2:ApNPV_Aph/egfp+病毒在High Five細胞中的增殖曲線；
[0022]圖3:重組病毒 ApNPV- Δ ph/ Δ egfp/Caifn- α + 的 PCR 鑒定；
[0023]圖4:蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測Caifn-α +基因在柞蠶蛹體中的表達。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明做進一步說明，可以使本領域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實例中所涉及的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法或制造商所建議方法；所使用的試劑、材料等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑得到。
[0025]High Five?細胞可從Invitrogen公司購得。無血清細胞培養(yǎng)基SF-900? IISFM可從Invitrogen公司購買，完全TNM-FH培養(yǎng)基由昆蟲培養(yǎng)基Grace’ s InsectMedium, Supplemented補加 10%FBS 配制而成，其中 Grace’s Insect Medium, Supplemented和FBS均可從Invitrogen公司購買。低熔點瓊脂糖(Amresco)為進口分裝產(chǎn)品,可從國內(nèi)各試劑經(jīng)銷公司購買。ApNPV病毒株為本實驗室分離、并通過感染柞蠶蛹保存于-80°C [FanQjet al.The genome sequence of the multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus ofthe Chinese oak silkworm, Antheraea perny1.Virology，2007]，本領域的研究人員也可以從自然感染ApNPV的柞蠶蛹中分離獲得該病毒。柞蠶蛹可從市場上購得。感染ApNPV的柞蠶蛹是通過將ApNPV穿刺接種至新鮮柞蠶蛹，并在室溫中培養(yǎng)兩周制備而成。
[0026]實施例1
[0027]ApNPV 感染昆蟲細胞 High Five
[0028](I)High Five細胞用完全ΤΝΜ-Π1培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的HighFive貼壁細胞用吸管輕輕吹打，制成約0.5~IXlO6Ail細胞懸液。取細胞懸液加入到6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔約1ml，靜置28°C培養(yǎng)箱中I~2小時，使細胞密度占培養(yǎng)板的80%左右。
[0029](2)ApNPV取自感染ApNPV的柞蠶蛹。取感染ApNPV的柞蠶蛹體液，用昆蟲無血清細胞培養(yǎng)基SF-900? II SFMl: 100 (v: v)稀釋，過濾除菌，備用。
[0030](3)將步驟(1)制得的6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的High Five細胞中的培養(yǎng)基取出，在每孔中加入Iml稀釋的步驟(2)制得的病毒液，靜置28°C培養(yǎng)箱中I小時。
[0031](4)將步驟(3)制得的感染的病毒液取出，更換2ml完全ΤΝΜ---培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4~5天。顯微鏡下觀察被ApNPV感染的High Five細胞中病毒包含體的形成，如圖1，結(jié)果首次證明ApNPV對昆蟲細胞High Five具有感染性。
[0032]實施例2[0033]柞蠶核型多角體病毒(ApNPV-Λ ph/egfp+)在High Five細胞中的增殖
[0034](I)High Five細胞用完全ΤΝΜ-Π1培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的HighFive貼壁細胞用吸管輕輕吹打，制成約0.5~IXlO6Ail細胞懸液。取細胞懸液加入到6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔約1ml，靜置28°C培養(yǎng)箱中I~2小時，使細胞密度占培養(yǎng)板的80%左右。
[0035](2)取感染ApNPV-Λ ph/egfp+病毒[王林美等，利用柞蠶核型多角體病毒表達載體系統(tǒng)在柞蠶蛹中表達增強型綠色熒光蛋白?！缎Q業(yè)科學》，2010]的柞蠶蛹體液，用昆蟲無血清細胞培養(yǎng)基SF-900? II SFMl: 100 (v: v)稀釋，過濾除菌，備用。
[0036](3)將6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的High Five細胞中的培養(yǎng)基取出，在每孔中加入Iml稀釋的ApNPV-Λ ph/egfp+病毒液，靜置28°C培養(yǎng)箱中I小時。
[0037](4)將感染的病毒液取出，更換2ml完全TNM-FH培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，此時開始計算病毒感染時間。
