專利名稱：粉紋夜蛾細胞系的克隆株及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及昆蟲細胞系的克隆株，尤其涉及粉紋夜蛾細胞系的一個新克隆株，本 發(fā)明還涉及該克隆株在制備殺蟲病毒或重組蛋白中的用途，屬于昆蟲細胞生物學和生物技 術領域。
背景技術：
自 1962 年 Grace 建立了第一個昆蟲細胞系以來(Grace Τ. D. C. 1962, Nature, 195 :788-789)，利用Grace的昆蟲細胞培養(yǎng)基或改良的Grace培養(yǎng)基已在100余種昆蟲 中建立了 600 余株昆蟲細胞系(Chih-Yuffu,2006, J. Invert. Pathol. ,93 186-191)。昆蟲 細胞系最初用于昆蟲病毒的研究，隨著研究的不斷開展，昆蟲細胞應用范圍不斷擴大，特 別是桿狀病毒一昆蟲細胞表達載體系統(tǒng)(Thebaculoviruses—insect cell expression system)的發(fā)明，使其成為廣泛應用于真核蛋白表達最有效的手段之一(Summers，M. D.等， 1987，TexasAgricultural Experiment Station Bulletin, 1555 ；O^reillyiD.R.等，1992， Baculoviruses Expression Vector :A Laboratory Manual, W. H. Freeman and company, New York, NY, USA)，該系統(tǒng)的優(yōu)點是桿狀病毒載體能誘導大量重組蛋白產(chǎn)生，而昆蟲細胞 又有加工蛋白的能力，同時昆蟲桿狀病毒對哺乳動物安全。但是由于這些蛋白生產(chǎn)是在病 毒侵染后在寄生細胞內持續(xù)進行，所以寄主細胞的生理特性(懸浮或貼壁性狀，分泌能力 和翻譯水平等)可直接影響蛋白表達或病毒產(chǎn)量。目前人們已利用幾種昆蟲細胞系成功的表達和生產(chǎn)多種病毒和重組蛋白(前列 腺癌，淋巴癌，宮頸癌，肝炎等疾病的疫苗)(Granados，R. R等，1994，J. Invert. Pathol.， 64 -.260-266 ；Altman, F.等 1999, Glycoconj, J. ，16 109-123 Jarvis, D. L. ，1997, in L.Miller 等，The Baculoviruses :389_431，Plenum Press. NY，USA)。雖然目前已建立 600 余株細胞系，但由于其特性不同，包括生長特性，對病毒的受納性，重組蛋白表達等，適合上 述應用條件的細胞株還很少。目前僅限于草地貪夜蛾細胞系IPLB-Sf-21及其克隆株Sf-9 和粉紋夜蛾細胞株 ΒΤΙ-Τη5Β1-4(商品名稱 High Five 即 Hi 5) (Gardiner, G. R.，1975， J. Invert. Pathol. ,25 :363_369 ； 1970，J Invert. Pathol.，16 :284_228 ；Vaughn, J. h.等， 1977，In Vitro. 13 :213_217)。Tn5Bl_4 細胞是從 Tn5Bl 中克隆出的新細胞系(Granados, R. R.，等 1986 Virology, 152 :472_476 ； 1994，J. Invert. Pathol.，64 :260_266)，Τη5Β1_4 細 胞與Sf-21和Sf-9細胞比較，它具有對AcMNPV病毒更敏感，產(chǎn)量高，對多種重組蛋白有高 表達水平。最近又通過對Τη5Β1-4細胞的進一步克隆，獲得兩個新細胞克隆株H5CL-B和 H5CL-F (Li Guoxun 等，2003，Bioprocessing, 2 (1) :58_62)，它們比野生型細胞 Τη5Β1_4 有 更優(yōu)良的特性，其重組蛋白表達可提高1-2倍。從中可以看出，對已建立的細胞系進行再克 隆和篩選，仍然可以獲得更優(yōu)良的新克隆株。雖然上述細胞系目前被廣泛應用，但還存在某些缺點而影響產(chǎn)量和表達，因此，需 要不斷改善。首先Sf-21和Sf-9細胞系無論在病毒產(chǎn)量(OB)和重組蛋白表達都遠不如 Τη5Β1-4細胞，而Τη5Β1-4細胞雖然有較高的病毒產(chǎn)量和重組蛋白表達水平，但由于培養(yǎng)過程中有很強的貼壁特性而大量結塊，不適于懸浮大量培養(yǎng)，而影響病毒產(chǎn)量和重組蛋白表 達。本發(fā)明人新建立了一株懸浮培養(yǎng)細胞系QB-TN9-4S(Ming Mengjuan等，2008，Inseet Science, 15 :423_428)，該懸浮培養(yǎng)細胞系雖然有更好的性狀，但該細胞系來自于胚胎，細 胞組分復雜，個體間的特性差異很大，使這一混合細胞群體不能發(fā)揮某些個體的更優(yōu)良特 性。