組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶sdg723調(diào)控水稻抽穗期中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】發(fā)明名稱：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SDG723調(diào)控水稻抽穗期中的應(yīng)用本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因SDG723在調(diào)控水稻抽穗期中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)顯示，在抑制SDG723的轉(zhuǎn)基因植株中，H3K4三甲基化顯著下降，說(shuō)明該基因是組蛋白H3K4三甲基化轉(zhuǎn)移酶。抑制SDG723后，植株的抽穗期延遲30天左右。利用Realtime-PCR檢測(cè)與抽穗期相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)開(kāi)花基因的表達(dá)量在SDG723抑制植株中下降。以上結(jié)果表明，SDG723通過(guò)調(diào)控組蛋白H3K4三甲基化修飾進(jìn)而調(diào)控水稻的抽穗期。
【專(zhuān)利說(shuō)明】組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SDG723調(diào)控水稻抽穗期中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一個(gè)調(diào)控水稻抽穗期的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因
[0002]SDG723的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要機(jī)制之一，核心組蛋白的功能在進(jìn)化上高度保守，但是其結(jié)構(gòu)卻處于動(dòng)態(tài)變化之中，其修飾不僅影響基因的表達(dá)活性，而且還會(huì)調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活躍或者沉默狀態(tài)的改變。組蛋白賴氨酸的甲基化是常見(jiàn)的組蛋白修飾，主要發(fā)生在組蛋白H3的賴氨酸4、9、14、27、36、79以及組蛋白H4的賴氨酸的20和59位上(Transcription regulation by histone methylation:1nterplay between covalentmodification of core histone tails.Gene Devj 2001 )D 從整體染色體的動(dòng)態(tài)變化而言，H3K4甲基化與常染色質(zhì)相關(guān)。從基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)講，H3K4位點(diǎn)的甲基化常與基因的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。酵母的DNA芯片結(jié)果顯示，芽殖酵母里SETl基因的突變引起了組蛋白H3K4修飾的缺失，導(dǎo)致80%的基因表達(dá)被抑制(Boa S et al.，Saccharomycescerevisiae Setlp is a methyltransferase specific for lysine4of histone H3andis required for efficient gene expression.Yeast，2003)。ATXl 是擬南芥中與果蠅中TRX同源的基因，具有H3K4的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，參與擬南芥花器官發(fā)育的調(diào)節(jié)。在atxl突變體中，F(xiàn)LC的表達(dá)量下降，F(xiàn)LC染色質(zhì)上的H3K4三甲基化修飾減少，而二甲基化程度沒(méi)有變化(Alvarez-Venegas R et al., ATX-1j an Arabidopsis homolog oftrithorax,activates flower homeotic genes.Curr Biol, 2003 ；Ste! phane Pien etal.，ARABID0PSIS TRITH0RAX1 Dynamically Regulates FLOWERING LOCUS C Activationvia Histone3Lysine4Trimethylation.Plant Cell，2008)。這表明擬南芥中的 ATXl 基因是通過(guò)對(duì)FLC基因的H3K4三甲基化修飾來(lái)保持其激活狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)間。
[0004]水稻中對(duì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的功能已有研究。SDG728是水稻組蛋白H3K9三甲基化酶，其通過(guò)調(diào)控反轉(zhuǎn)座子基因區(qū)域的組蛋白三甲基化水平來(lái)影響DNA甲基化水平，進(jìn)而調(diào)控反轉(zhuǎn)座子的表達(dá)，維持水稻的基因組穩(wěn)定，揭示了表觀遺傳調(diào)控在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座元件基因表達(dá)過(guò)程中的分子機(jī)制(Rice SUVH Histone Methyltransferase Genes DisplaySpecific Functions in Chromatin Modification and Retrotransposon Repression.Molecular Plant，2010)。