[0038](5)按病毒感染后8、16、24、48、72、96和120小時分別收集感染病毒的High Five細胞，提取細胞的基因組DNA，用于分析病毒的增殖情況。
[0039](6)采用熒光實時定量PCR(Real-Time PCR，RT-PCR)方法，按綠色熒光蛋白基因(egfp)序列設計特異性引物，Pegfp-f:5’ -GGAGCGCACCATCTTCTTC-3’ (SEQ ID N0.1)；Pegfp-r:5’-AGTTCACCTT GATGCCGTTCTT-3’(SEQ ID N0.2)。擴增并克隆目的片段，構(gòu)建定量標準質(zhì)粒，建立定量的標準曲線。Real-Time PCR反應采用SYBRr Premix EX Taq GC試劑盒進行，反應體系為:總體積20ul，包括SYBRa Premix EX Taq GC (2X ),10.0ul ；PCRForward Primer (IOuM),0.4ul ；PCR Reverse Primer (IOuM)0.4ul ；R0X Reference Dye(50X)，0.4ul ;模板 2ul (50ng);無菌水 6.8ul。反應條件:95°C，30 秒，一個循環(huán)；95°C，5秒，60°C，30秒，40個循環(huán)。
[0040](7)以感染ApNPV-Λ ph/egfP+不同時間的High Five細胞基因組DNA為模板，用綠色熒光蛋白基因(egfp)特異性引物進行熒光實時定量PCR反應。根據(jù)檢測結(jié)果，參照制定的標準曲線，計算病毒的拷貝數(shù)，并繪制病毒增殖曲線，如圖2。圖2的結(jié)果顯示隨著感染時間增加，柞蠶核型多角體病毒在High Five細胞中不斷增值，感染72小時后，病毒增殖進入平臺期，以后略有增加。實驗結(jié)果證明High Five細胞不僅能夠被柞蠶核型多角體病毒感染，而且病毒能夠在該細胞中增殖。這為利用High Five細胞進行昨蠶重組病毒的培養(yǎng)和篩選提供了依據(jù)。
[0041]實施例3
[0042]利用High Five細胞進行犬干擾素基因的重組病毒的篩選
[0043](I)利用柞蠶病毒表達載體pApM748BE[王林美等，利用柞蠶核型多角體病毒表達載體系統(tǒng)在柞蠶蛹中表達增強型綠色熒光蛋白?！缎Q業(yè)科學》，2010]構(gòu)建N-端帶有6xHis標簽的犬干擾素成熟肽段(interferon-alpha, CaIFN- α，GenBank:Μ28624.1)基因表達質(zhì)粒pApM748BE/CaIFN- α。具體方法是:根據(jù)編碼6xHis短肽堿基序列和犬干擾素成熟肽段基因序列，設計一對特異性引物。序列如下:上游引物序列、J、j 55-CACGOATCCATGCACCATCATCATCATCATTGCCACCTGCCCGACACCCA^5(SI'Q ID NO:3)(引物序列中上游5’端前三個堿基為保護堿基，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶BamH I識別序列，隨其后的部分為ATG和編碼6xHis短肽堿基序列，最后黑體部分為犬干擾素成熟肽段基因5’端上游序列)；下游引物序列為5-CTCGAATTCTCATTTCCTCCTCCTGATTCT-3 (seq ID NO:4)(引物序列中
上游5’端前三個堿基為保護堿基，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶EcoR I識別序列，后面黑體部分為犬干擾素成熟肽段基因終止序列和3’端下游序列)。利用這組引物，以犬白細胞組織cDNA為模板，進行常規(guī)PCR擴增；特異性PCR產(chǎn)物經(jīng)過序列分析確認后，用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切，純化回收酶切產(chǎn)物，與同樣經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切的表達載體質(zhì)粒pApM748BE進行連接；連接產(chǎn)物經(jīng)細菌轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒鑒定，獲得犬干擾素表達質(zhì)粒pApM748BE/CaIFN- α。提取質(zhì)粒DNA，紫外分光光度計定量，供轉(zhuǎn)染用。
[0044](2)將提取的質(zhì)粒DNA與帶有熒光蛋白基因的柞蠶病毒基因組DNA (ApNPV-Λ ph/egfp+DNA)等量混合，用轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin將混合的DNA直接轉(zhuǎn)染至昨蠶蛹中，室溫15-20天。待蛹體發(fā)病后，取發(fā)病蛹體液，再次轉(zhuǎn)接感染新的柞蠶蛹，使病毒得到擴增，用于后續(xù)的重組病毒的分離篩選。
[0045](3)將有重組病毒和野生病毒混合感染的柞蠶蛹體液，用昆蟲無血清細胞培養(yǎng)基SF-900? II SFMl:100 (V: V)稀釋，過濾除菌。再將此無菌病毒液10倍梯度稀釋，配制成10'10'10'10'10'Kr6和10〃不同濃度病毒液。取Iml不同濃度病毒液感染High Five細胞，I小時后，取出病毒液，加入Iml2%的低熔點瓊脂糖，待瓊脂糖凝固后，加入Iml完全TNM-FH培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4~5天，熒光顯微鏡下觀察病毒發(fā)生情況。