為此，對這一細胞系進行克隆和篩選。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決技術的問題是目前所使用的細胞系Sf-21，Sf-9和HighFive在培 養(yǎng)過程中由于強烈貼壁而不適于懸浮大量培養(yǎng)從而影響病毒和重組蛋白生產(chǎn)的問題，篩選 出一株粉紋夜蛾細胞系的克隆株，從而克服懸浮培養(yǎng)中細胞聚結成塊問題，進一步提高表 達水平。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的 一株粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞系的克隆株(QB-TN9-4S-CL-B)，其微生物 保藏號是CCTCC C201046 ；分類命名是粉紋夜蛾；保藏時間是2010年5月24日；保藏單 位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址是武漢大學；利用細胞克隆是改善細胞，篩選具有更優(yōu)良特性的新細胞系良好途徑。為此，本 發(fā)明通過細胞克隆的方法，篩選出新的細胞克隆株(QB-TN9-4S-CL-B，簡稱為“QB-CL-B”)。 本發(fā)明所克隆的細胞克隆株在完全培養(yǎng)基(TNM-FM)中培養(yǎng)，其形態(tài)特征在對數(shù)生長期與 野生型細胞差別不明顯，以梭形細胞為主(80%以上)。從細胞的生長特性可以看出，該細 胞克隆無緊密貼壁特性，為懸浮細胞克隆株，在懸浮培養(yǎng)時不結成團，有利于病毒附著和侵 染，同時能提高病毒及重組蛋白的生產(chǎn)。比目前廣泛應用的High Five細胞有明顯的改善。 QB-TN9-4s-CL-B細胞株生長最大密度在第五天達到1. 55X IO6細胞/ml，略高于野生型和 High Five細胞系。該克隆株的群體倍增時間與High Five和野生型細胞比較無明顯差異。本發(fā)明細胞克隆株對AcMNPV病毒高度敏感，可與High Five細胞相比較，該克 隆株的多角體(OB)產(chǎn)量顯著高于廣泛應用的SF-9細胞，為Sf-9細胞的2. 9倍(平均為 1050Bs/細胞)。為病毒殺蟲劑生產(chǎn)提供良好的資源，與利用Sf-9細胞生產(chǎn)比較，可大大降 低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的細胞克隆株與野生型細胞和High Five細胞相比較，表現(xiàn)顯著的高表達 水平，其中重組蛋白β "gal表達約是上述細胞的1. 2倍和2. 0倍(第6天)；而SEAP的表 達分別為上述細胞的3.0倍和1.2倍(第7天)。是某些重組蛋白生產(chǎn)的良好載體，也是 High Five細胞的良好替代產(chǎn)品。本發(fā)明的細胞克隆株可應用于生產(chǎn)重組蛋白或殺蟲病毒，包括構建含有目的基 因的重組表達載體或重組病毒；將該重組表達載體或重組病毒轉化到所述的細胞克隆株 中，進行懸浮培養(yǎng)。所述的重組蛋白可以是重組β -半乳糖苷酶(β -galactoridase)或重組堿性磷 酸酶(secreted SEAP)；或者是農(nóng)業(yè)，醫(yī)藥或其它領域中所需要的蛋白。所述的殺蟲病毒包括能感染該細胞的所有昆蟲病毒，優(yōu)選的，所述的殺蟲病毒是 作為生物殺蟲劑的Y紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)。


圖1細胞的形態(tài)特征Α.野生型細胞QB-Tn9-4s ；B.克隆株QB-TN9-4s-CL_B ； C. Tn5Bl-4 (High Five)細胞。圖 2 生長曲線野生型細胞 Q B-TN9-4S，克隆株 QB-TN9-4s-CL_B 和 Tn5Bl_4(High Five)細胞。圖3病毒感染Α.野生型細胞QB-Tn9-4s ；B.克隆株QB-TN9-4s-CL_B ； C. Tn5Bl-4 (High Five)細胞。圖 4β -galactoridase 表達野生型細胞 QB-TN9-4S，克隆株 QB-TN9-4s-CL_B 和 Tn5Bl-4(High Five)細胞。圖 5secreted SEAP 表達野生型細胞 QB-TN9-4S，細胞克隆株 QB-TN9-4s-CL_B 和 Tn5Bl-4(High Five)細胞。圖6利用4種引物進行DNA分析引物:A.引物0PU-09 ；B.引物0PU-10 ；C.引物No. 2 ；D.特異性引物T. ni ；樣本1. DNA分子量標準；2.粉紋夜蛾卵的DNA ；3.野生型QB-Tn9_4s的DNA ；4.克 隆株 QB-Tn9-4s-CL-B 的 DNA ；5. Tn5Bl-4 (High Five)的 DNA ；6. Sf-9 的 DNA。