含有pdgf的ds細胞用無血清培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)真皮鞘(DS)細胞的、包含血小板衍生生長因子(PDGF)的無血清培養(yǎng)基，或使用了包含PDGF的無血清培養(yǎng)基的、用于培養(yǎng)DS細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在美麗的外觀方面，毛發(fā)極為受到重視。因此，先天或后天因素造成的脫發(fā)或頭發(fā)稀少對許多人來說是深刻的苦惱。特別是在被稱為高齡化社會、壓力社會的現(xiàn)代社會，頭部毛發(fā)由于各種各樣的后天原因而暴露于脫發(fā)危機的機會越來越多。與此相應地，為了給苦于脫發(fā)癥、頭發(fā)稀少的人們提供安全且有效地用于再生毛囊的美容或醫(yī)療的方法，進行了各種嘗試。
[0003]毛囊是成熟的生物體在幾乎整個生涯中反復自身再生的例外器官。闡明其自身再生的機制，作為與通過組織、細胞移植進行的脫發(fā)治療、含有毛囊、皮脂腺的自然上接近且功能也優(yōu)異的皮膚片的構(gòu)建等需求高的臨床應用相聯(lián)系的研究而被期待。近年，隨著對干細胞研究的關(guān)注提高，毛囊上皮干細胞(上皮細胞)的研究迅速發(fā)展，另外對于作為毛囊特異性間充質(zhì)系細胞的毛乳頭細胞，其性質(zhì)也漸漸被判明。已判明毛乳頭細胞承擔為了毛囊的自身再生而向毛囊上皮干細胞送出激活信號的所謂司令塔的作用，在毛囊再構(gòu)成評價體系中與毛囊上皮干細胞都是不可缺少的細胞(Kishimoto等，Proc.Natl.Acad.Sc 1.USA(1999) ,Vol.96,pp.7336-7341 ；非專利文獻 1)。
[0004]毛乳頭(DP: dermal papi 1 la)、以及包圍毛囊的周圍的真皮鞘(DS: dermalsheath)均與構(gòu)成毛囊的大部分的上皮系細胞不同，由來源于間充質(zhì)系的細胞群構(gòu)成。關(guān)于DS細胞，近年來大量報告了暗示其對毛囊形成的重要性的知識。還報告了在毛乳頭大鼠胡須的毛球部切斷毛囊移植實驗中由DS細胞再生DP細胞，在小鼠中通過移植切斷了下半部分的毛囊的DS細胞能誘導毛囊再生。另外、Jahoda等(Development.1992Apr: 114(4):887-97；非專利文獻2)還報告了通過將DS細胞移植到人能夠誘導毛囊的再構(gòu)建(Horne KA和JahodaCA.，Development.1992 Nov:116(3): 563-71 ；非專利文獻3)。進而Tobin、Paus等的課題組報告了在小鼠毛發(fā)周期中DS細胞與DP細胞之間發(fā)生細胞移動，在生毛期開始增殖的DP細胞之前，DS細胞就已經(jīng)開始增殖(Tobin DJ等，J.1nvest.Dermatol.,120:895-904，2003；非專利文獻4)。
[0005]這樣，雖然DS細胞很可能對毛囊形成發(fā)揮重要作用，但關(guān)于其作用機理尚未充分判明。為了弄清楚對毛囊形成的作用機理，需要大量獲得DS細胞，但由于能夠從生物體組織采集的細胞的數(shù)量少，因此需要將這些細胞在生物體外培養(yǎng)并使其高效地增殖。一般地，為了培養(yǎng)DS細胞，使用添加了促進細胞增殖、與培養(yǎng)容器的粘附的血清的培養(yǎng)基，但在這樣的條件下，可能抗原性發(fā)生變化、混入病原體，另外，還可能由于血清中的詳細情況不明的微量成分而造成實驗結(jié)果的偏差，因而不適合向再生醫(yī)療的臨床應用、向制藥.毒性試驗等的應用。
[0006]近年，隨著對再生醫(yī)療的關(guān)注的提高，進行了各種間充質(zhì)系干細胞的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基的開發(fā)(參照例如日本特開2006-311814號公報(專利文獻1)、日本特開2006-325445號公報(專利文獻2)、日本特開2005-151237號公報(專利文獻3))，但是關(guān)于用于培養(yǎng)DS細胞的、含有血小板衍生生長因子(PDGF)的無血清培養(yǎng)基尚不為人們所知。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0008]專利文獻
[0009]專利文獻1:日本特開2006-311814號公報
[0010]專利文獻2:日本特開2006-325445號公報
[0011]專利文獻3:日本特開2005-151237號公報
[0012]專利文獻4:日本特開平7-274950號公報
[0013]非專利文獻
[0014]非專利文獻1:Kishimoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)，Vol.96，pp.7336-7341
[0015]非專利文獻2:Jahoda CA等，Development.1992Apr; 114(4): 887-97.