SDG725是水稻組蛋白H3K36甲基化轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)調(diào)控BR合成途徑及信號(hào)傳導(dǎo)途徑的基因Dll、BRIl和BUl的表達(dá)，對(duì)水稻的株高以及葉夾角進(jìn)行調(diào)控(H3K36methylation is critical for brassinosteroid-regulated plant growth anddevelopment in rice.Plant Journal，2012)。SDG724 是水稻組蛋白 H3K36 甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)表觀遺傳調(diào)控0sMADS50和長(zhǎng)日照開(kāi)花素基因RFTl的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控水稻長(zhǎng)日照開(kāi)花途徑，使得該基因的突變體在長(zhǎng)日照條件下抽穗期推遲(The histone methyl transferaseSDG724mediates H3K36me2/3deposition at MADS50and RFTland promotes flowering inrice.Plant Cell, 2012)。
[0005]目前，H3K4組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)于水稻生長(zhǎng)發(fā)育的影響還知之甚少。本發(fā)明通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化、分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)揭示了 SDG723在水稻抽穗期中的調(diào)控作用及應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因SDG723在調(diào)控水稻抽穗期上的功能驗(yàn)證及其及應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法抑制該基因表達(dá)后，在長(zhǎng)日照條件下水稻抽穗期明顯地延遲。
[0007]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008] 申請(qǐng)人:通過(guò)克隆技術(shù)得到水稻組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因SDG723，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列全長(zhǎng)為3135個(gè)堿基，在該序列的第67個(gè)堿基至3069個(gè)堿基區(qū)段是該基因的編碼區(qū)，共編碼1023個(gè)氨基酸。在此基因的翻譯區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一段該基因特異的片段，構(gòu)建到抑制表達(dá)載體PDS1301 (圖1)，然后轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種中花11，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株47。在TO全部檢測(cè)了這些轉(zhuǎn)基因植株中SDG723基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)71%的轉(zhuǎn)基因植株中的SDG723的轉(zhuǎn)錄水平明顯受到了抑制。Western blot檢測(cè)顯示這些轉(zhuǎn)基因抑制植株中，組蛋白賴氨酸H3K4三甲基化修飾顯著低于野生型。性狀考察結(jié)果表明，這些陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株在長(zhǎng)日照條件下抽穗期延遲30天左右。這說(shuō)明本發(fā)明的所克隆到的組蛋白去甲基轉(zhuǎn)移酶SDG723基因可以通過(guò)對(duì)組蛋白H3K4三甲基化的影響來(lái)調(diào)控水稻抽穗期。
[0009]具體地本發(fā)明的步驟如下所述:
[0010](I)從 ChromDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www.chromdb.0rg/index, html)得到 SDG723 基因(基因登錄號(hào)L0C_0s09g04890)的DNA序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，以中花11成熟的葉片cDNA為模板，用一對(duì)特異引物擴(kuò)增獲得了 SDG723的全長(zhǎng)cDNA (翻譯起始位點(diǎn)上游67個(gè)堿基至下游3135個(gè)堿基)，為SEQ I DN0:1所示(其中67-3135是編碼區(qū))的核苷酸序列，擴(kuò)增該片段的引物對(duì)的DNA序列如下所示:
[0011 ] FL-F: 5，-GAACCCCAAATCCCTAAAC-3，
[0012]FL-R: 5，-CCACCACAAAGTAAGTTCCA-3，
[0013](2)以上述擴(kuò)增到SDG723全長(zhǎng)cDNA為模板，擴(kuò)增了 SDG723的特異片段區(qū)域，其序列為SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，擴(kuò)增該片段的引物對(duì)的DNA序列如下所示:
[0014]ds-F: 5，-GGGACTAGTGGTACCGGCAACGTGTCTTCTATGAT-3，
[0015]ds-R: 5，-GGGGAGCTCGGATCCCTCTGCTTCAACATCGTTA-3，