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實施例1細胞克隆株QB-TN9-4S-CL-B (QB-CL-B)的分離克隆及鑒定1. 1粉紋夜蛾細胞系QB-TN9-4S的建立按照Ming-Juan Meng的方法(2008， Insect Science, 15 :423_428)，取實驗室培養(yǎng)的粉紋夜蛾種群的新鮮卵，分別用10%次氯 酸鈉和75%酒精表面消毒5分鐘，再用TNM-FH(GIBCO，USA)培養(yǎng)基洗兩次后，卵被轉移到 一個細胞濾網(wǎng)器(BD Falcon,USA)并將濾網(wǎng)器放入有IOml培養(yǎng)基的平皿中，將細胞充分磨 碎后，將卵組織濾液稀釋成不同濃度，分裝于25cm2的培養(yǎng)瓶(Corningjew York,USA)中。 置28°C培養(yǎng)。每2周更換一半新鮮培養(yǎng)基。5個月后，當形成的細胞鋪滿瓶底后進行第一 次傳代，待細胞生長穩(wěn)定后，每周傳代兩次。1. 2 細胞克隆按 Guoxun Li 等的方法(2003，Bioprocessing，2 (1) :35_38)，將 91 代野生型細胞QB-TN9-4S培養(yǎng)三天，懸浮并用血球計數(shù)板計數(shù)，將細胞稀釋到需要的濃度， 然后將該細胞懸浮液加入到細胞克隆板(Greiner Labotechnik, Germany)中，28°C靜置培 養(yǎng)2小時后，在倒置相差顯微鏡下(Olympus，1X71. Japan)觀察，并標記下該克隆版中只有 一個細胞的所有小方格，每天觀察這些細胞的生長情況和分裂情況。待細胞增殖到鋪滿小 格底部時，用移液槍頭小心吸出，轉入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞鋪滿小孔底部后，再轉入24 孔板中，同樣，待鋪滿底部時，在轉入25cm2培養(yǎng)瓶中，按常規(guī)進行培養(yǎng)，即獲得細胞克隆株。1 · 3細胞基因組DNA的RAPD-PCR分析參照Mingjuan Meng 的方法(2008，Insect Science, 15 :423_428)，利用 DNA 純 化試劑盒(Τ0Υ0Β0 Osaka, Japan)，按說明書的步驟和方法，提取各樣品的DNA。選擇4種隨機引物進行 RAPD-PCR 鑒定0PU-09(5，-CCACATCGGT-3，) ；OPU-IO (5‘ -ACCTCGGCAC-3，) [Wu&Wang，2006] ；Primer No.2(5， 一CCGCATCTAC—3， )[Kawai&Mitsuhashi，1977],禾口 T. niSpecific primer (5，-TTGCTGTCCA-3，)[Lietal. 2003]·該 PCR 產(chǎn)物通過 1. 2% 的瓊月旨 糖電泳分析。試驗結果見圖6。1. 4細胞克隆株的形態(tài)和生物學特性a.細胞形態(tài)細胞在完全培養(yǎng)基ΤΝΜ- 中，28°C條件下培養(yǎng)3天，正置對數(shù)生長 期。在倒置相差顯微鏡(Olympus，1X71，Japan)下觀察細胞形態(tài)，貼壁或懸浮情況，測定細 胞大小。
細胞克隆株在完全培養(yǎng)基(TNM-FM)中培養(yǎng)，在對數(shù)生長期與野生型細胞形態(tài)差 別不明顯，以梭形細胞為主(80%以上)。QB-CL-B的大小為18. 4X49. 4mm，略大于目前廣 泛應用的High-five細胞系(16. 6X38. 4mm)這也是它具有高產(chǎn)特性的原因之一(圖1)。b.細胞生長按 Robert R. Granados.的方法(1994，J. Invert. Pathol. ,64 260-266)，測定細胞生長曲線和群體倍增時間。將對數(shù)生長期的細胞按1.0 X IO6細胞/5ml 培養(yǎng)基的濃度接入25cm2培養(yǎng)瓶中，28°C條件下培養(yǎng)，每24小時取樣測定細胞濃度。根據(jù) 記錄結果繪制細胞生長曲線，并按公式T = l/K(log N = LogN0+K+log2)計算出群體倍增 時間(T)從細胞的生長特性可以看出，該細胞克隆株無緊密貼壁特性，為懸浮細胞克隆，在 懸浮培養(yǎng)時不結成團。有利于病毒附著和侵染同時能提高病毒及重組蛋白的生產(chǎn)。與目 前廣泛應用的High Five細胞有明顯的改善。QB-CL-B細胞生長最大密度在第五天達到 1.55 X IO6細胞/ml略高于野生型和High Five細胞系。細胞克隆株的群體倍增時間與High Five和野生型細胞比較無明顯差異(圖2)。