用于病毒增殖的兩階段溫度分布的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是基于以下中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)：
[0002] 原案申請(qǐng)日：2008年4月30日
[0003] 原案【申請(qǐng)?zhí)枴?00880021212. 0(PCT/EP2008/003532)
[0004] 原案申請(qǐng)名稱：用于病毒增殖的兩階段溫度分布
[0005] 本申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2007年5月4日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/927,693的優(yōu) 先權(quán)，現(xiàn)將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明涉及病毒增殖領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0007] 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的病毒增殖是在取決于病毒和用于增殖的宿主體系的特性 的溫度條件下進(jìn)行的。選擇特定的溫度用于細(xì)胞的生長(zhǎng)（在細(xì)胞培養(yǎng)基或者胚卵的繁殖 中），接著選定溫度用于病毒的增殖。在大多數(shù)情況下，病毒增殖溫度低于細(xì)胞增殖溫度。 對(duì)溫度敏感的病毒增殖涉及到在大約圍繞用于昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)（隨著例如桿狀病毒產(chǎn)生）的 20°C的溫度范圍內(nèi)、以及在用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒制備的直至約37°C的溫度下影 響病毒增殖速度和抗原形成，使用對(duì)于每種病毒/寄主細(xì)胞組合的特定的最適條件。更高 的溫度會(huì)影響感染動(dòng)力學(xué)和病毒的穩(wěn)定性。當(dāng)病毒在37°C溫度下增殖時(shí)，在后續(xù)的病毒復(fù) 制期間會(huì)經(jīng)常觀察到降低的病毒滴度和更低的病毒抗原質(zhì)量。這種影響對(duì)于用于疫苗生產(chǎn) 的大規(guī)模病毒增殖可能具有不利的后果。
[0008] 本發(fā)明的目標(biāo)在于提供改善的生長(zhǎng)條件，其不會(huì)影響生產(chǎn)的用于疫苗目的的抗原 質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種用于病毒生產(chǎn)的方法，其中，一種以上寄主細(xì)胞被病毒感染，然 后在第一溫度下培養(yǎng)（例如，在31°C至37°C的溫度下培養(yǎng)1至48小時(shí)）；并且隨后在第二 溫度下培養(yǎng)，該第二溫度比第一溫度低（例如，低1至6°C)。然后收集這些培養(yǎng)步驟中所 產(chǎn)生的病毒。
[0010] 現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，對(duì)于許多病毒包括流感（正粘病毒）、羅斯河病毒 (Alphaviridae)和西尼羅河病毒（黃病毒），培養(yǎng)條件可以通過(guò)使用兩階段溫度分布而被 實(shí)質(zhì)性地改進(jìn)。更高的溫度被應(yīng)用于病毒增殖的第一階段，其可促進(jìn)傳染性病毒顆粒的形 成。在第二階段，采用較低的溫度，以便維持在更高溫度的增殖期間中獲得的初始高滴度， 并且允許穩(wěn)定的抗原的形成，該抗原可以被進(jìn)一步用于免疫原性疫苗的生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1A-1B:在Vero細(xì)胞中于（A)32°C和⑶36°C下增殖的新喀里多尼亞（New Caledonia)病毒的抗原顯帶圖形。
[0012] 圖2A-2D:在感染以后在37°C下不同時(shí)間點(diǎn)羅斯河病毒（RossRiverVirus，RRV) 感染的NaBr曲線圖。
[0013] 圖3A-3D:在感染以后在35°C下不同時(shí)間點(diǎn)羅斯河病毒感染的NaBr曲線圖。
[0014] 圖4A-4D:在感染之后在32°C下不同時(shí)間點(diǎn)的羅斯河病毒感染的NaBr曲線圖。
[0015] 圖5A-5D:在感染之后在35°C/32°C下不同時(shí)間點(diǎn)的羅斯河病毒感染的NaBr曲線 圖。
[0016] 圖6:在37°C和35°C/32°C下感染的羅斯河病毒接種物的Westernblot。
[0017] 圖7A-7D:在感染之后在35°C下不同時(shí)間點(diǎn)的西尼羅河病毒感染的NaBr曲線圖， 同時(shí)附有顯微圖像。
[0018] 圖8A-8D:在感染之后在32°C下不同時(shí)間點(diǎn)的西尼羅河病毒感染的NaBr曲線圖， 同時(shí)附有顯微圖像。
[0019] 圖9A-9D:在感染之后在35°C/32°C下不同時(shí)間點(diǎn)的西尼羅河病毒感染的NaBr曲 線圖，同時(shí)附有顯微圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明的一個(gè)方面是實(shí)現(xiàn)允許獨(dú)立優(yōu)化和控制下述條件的在此描述的兩階段溫 度分布：（1)用于寄主細(xì)胞多周期感染的活性病毒的形成；（2)在后續(xù)的復(fù)制階段中獲得高 滴度的維持；以及（3)在后續(xù)的生產(chǎn)工藝階段中的抗原形成。