[0016](3)將SDG723的特異的片段裝載到抑制表達(dá)載體pDS1301_SDG723中，構(gòu)建了抑制遺傳轉(zhuǎn)化載體(圖1)。
[0017](4)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法(Hiei Y等，Efficient tra-nsformation ofrice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA.Plant J.1994,6:271-282.)將所述的載體導(dǎo)入水稻粳稻品種中花11，獲得遺傳轉(zhuǎn)化植株。
[0018](5)用Realtime-PCR方法分析SDG723在不同組織器官中的表達(dá)模式。
[0019](6)用Realtime-PCR方法分析鑒定轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性以及SDG723的轉(zhuǎn)錄水平。
[0020](7)利用Western blot檢測(cè)野生型植株以及SDG723轉(zhuǎn)基因抑制植株的組蛋白H3K4甲基化的修飾情況。
[0021](8)觀察SDG723轉(zhuǎn)基因植株表型并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0022](9)利用Realtime-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株中與抽穗期相關(guān)基因的表達(dá)。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:[0024]水稻是全世界最重要的糧食作物之一。提高水稻產(chǎn)量對(duì)緩解糧食短缺，尤其是保障我國(guó)的糧食安全有著重要的意義，所以如何提高改良與水稻產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝性狀已經(jīng)成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一項(xiàng)非常重要意義的科學(xué)問(wèn)題。抽穗期是水稻非常重要的農(nóng)藝性狀之一，它對(duì)于水稻適應(yīng)不同的栽培地區(qū)和耕作季節(jié)是至關(guān)重要的。決定水稻品種的適宜種植地區(qū)與季節(jié)是獲得高產(chǎn)的保障。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SDG723是一個(gè)組蛋白修飾因子，其表達(dá)被抑制后，水稻組蛋白H3K4三甲基化修飾降低，受其調(diào)控的開(kāi)花基因的表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化，使得轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期延遲。本發(fā)明通過(guò)研究SDG723的抑制植株的抽穗期延遲的機(jī)理，來(lái)闡明此基因?qū)τ谒境樗肫诘挠绊?。這對(duì)水稻產(chǎn)量的研究有著重要的指導(dǎo)意義，可為水稻新品種的選育提供理論基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]序列表SEQ ID NOl:是本發(fā)明克隆的水稻組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因SDG723的核苷酸序列，序列全長(zhǎng)為3368bp，其第67-3135位為編碼區(qū)。
[0026]序列表SEQ ID N02:是本發(fā)明克隆的水稻組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SDG723蛋白的氨基酸序列，其編碼1022個(gè)氨基酸。
[0027]序列表SEQ ID N03:是本發(fā)明克隆的水稻組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因SDG723的構(gòu)建雙鏈抑制載體的特異核苷酸序列。
[0028]圖1:SDG723在水稻不同組織器官中的表達(dá)模式。
[0029]圖2:抑制表達(dá)載體pDS1301以及pDS1301_SDG723示意圖。
[0030]圖3:SDG723基因在轉(zhuǎn)基因抑制植株中的表達(dá)量。圖中:ZH11代表野生型中花11 ；R代表轉(zhuǎn)基因抑制植株，Rl，R2，…R47代表不同的轉(zhuǎn)基因家系。
[0031]圖4:SDG723轉(zhuǎn)基因抑制植株抽穗期推遲的表型。圖中:ZH11代表野生型中花11 ；R5和R7代表SDG723不同轉(zhuǎn)基因家系的抑制植株。
[0032]圖5 =Western blot檢測(cè)野生型植株中花11和SDG723轉(zhuǎn)基因抑制植株中組蛋白H3K4三甲基化修飾。圖中:ZH11代表野生型中花11 ；SDG723RNAi代表SDG723轉(zhuǎn)基因抑制植株。
[0033]圖6:抽穗期相關(guān)基因在野生型植株中花11和SDG723轉(zhuǎn)基因抑制植株中的表達(dá)量。圖中:ZH11代表野生型中花11 ;R8和町3代表506723不同轉(zhuǎn)基因家系的抑制植株。其中圖6A是Hd3a在中花11和SDG723轉(zhuǎn)基因植株中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量；圖6B是RFTl在中花11和SDG723轉(zhuǎn)基因植株中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量；圖6C是Ehdl在中花11和SDG723轉(zhuǎn)基因植株中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量；圖6D是MADS14在中花11和SDG723轉(zhuǎn)基因植株中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量。