試驗例1本發(fā)明克隆株的病毒感染滴度(TCID50)和多角體(OB)產(chǎn)量測定根據(jù)PingWang 的方法(1992，J. Invert. Pathol. ,59 :46_53)，利用 AcMNPV-lA (苜 蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒)為毒源(Boyce Thomason Institate,Cornell University, Ithaca，NY，USA)，以 MOI = 10 (Multiplicity oflnfection)的感染指數(shù)接種對數(shù)期細胞， 28°C下培養(yǎng)，每天觀察感染狀況，3天后將其懸浮，離心后，上清樣品用于測定滴度；培養(yǎng)4 天后，多角體完全形成，細胞尚未破裂時，在顯微鏡下觀察并計算感染率。最后用超聲波裂 解細胞，釋放出全部多角體后，用血球計算板計數(shù)可獲得多角體產(chǎn)量(OBs/ml)。試驗結果本發(fā)明細胞克隆株QB-CL-B對AcMNPV病毒敏感性和High Five細胞 比較無明顯差異。在感染后4天測定。感染率平均在94%以上。此時QB-CL-B細胞已有 50%細胞裂解，并釋放出多角體到培養(yǎng)基中。出芽性病毒(BV)的產(chǎn)量，細胞株間差異不顯 著，約為3.0X107TCID50/ml.細胞克隆株的多角體(OB)產(chǎn)量顯著高于廣泛應用的SF-9細 胞(37. 60Bs/細胞)，為Sf-9細胞的2. 9倍(平均為1050Bs/細胞)。為病毒殺蟲劑生產(chǎn) 提供良好的資源。與利用Sf-9細胞生產(chǎn)比較，可大大降低生產(chǎn)成本(圖3)。試驗例2重組蛋白在本發(fā)明細胞克隆株中的表達試驗一、試驗方法按照Wickham 和 David 的方法(1992，Bio/technology, 10 1148-1150 ； 1993， In Nitro Cell Dev. Biol. 29A :388_390)，重組蛋白堿性磷酸酶(SEAP)和半乳糖苷酶 β -galactoridase ( β -gal.)表達水平被測定。
a. SEAP表達的測定將對數(shù)生長期的細胞按2. 0 X IO5細胞/孔的量接 入24孔板中，待細胞沉淀瓶底時，輕輕吸除培養(yǎng)基。按MOI = 10的侵染指數(shù)接入 重組病毒AcMNPV-SEAP，每24小時取樣，在0D405的光密度下測定表達量，根據(jù)公式
權利要求
一株粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞系的克隆株，其微生物保藏號是CCTCC C201046。
2.權利要求1所述的克隆株在制備殺蟲病毒或重組蛋白中的用途。
3.按照權利要求2所述的用途，其特征在于直接利用殺蟲病毒感染所述的細胞克隆 株，進行懸浮培養(yǎng)，進行殺蟲病毒的大量生產(chǎn)。
4.按照權利要求2所述的用途，其特征在于構建含有目的基因的表達載體或重組病 毒，將該重組表達載體直接轉化到所述的細胞克隆株或用重組病毒侵染所述的細胞克隆 株，然后懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)重組蛋白。
5.按照權利要求2和4所述的用途，其特征在于所述的重組蛋白是半乳糖苷酶 或其他用途的重組蛋白。
6.按照權利要求2和4所述的用途，其特征在于所述的重組蛋白是堿性磷酸酶。
7.按照權利要求2和4所述的用途，其特征在于所述的殺蟲病毒是Y紋夜蛾核型多 角體病毒或其它種類的殺蟲病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了粉紋夜蛾細胞系的克隆株及其用途。本發(fā)明細胞克隆株的微生物保藏號是CCTCC C201046；本發(fā)明克隆株無緊密貼壁特性，在懸浮培養(yǎng)時不結成團，有利于病毒附著和侵染從而顯著提高病毒及重組蛋白的產(chǎn)量，與野生型細胞(QB-TN9-4s)和目前國際上廣泛應用的High Five細胞比較，表現(xiàn)顯著的高表達水平，其重組蛋白表達是上述細胞的1.2-3.0倍，本發(fā)明克隆株可應用于生產(chǎn)重組蛋白或殺蟲病毒。本發(fā)明克隆株對病毒敏感性及病毒產(chǎn)量都很高，可與High Five細胞相當，但該克隆株的多角體產(chǎn)量顯著高于另一個廣泛應用的SF-9細胞，為Sf-9細胞的2.9倍。
文檔編號C12N5/07GK101935634SQ201010194398
公開日2011年1月5日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權日2010年6月8日
發(fā)明者吳艷蕾, 周洪旭, 姜磊, 崔英偉, 李國勛, 李淑文, 李長友, 鄭桂玲, 馬明 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學