一種用于高通量測(cè)序分析dna甲基化狀態(tài)的文庫(kù)構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于高通量測(cè)序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫(kù)構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs)的作用下 使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。
[0003]目前檢測(cè)甲基胞嘧啶有多種方法，十多年前重亞硫酸鹽基因組序列檢測(cè)技術(shù)已成 為在復(fù)雜基因組中分析DNA甲基化的方法。這個(gè)敏感而又直接的方法從根本上改了基因組 DNA甲基化模式的特征，在目前使用的技術(shù)中可以得到最好的特異性結(jié)果并排除多種限制。 這個(gè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法是基于DNA變性后用重亞硫酸氫鈉處理，可將未甲基化的胞嘧啶修飾 成尿嘧啶，能夠?qū)⒒蚪M中未甲基化的C堿基與甲基化的C堿基區(qū)分開(kāi)來(lái)，重亞硫酸鹽基因 組測(cè)序已經(jīng)被證實(shí)是分析DNA甲基化的有效和強(qiáng)有力的方法，是目前公認(rèn)的DNA樣品甲基 化檢測(cè)的"金標(biāo)準(zhǔn)"，它可以明確甲基化的確切位置及甲基化的程度。
[0004] 將重亞硫酸鹽修飾與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，能夠繪制單堿基分辨率的DNA甲基 化圖譜，因此成為表觀遺傳學(xué)研究的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于高通量測(cè)序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫(kù)構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明提供的一組DNA分子，該組分子由如下（1)- (4)所示的四種分子組成：
[0007] (1)SEQ ID No. 1 所示的 DNA分子；
[0008] (2) SEQ ID No. 2 所示的 DNA分子；
[0009] (3) SEQ ID No. 3 所示的 DNA分子；
[0010] (4)SEQ ID No. 4 所示的 DNA分子。
[0011] 一組接頭分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該組分子由如下（1)- (4)所示的四種分 子組成：
[0012] (1)SEQ ID No.1 所示的DNA分子；
[0013] (2)SEQIDNo.2所示的DNA分子，其中3'末端的兩個(gè)堿基均進(jìn)行硫代修飾；
[0014](3) SEQ ID No. 3所示的DNA分子；
[0015] (4 )SEQIDNo. 4所示的DNA分子，其中3'末端的兩個(gè)堿基均進(jìn)行硫代修飾；
[0016] 所述（1) - (4)所示的四種分子的dC在5位置均有甲基修飾；
[0017]其中（1)和（2)形成雙鏈構(gòu)成第一種接頭分子，（3)和（4)形成雙鏈構(gòu)成第二種接 頭分子。
[0018] 一對(duì)引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該對(duì)引物由如下（1)和（2)所示的兩種分子 組成：
[0019] (1)SEQ ID No.5 所示的DNA分子；
[0020] 該分子與SEQIDNo. 3所不的分子部分序列一致；
[0021] (2)SEQID No.6 所示的DNA分子；
[0022] 該分子與SEQIDNo. 1所不的分子部分序列一致。
[0023] -種重亞硫酸鹽修飾試劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑按照如下方法制備而 成：稱取1. 9gNa2S205，加水至5mL，全部溶解后用3M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5. 0,真空干燥濃縮 制成。
[0024] -種用于高通量測(cè)序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫(kù)構(gòu)建的試劑盒也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍，該試劑盒包含上述接頭分子和上述引物。
[0025] 上述試劑盒中，所述試劑盒還包含牛血清白蛋白、DNA片段化酶、DNA片段化反應(yīng) 緩沖液、ddH20、不含核酸酶的水、末端修復(fù)緩沖液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I，（Klenow)大 片段、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶緩沖液、T4DNA連接酶、缺口平移緩沖液、BstDNA聚 合酶(大片段)、甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液和高保真DNA聚合酶；
[0026] 所述末端修復(fù)緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)為MgCl2、 DTT、ATP和dNTPs，Tris-HCl緩沖液的濃度為500mM，MgCl2在所述10X末端修復(fù)緩沖液中 的濃度為l〇〇mM，DTT在所述10X末端修復(fù)緩沖液中的濃度為100mM，ATP在所述10X末端 修復(fù)緩沖液中的濃度為l〇mM，dNTPs在所述10X末端修復(fù)緩沖液中的濃度為5mM，溶液pH 為 7.5 ;