[0021] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述病毒是正粘病毒、a-病毒或黃病毒。
[0022] 優(yōu)選病毒是流感病毒，并且在特定的實(shí)施方式中，優(yōu)選選自下組：甲型流感和乙 型流感、羅斯河病毒和西尼羅河病毒。雖然在此提供的實(shí)施例顯示了通過(guò)使用本發(fā)明的 兩溫度方法進(jìn)行改進(jìn)的針對(duì)這些病毒的抗原的生產(chǎn)，但本發(fā)明預(yù)期的其他病毒的非限制 性例子包括：選自于由RNA病毒家族所構(gòu)成的組的病毒，比如呼腸孤病毒（Reoviridae)、 小RNA病毒（Picornaviridae)、環(huán)狀病毒（Caliciviridae)、披膜病毒（Togaviridae)、 沙粒病毒（Arenaviridae)、反轉(zhuǎn)錄病毒（Retroviridae)、黃病毒（Flaviviridae)、正粘病 毒（Orthomyxoviridae)、副粘病毒（Paramyxoviridae)、本雅病毒（Bunyaviridae)、彈狀 病毒（Rhabdoviridae)、纖絲病毒（Filoviridae)、冠狀病毒（Coronaviridae)、星形病毒 (Astroviridae)、或波納病毒（Bornaviridae);以及選自于由DNA病毒家族所構(gòu)成的組， 比如腺病毒（Adenoviridae)、乳多空病毒（Papovaviridae)、細(xì)小病毒（Parvoviridae)、 皰疼病毒（Herpesviridae)、痕病毒或肝DNA病毒（Hepadnaviridae)。在特定的實(shí)施方式 中，病毒選自下組：甲型流感/Panama(巴拿馬）/2007/99、甲型流感/NewCaledonia(新 喀里多尼亞）/20/99、乙型流感/Shangdong(商?hào)|）/7/97、乙型流感/Malaysia(馬來(lái) 西亞）/2506/2004、甲型流感/Hiroshima(廣島）/52/2005、以及甲型流感/Solomon Islands(所羅門群島）/3/2006。
[0023] 能夠在任何適合病毒產(chǎn)生的細(xì)胞中制備出病毒。優(yōu)選細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì) 胞系。這樣的細(xì)胞可以來(lái)自特定的組織或胚細(xì)胞。動(dòng)物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)。本發(fā)明的各 種【具體實(shí)施方式】可以利用犬科細(xì)胞系、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系、鳥(niǎo)類細(xì)胞系或靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織細(xì) 胞系。例如，在特定的實(shí)施方式中，細(xì)胞可以是MDCK細(xì)胞、CH0細(xì)胞、perC6細(xì)胞、HEK293細(xì) 胞、或其他的通常在病毒增殖中使用的細(xì)胞。在一些特定的實(shí)施方式中，細(xì)胞是上皮細(xì)胞， 尤其優(yōu)選腎上皮細(xì)胞，比如非洲綠猴的Vero細(xì)胞。
[0024] 在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，在不包含動(dòng)物血清蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。這樣 的培養(yǎng)基不包括，例如，牛血清或其部分，比如胎牛血清。這樣的培養(yǎng)基被稱為"無(wú)血清蛋白 培養(yǎng)基"。在病毒增殖期間，可以將病毒增殖所必需的蛋白酶比如胰蛋白酶加至培養(yǎng)基。在 一些實(shí)施方式中，這樣的蛋白酶可以由非動(dòng)物來(lái)源衍生得到，比如來(lái)自細(xì)菌或重組體來(lái)源； 或者可以由動(dòng)物來(lái)源衍生得到。在在此使用的術(shù)語(yǔ)的意義內(nèi)，這樣的補(bǔ)加培養(yǎng)基仍然被認(rèn) 為是無(wú)血清蛋白培養(yǎng)基。
[0025] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行。在本發(fā)明的一些實(shí) 施方式中，該方法在如下規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行：大于50升的細(xì)胞培養(yǎng)基、50至100升 的細(xì)胞培養(yǎng)基、100至500升的細(xì)胞培養(yǎng)基、500至1000升的細(xì)胞培養(yǎng)基、或者大于1000升 的細(xì)胞培養(yǎng)基（例如，在6000升、10, 000升、甚至更大的生物反應(yīng)器中進(jìn)行）。在本發(fā)明的 一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法在攪拌罐式生物反應(yīng)器中進(jìn)行。
[0026] 在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，第一病毒增殖溫度低于用于給定的寄主細(xì)胞類型的細(xì)胞 培養(yǎng)增殖溫度。在一些實(shí)施方式中，