[0046](4)取出上層培養(yǎng)液，選最低病毒濃度感染的細胞孔，用玻璃吸管將個別有綠色熒光蛋白基因表達的病毒感染的細胞挑出。將其余的細胞懸浮在少量細胞培養(yǎng)基中，振蕩離心后取上清，注射感染柞蠶蛹，每頭50~lOOul，置22°C，10~12天。使重組病毒得到繁殖擴增，用顯微鏡觀察或PCR檢測方法分析篩選病毒的純度。如需要，可重復此步驟再進行一輪的病毒篩選?？寺〉闹亟M病毒應帶有犬干擾素基因，而沒有綠色熒光蛋白基因，ApNPV-Aph/Λ egfp/Caifn-α+`，如圖3。圖3的結(jié)果顯示，用PCR方法鑒定經(jīng)過純化的重組病毒ApNPV- Δ ph/ Δ egfp/Caifn- α +只含有犬干擾素基因，沒有綠色熒光蛋白基因。
[0047](5)將重組病毒感染柞蠶蛹，室溫10-15天后，分別取病毒蛹體液和組織進行蛋白質(zhì)凝膠電泳，并采用蛋白質(zhì)免疫印跡方法，用抗His標簽抗體檢測犬干擾素基因的表達，如圖4。圖4的結(jié)果顯示經(jīng)重組病毒感染后，不論是在柞蠶蛹體液，還是在柞蠶蛹組織中均可檢測到犬干擾素基因的表達。證明昆蟲細胞High Five可用于柞蠶核型多角體病毒及相關(guān)重組病毒的培養(yǎng)和篩選。
【權(quán)利要求】
1.昆蟲細胞HighFive在培養(yǎng)柞蠶核型多角體病毒中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用為利用昆蟲細胞HighFive進行柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒的感染、增殖；或利用昆蟲細胞High Five篩選基于柞蠶核型多角體病毒而產(chǎn)生的相關(guān)重組病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于:所述的柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒在High Five細胞中的增殖方法為: (1)HighFive細胞用完全ΤΝΜ---培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后制成0.5~IXlO6Ail細胞懸液，再轉(zhuǎn)至細胞培養(yǎng)板中，26-28°C培養(yǎng)I~2小時，使細胞密度占培養(yǎng)板的 70-80% ； (2)將柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒樣品，用昆蟲無血清細胞培養(yǎng)基SF-900?IISFM，按1:100的體積比稀釋，過濾除菌后獲得柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒的病毒液； (3)將步驟(1)制備的HighFive細胞中的培養(yǎng)基棄去,加入等體積的步驟(2)制備的柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒的病毒液；靜置28°C培養(yǎng)箱中I小時； (4)將步驟(3)制備的病 毒液棄去，加入二倍體積的完全ΤΝΜ---培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)72~96小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于:所述的柞蠶核型多角體重組病毒在HighFive細胞中的篩選方法為: (a)將有重組病毒和野生病毒混合感染的柞蠶蛹體液，用昆蟲無血清細胞培養(yǎng)基SF-900? II SFM按照1:100的體積比稀釋，過濾除菌獲得無菌病毒液，將無菌病毒液進行10倍梯度稀釋； (b)分別取步驟(a)制備的梯度稀釋的病毒液感染HighFive細胞，I小時后棄去病毒液，加入等體積的2%的低熔點瓊脂糖，待其凝固后，加入等體積的完全TNM-FH培養(yǎng)基，280C培養(yǎng)4~5天，顯微鏡下觀察病毒發(fā)生情況； (c)取出上層培養(yǎng)液，選最低病毒濃度感染的細胞孔，用玻璃吸管將個別感染有標記的野生病毒的細胞挑出；將其余的細胞懸浮在細胞培養(yǎng)基中，振蕩離心后取上清，注射感染柞蠶蛹，每頭50~IOOul，置22 °C條件10~12天，使重組病毒繁殖，用顯微鏡觀察或PCR檢測方法分析篩選病毒的純度。
5.根據(jù)權(quán)利要求2~4中任一項所述的應用，其特征在于:所述的柞蠶核型多角體重組病毒是柞蠶核型多角體病毒ApNPV- Δ ph/egfp+，或柞蠶核型多角體病毒ApNPV- Δ ph/Δegfp/Caifn-α +。
【文檔編號】C12N7/00GK103555675SQ201310562776
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】范琦, 趙振軍, 王林美, 葉博, 岳冬梅, 張波, 李樹英 申請人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學院大連生物技術(shù)研究所