[0027] 所述缺口平移緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)為 (NH4)2S04、KC1、MgS04、TritonX-100 和dNTPs，Tris-HCl緩沖液的濃度為 200mM，（NH4)2S04 在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度為lOOmM，KC1在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度 為100mM，MgS04在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度為20mM，TritonX-100在所述10X 缺口平移緩沖液中的體積百分含量為1%，dNTPs在所述10X缺口平移緩沖液中的濃度為 2mM，所述dNTPs包含等濃度的dATP、dm5CTP,dGTP和dTTP，溶液pH為8. 8 ;
[0028] 所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)為Tris、（NH4) 2S04、MgCl2和0 -巰基乙醇，Tris在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液中的濃度為670mmol/L， (NH4) 2S04在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液中的濃度為166mmol/L，MgCl2在所述甲基化PCR 擴(kuò)增緩沖液中的濃度為67mmol/L，0 -巰基乙醇在所述甲基化PCR擴(kuò)增緩沖液中的濃度為 100mmol/L〇
[0029] 上述任一所述的試劑盒中，所述DNA片段化酶的商品名稱為NEBNextdsDNA Fragmentase，購(gòu)自NEB公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為M0348L;
[0030] 所述DNA片段化反應(yīng)緩沖液的商品名稱為10XFragmentaseReactionBuffer,購(gòu) 自NEB公司；
[0031] 所述T4DNA聚合酶的商品名稱為T4DNAPolymerase，購(gòu)自NEB公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 M0203S；
[0032] 所述DNA聚合酶I，（Klenow)大片段的商品名稱為DNAPolymerase I，Large(Klenow)Fragment,購(gòu)自NEB公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為M0210S;
[0033] 所述T4多聚核苷酸激酶的商品名稱為T4PolynucleotideKinase,購(gòu)自NEB公司， 產(chǎn)品目錄號(hào)為M0201;
[0034] 所述T4DNA連接酶緩沖液的商品名稱為10XT4DNALigaseBuffer，購(gòu)自NEB公 司；
[0035] 所述T4DNA連接酶的商品名稱為T4DNALigase，購(gòu)自NEB司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 M0202S；
[0036] 所述BstDNA聚合酶（大片段）的商品名稱為BstDNAPolymerase，Large Fragment，購(gòu)自NEB公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為M0275;
[0037]所述高保真DNA聚合酶的商品名稱為PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase， 購(gòu)自NEB公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為M0530S。
[0038] -種用于高通量測(cè)序分析DNA甲基化狀態(tài)的文庫(kù)的構(gòu)建方法也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍，包括如下步驟：
[0039] (1)提取基因組DNA;
[0040] (2)將基因組DNA進(jìn)行片段化，收集長(zhǎng)度為100-300bp的片段化DNA并純化；
[0041] (3)將步驟（2)得到的DNA的粘性末端修復(fù)成平末端，并在5'末端進(jìn)行磷酸化修 飾并純化；
[0042] (4)對(duì)步驟（3)得到的DNA片段連接上述接頭分子并純化；
[0043] (5)將步驟（4)得到的DNA片段進(jìn)行缺口平移；
[0044] (6)將步驟（5)得到的DNA片段進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾及脫磺酸基并純化；
[0045] (7)以步驟（6)得到的DNA片段為模板，以上述引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，即為富集的DNA甲基化狀態(tài)的文庫(kù)。
[0046] 上述方法中，所述步驟（3)的具體步驟如下：
[0047] 將步驟（2)的片段化的DNA與ddH20、末端修復(fù)緩沖液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶 I，（Klenow)大片段、T4多聚核苷酸激酶混合，得體系1;將體系1置于20°C30分鐘，得DNA 片段末端修復(fù)以及5'末端磷酸化修飾后的產(chǎn)物并純化；
[0048]所述體系1的總體積為100ul，所述ddH20的體積為29ul，所述末端修復(fù)緩沖液的 體積為l〇ul，所述T4DNA聚合酶的酶活為150U，所述DNA聚合酶I，（Klenow)大片段的酶活 為5U，所述T4多聚核苷酸激酶的酶活為50U;
[0049] 所述末端修復(fù)緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)為MgCl2、 DTT、ATP和dNTPs，Tris-HCl緩沖液