[0016]非專利文獻3:HorneKA和Jahoda CA.development.1992Nov； 116(3):563-71.
[0017]非專利文獻4:TobinDJ等，J.1nvest.Dermatol.，120:895-904,2003
[0018]非專利文獻5:NoburoSato等，Nature Medicine Vol.10,N0.1, Jan.2004.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]發(fā)明要解決的課題
[0020]本發(fā)明的課題是提供適合DS細胞的培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。
[0021 ]用于解決課題的技術(shù)方案
[0022]本發(fā)明者獲得了通過用添加了TOGF、特別是TOGF-BB的無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，能夠使DS細胞有意義地增殖這樣的令人驚訝的知識。
[0023]因此，本申請包含以下發(fā)明:
[0024][1]—種無血清培養(yǎng)基，是用于培養(yǎng)真皮鞘(DS)細胞的無血清培養(yǎng)基，包含血小板衍生生長因子(PDGF)。
[0025][2]根據(jù)[1 ]所述的無血清培養(yǎng)基，所述PDGF是PDGF-BB。
[0026][3]根據(jù)[1]或[2]所述的無血清培養(yǎng)基，所述真皮鞘(DS)細胞來源于真皮鞘杯(DSC)區(qū)域。
[0027][4]—種用于培養(yǎng)真皮鞘(DS)細胞的方法，使用了包含血小板衍生生長因子(PDGF)的無血清培養(yǎng)基。
[0028][ 5 ]根據(jù)[4]所述的方法，所述PDGF是PDGF-BB。
[0029][6]根據(jù)[4]或[5]所述的方法，所述真皮鞘(DS)細胞來源于真皮鞘杯(DSC)區(qū)域。
[0030]發(fā)明的效果
[0031 ]通過本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基，能夠高效地培養(yǎng)適合向再生醫(yī)療的臨床應用、向制藥.毒性試驗等的應用的DS細胞。
【附圖說明】
[0032]圖 1 是使用 1) HFDM-1 (_)培養(yǎng)基、2) HFDM-1 (+)培養(yǎng)基、3)溶解了 TOGF-AA (10ng/ml)的HFDM-l(-)培養(yǎng)基、和4)溶解了 roGF-BB(10ng/ml)的HFDM-l(-)培養(yǎng)基作為無血清培養(yǎng)基進行了培養(yǎng)的人DS細胞的第2天和第10天的顯微鏡照片。
[0033]圖2是顯示使用l)HFDM-l(-)培養(yǎng)基、2)HFDM-1( + )培養(yǎng)基、3)溶解了PDGF-AA(1 Ong/ml)的 HFDM-1 (-)培養(yǎng)基、和 4)溶解了 TOGF-BB (1 Ong/ml)的 HFDM-1 (-)培養(yǎng)基作為無血清培養(yǎng)基進行了培養(yǎng)的人DS細胞的細胞數(shù)變化(第2、5、10天)的曲線圖。
[0034]圖3是使用l)StemProSFMCTS(sup+，Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(lOng/ml)的StemProSFM CTS(sup+，Lifetechnologies)、3)Mosaic hMSC SF CultureMedium(sup+,BD)、4)溶解了PDGF_BB(10ng/ml)的Mosaic hMSC SF Culture Medium(sup+,BD)作為無血清培養(yǎng)基進行了培養(yǎng)的人DS細胞的第2天和第7天的顯微鏡照片。
[0035]圖4是顯示使用l)StemProSFMCTS(sup+,Lifetechnologies)、2)溶解了PDGF-BB(10ng/ml)的StemProSFM CTS(sup+,Lifetechnologies))Mosaic hMSC SF CultureMedium(sup+,BD)、4)溶解了PDGF_BB(10ng/ml)的Mosaic hMSC SF Culture Medium(sup+,BD)作為無血清培養(yǎng)基進行了培養(yǎng)的人DS細胞的細胞數(shù)變化(第2、7天)的曲線圖。
[0036]圖5是使用 1) HFDM-1 (_)培養(yǎng)基、2) HFDM-1 (+)培養(yǎng)基、3)溶解了 TOGF-AA (1 Ong/ml)的HFDM-1 (-)培養(yǎng)基、和4)溶解了 TOGF-BB (1 Ong/ml)的HFDM-1 (-)作為無血清培養(yǎng)基進行了培養(yǎng)的人DS細胞的第2天和第7天的顯微鏡照片。
[0037]圖6是顯示使用l)HFDM-l(-)培養(yǎng)基、2)HFDM-1( + )培養(yǎng)基、3)溶解了PDGF-AA(1 Ong/ml)的 HFDM-1 (-)培養(yǎng)基、和 4)溶解了 TOGF