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1:SDG723基因全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增[0035]對(duì)本發(fā)明所需要的基因SDG723 (基因登錄號(hào)L0C_0s09g04890)，主要通過(guò)RT-PCR方法(參見(jiàn)J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，北京，科學(xué)出版社，2002版)進(jìn)行擴(kuò)增得到SDG723基因全長(zhǎng)序列。具體操作如下:
[0036]I)抽提來(lái)自水稻品種中花11 (來(lái)源中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)幼苗葉片的RNA, RNA抽提用試劑是Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見(jiàn)該試劑盒的說(shuō)明書(shū))； [0037]2) RT-PCR中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈的步驟如下:①配制混合液1:總RNA4 μ g，DNase 12U, IOXDNaseI bufferl μ 1，加DEPC (焦碳酸二乙酯，RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑)處理水(0.01% DEPC^Ij 10 μ 1，混勻后將混合液I在37°C放置20分鐘以除去DNA，②20分鐘后將混合液I置于65°C水浴中溫浴10分鐘以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分鐘，③向混合液I中加入I μ 1500 μ g/ml的oligo (dT)，④將在冰上冷卻的混合液I立即置于65°C水浴中溫浴10分鐘，以徹底使RNA變性，然后置于冰上5分鐘，⑤配制混合液2:混合液110 μ 1，5 X first strand buffer4 μ 1,0.1M DTT(疏基乙醇)2μ I, IOmM dNTP mixturel.5 μ I,DEPC處理水0.5 μ 1，反轉(zhuǎn)錄酶2 μ 1，混勻后將混合液2置于42°C水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時(shí)，⑥反應(yīng)結(jié)束后將混合液2置于90°C干浴3分鐘，⑦_(dá)20°C保存反應(yīng)最終產(chǎn)物，反應(yīng)中用到的試劑全部購(gòu)自Invitrogen公司。
[0038]3)然后根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)公布的 SDG723 基因的全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增片段。PCR用到的體系為20 μ 1，具體配法為:cDNA第一鏈模板 I μ 1，10XPCR buffer2y I, IOmM dNTPl.6μ 1,2.5mM Mg2+L 5 μ 1，正向引物和反向引物各 0.4 μ 1，LATaq 酶 0.2 μ 1，加水至 20 μ I (所用到的 PCR buffer、dNTP、Mg2+、LATaq酶等均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應(yīng)條件如下:①940C 4分鐘，②94°C 30秒，③58°C 30秒，④72°C 60秒，⑤從②一④循環(huán)35次，⑥72°C 7分鐘，⑦4°C保存。擴(kuò)增出全長(zhǎng)序列。
[0039]用來(lái)克隆SDG723全長(zhǎng)的引物如下所示:
[0040]FL-F: 5，-GAACCCCAAATCCCTAAAC-3，，
[0041 ] FL-R: 5，-CCACCACAAAGTAAGTTCCA-3，.[0042]4)將擴(kuò)增出的全長(zhǎng)連接到T/A克隆載體pGEMT-vector (購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國(guó)Promega公司)上用T7和SP6引物測(cè)序驗(yàn)證。
[0043]實(shí)施例2:SDG723雙鏈抑制載體的構(gòu)建
[0044]對(duì)本發(fā)明的基因克隆，通過(guò)RT-PCR方法(參見(jiàn)J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)進(jìn)行擴(kuò)增得到SDG723特異的一段序列，具體步驟是:根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)公布的SDG723基因的全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)在ChromDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.chromdb.0rg/index, html)中比對(duì)尋找SDG723特異的序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增RNAi抑制片段。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)T/A克隆連接到pGEMT-vector (購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國(guó)Promega公司)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
[0045]用來(lái)克隆SDG723的RNAi抑制片段的引物如下所示:
[0046]ds-F: 5，-GGGACTAGTGGTACCGGCAACGTGTCTTCTATGAT-3，，[0047]ds-R: 5 ’ -GGGGAGCTCGGATCCCTCTGCTTCAACATCGTTA-3 ’.[0048]具體步驟如下:
[0049]I)將帶有SDG723的RNAi片段的T/A克隆用Kpn I和Bam HI酶切，回收目標(biāo)條帶，與Kpn I和Bam HI酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒pDS1301 (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，儲(chǔ)昭輝教授贈(zèng)送)；參見(jiàn)文獻(xiàn):Chu等，Promoter mutations of an essentialgene for pollen development result in disease resistance in rice.GenesDev, 2006, 20:1250-1255.)連接(所使用的內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司，使用方法及用量按照該公司提供的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)；連接酶為上海英俊生物技術(shù)公司產(chǎn)品，用法及用量按照該公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))；
[0050]2)連接產(chǎn)物通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法(電轉(zhuǎn)化儀為eppendorf公司產(chǎn)品，所用電壓為1800v，操作方法見(jiàn)儀器說(shuō)明書(shū))導(dǎo)入大腸桿菌DH10B (購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國(guó)Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(購(gòu)自羅氏生物公司產(chǎn)品)的LA (LA配方參見(jiàn)J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)抗性培養(yǎng)基上涂皿培養(yǎng)；
[0051]3)將LA抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落在超凈工作臺(tái)接種于滅菌的IOml離心管，管內(nèi)預(yù)先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培養(yǎng)基，然后在37°C搖床上培養(yǎng)16-18小時(shí)。按照J(rèn).薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2002版報(bào)道的方法抽提質(zhì)粒，用Kpn I和BamHI酶切并電泳檢測(cè)，根據(jù)插入片段的大小獲得陽(yáng)性的抑制表達(dá)載體:pDS1301-SDG723-l (該質(zhì)粒的圖譜見(jiàn)圖1);
[0052]4)將帶SDG723干涉片段的TA克隆用Spe I和Sac I酶切，回收目標(biāo)條帶，與Spe I和Sac I酶切的質(zhì)粒pDS1301-SDG723_l連接，依據(jù)2)、3)步得到抑制表達(dá)載體:pDS1301-SDG723-2(該質(zhì)粒的圖譜見(jiàn)圖1)
[0053]實(shí)施例3:雙元Ti質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性和表達(dá)量檢測(cè)
[0054]I)把新構(gòu)建的抑制表達(dá)載體pDS1301-SDG723-2 (來(lái)自實(shí)施例2)通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法(參考文獻(xiàn)和使用的電壓參數(shù)如實(shí)施例2的步驟2)所述)導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105 (購(gòu)自澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室)菌株中，我們將得到的菌株命名為pDS1301-SDG723-EHA105。
[0055]2)將上步得到的pDS1301-SDG723-EHA105轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種中花11，轉(zhuǎn)化方法參照Hiei 等人報(bào)道的方法(Hiei 等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J, 1994,6:271-282.)進(jìn)行。將所獲得的TO代轉(zhuǎn)基因植株命名為Rn，其中n=l，2，3...代表轉(zhuǎn)基因的不同家系。
[0056] 3)取TO代轉(zhuǎn)化植株葉片抽提總DNA，DNA抽提方法為CTAB法(Zhang等，geneticdiversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis, 1992, Theor Appl Genet, 83，495-499)。以葉片總 DNA 為模板，用 PCR 方法對(duì)雙聯(lián)抑制TO代轉(zhuǎn)化植株用載體第一鏈引物(pMCGIF和pMCGIR)和第二鏈引物(pMCG2F和PMCG2R)進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。
[0057]引物的序列如下:
[0058]pMCGIF:5’-CTGCTCCACACATGTCCATT-3，
[0059]pMCGlR:5’-CCCACCATCTTGTGGAGCTA-3’[0060]pMCG2F: 5，-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3，
[0061 ] pMCG2R: 5，-CTGAGCTACACATGCTCAGGTT-3，
[0062]以上引物均由生工生物工程(上海)有限公司(或稱上海生工生物工程有限公司)合成。
[0063]PCR 反應(yīng)總體積為 20 μ 1，具體配法是:模板 lOOng，10XPCR buffer2 μ I, IOmMdNTPl.6 μ 1,2.5mMMg2+l.5μ 1，正向引物、反向引物(pMCGIF 和 pMCGIR，pMCG2F 和 pMCG2R)各 0.4 μ 1，1^&9酶0.24 I,加去離子水至 20 μ I (所用到的 PCR buffer、dNTP、Mg2+、r_Taq酶等均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應(yīng)條件如下:①940C 4分鐘，②94°C 30秒，③57°C 30秒，④72°C I分鐘，⑤從②一④循環(huán)32次，⑥72°C 7分鐘，⑦4°C保存。PCR產(chǎn)物在I % (質(zhì)量/體積)的TBE瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。因?yàn)檩d體第一鏈引物(pMCGIF和pMCGIR)和第二鏈引物(pMCG2F和pMCG2R)片段為轉(zhuǎn)化載體所特有，這樣能擴(kuò)增出’特異條帶的轉(zhuǎn)基因植株即為陽(yáng)性植株。對(duì)TO代陽(yáng)性植株收種子(稱為T(mén)l代)，為T(mén)l代的大田種植和性狀調(diào)查做準(zhǔn)備。
[0064]3)為了檢測(cè)雙鏈抑制植株中的目標(biāo)基因的表達(dá)量， 申請(qǐng)人:采用Realtime-PCR的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因TO代植株進(jìn)行了表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)所用的總RNA來(lái)自分蘗期的水稻葉片，RNA抽提用的試劑是采用Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū))；按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到產(chǎn)物后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)SDG711的表達(dá)量。試劑購(gòu)自寶生物工程大連有限公司，反應(yīng)體系參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。PCR儀為美國(guó)ABI公司的7500，PCR參數(shù)為95°C預(yù)變性10秒，進(jìn)入循環(huán)后95°C變性5秒，60°C退火延伸40秒，45個(gè)循環(huán)。Realtime-PCR所用引物序列為:
[0065]SDG723RT-F: 5，-CGGCGCATATACAACTCTTT-3，
[0066]SDG723RT-R: 5，-CCCGCGTAGCATCTATAACA-3，
[0067]最終得到的TO代轉(zhuǎn)基因植株中SDG723表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖4。R-1到R-1O為最終得到的10個(gè)轉(zhuǎn)基因家系，Realtime-PCR結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因材料中，SDG723的表達(dá)與野生型中花11相比，下降了約75%左右，說(shuō)明抑制效果很好。
[0068]實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因植株性狀調(diào)查
[0069]在中國(guó)湖北武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)大田長(zhǎng)日照條件下播種野生型(非轉(zhuǎn)基因)中花11和SDG723抑制轉(zhuǎn)基因植株，選取了 5個(gè)SDG723的抑制轉(zhuǎn)基因家系，每個(gè)家系30株，對(duì)其進(jìn)行抽穗期統(tǒng)計(jì)，與野生型的中花11抽穗期進(jìn)行比較。結(jié)果如表1所示。
[0070]表1SDG723抑制植株的抽穗期統(tǒng)計(jì)
SSSZHR-CKRtR3R3R4RS
[0071]
【權(quán)利要求】
1.水稻組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SDG723在調(diào)控水稻抽穗期中的應(yīng)用，其特征在于，所述的SDG723基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2. 水稻組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SDG723在調(diào)控水稻抽穗期中的應(yīng)用，其特征在于，所述的SDG723基因的蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO:1中第67-3135位編碼區(qū)所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/54GK103468723SQ201310454162
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月28日
【發(fā)明者】周道繡, 張華 , 趙毓 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)