用于檢測小麥抗旱性的引物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測與小麥抗旱的引物及其應用。本發(fā)明所提供的用于檢測小麥抗旱性的引物為由引物對A和引物對B組成的引物對組：所述引物對A為由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對；所述引物對B為由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對。利用本發(fā)明所提供的引物檢測小麥抗旱性，方法可靠、簡便、實用，在小麥種質(zhì)資源評價和育種標記的輔助選擇中具有重要應用前景，同時為培育抗旱性強的小麥品種提供了參考依據(jù)。
【專利說明】用于檢測小麥抗旱性的引物及其應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領域】，涉及一種用于檢測小麥抗旱性的引物及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥是我國的重要的糧食作物和重要的戰(zhàn)略性儲備糧食品種。在各種逆境因子中，干旱已成為限制小麥生產(chǎn)的最主要因子，選育和推廣抗旱小麥品種是解決這一難題既經(jīng)濟又有效的途徑之一。尋找與其編碼基因緊密連鎖的分子標記，可為分子標記輔助選擇育種奠定基礎。
[0003]植物在受到水分脅迫后，會誘導產(chǎn)生一系列生理、生化反應以應對水分匱缺。脅迫壓力作為信號可以誘導調(diào)節(jié)一些基因的表達，進而促使蛋白質(zhì)的組成發(fā)生改變，或者合成新的蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)直接參與植物的應激反應，研究水分脅迫誘導蛋白有助于了解蛋白質(zhì)與植物適應環(huán)境壓力之間的關系。Schuppler等通過輕度水分脅迫處理小麥幼苗,發(fā)現(xiàn)葉片內(nèi)分子量34kDa的 蛋白含量明顯增加。石峰等研究18份小麥品種水分脅迫誘導蛋白與抗旱性的關系，發(fā)現(xiàn)小麥在水分脅迫后能夠引起分子量約66.2KDa應答蛋白的特異表達，該蛋白在中等及以上抗旱性品種中均有表達，而在弱抗旱性品種中不表達。在此研究的基礎上，張潔等研究了 30份冬小麥品種(系)幼苗期水分脅迫后葉片中應答蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)該蛋白與品種的抗旱性緊密相關，并提出此蛋白在水分脅迫下的表達可作為鑒定品種抗旱性的一項指標。任萬杰等對150份不同水旱生態(tài)型的冬小麥品種(系)進行不同水分條件下的應答蛋白表達分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白表達的類型與品種水旱生態(tài)型間呈極顯著相關。王婧等利用SSR標記對雜交組合(邯鄲6050 X西農(nóng)2208) F2群體進行分析，對該應答蛋白基因進行了初步定位，命名為“RpDD”，獲得了位于同一側(cè)且距離較遠的兩個SSR標記Xgwml29和Xgwm304o

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測小麥抗旱的引物及其應用。
[0005]本發(fā)明所提供的用于檢測小麥抗旱性的引物，為由如下引物對A和引物對B組成的引物對組:
[0006]所述引物對A具體為由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對；所述引物對B為由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對。
[0007]在實際應用中，所述引物對組(序列1、序列2、序列3和序列4)中的四條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比為1:1:1:1。
[0008]在本發(fā)明的一個實施例中，在所述引物對組中，組成每個引物對的兩條單鏈DNA在PCR反應體系中的工作濃度均為0.25 μ M0
[0009]含有所述引物對組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0010]所述引物對組的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。[0011]所述引物對組的制備方法可包括將所述引物對組中各序列所示單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
[0012]所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0013]所述試劑盒的制備方法可包括如下步驟:將所述引物對組中各序列所示單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)=PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
[0014]其中，序列I由25個核苷酸組成；序列2由25個核苷酸組成；序列3由20個核苷酸組成；序列4由20個核苷酸組成。
[0015]所述引物對組在檢測小麥抗旱性中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0016]本發(fā)明的再一個目的是提供一種檢測小麥抗旱性的方法。
[0017]本發(fā)明所提供的檢測小麥抗旱性的方法，可為如下(a) - (C)中任一種:
[0018](a)具體可包括如下(al)- (a2)步驟:
[0019](al)以待測小麥的基因組DNA為模板，以由所述引物對A (由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對)進行PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物；
[0020](a2)檢測步驟(al)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測小麥的抗旱性:若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為IOlbp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性強的小麥或候選為抗旱性強的小麥；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為117bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥。
[0021](b)具體可包括如下(bl)_ (b2)步驟:
[0022](bl)以待測小麥的基因組DNA為模板，以由所述引物對B (由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對)進行PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物；
[0023](b2)檢測步驟(bl)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測小麥的抗旱性:若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為215bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性強的小麥或候選為抗旱性強的小麥；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為219bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥。
[0024](C)具體可包括如下(Cl)- (c2)步驟:
[0025](cl)以待測小麥的基因組DNA為模板，以所述引物對A (由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對)和所述引物對B (由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對)分別進行PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物；
[0026](c2)檢測步驟(Cl)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測小麥的抗旱性:若采用所述引物對A擴增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為IOlbp的DNA片段，且采用所述引物對B擴增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為215bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性強的小麥或候選為抗旱性強的小麥；若采用所述引物對A擴增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為117bp的DNA片段，且采用所述引物對B擴增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為219bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥。
[0027]在實際應用中，判斷PCR產(chǎn)物中是否含有目的DNA片段時，可通過將PCR產(chǎn)物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(凝膠濃度具體可如6%)，看電泳圖譜上是否含有目的條帶:電泳圖譜上含有目的條帶，則PCR產(chǎn)物中含有目的DNA片段。
[0028]在上述方法中，所述大小為IOlbp的DNA片段具體為序列表中序列5所示DNA片段；所述大小為117bp的DNA片段具體為序列表中序列6所示DNA片段；所述大小為215bp的DNA片段具體為序列表中序列7所示DNA片段；所述大小為219bp的DNA片段具體為序列表中序列8所示DNA片段。
[0029]在實際應用中，判斷PCR產(chǎn)物中是否含有含有序列5-序列8中任一所示DNA片段，可通過對PCR產(chǎn)物進行核苷酸序列測定來判斷。
[0030]在上述方法中，以所述引物對A(由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對)進行PCR擴增的退火溫度具體可為53°C;以所述引物對B (由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對)進行PCR擴增的退火溫度具體可為53°C。
[0031]所述引物對組，或所述方法在如下(I)- (IV)中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍:
[0032](I)篩選抗旱性強的小麥品種；
[0033](II)篩選抗旱性弱的小麥品種；
[0034](III)培育抗旱性強的小麥品種；
[0035](IV)培育抗旱性弱的小麥品種。
[0036]本發(fā)明的還一個目的是提供一種培育抗旱性強(或弱)的小麥品種的方法，包括采用通過以上所述方法檢測得到的所述抗旱性強(或弱)的小麥品種作為親本進行育種的步驟。
[0037]在本發(fā)明中，所有的所述抗旱性均主要體現(xiàn)為小麥全生育期的抗旱性，具體體現(xiàn)在小麥抗旱指數(shù)上。
[0038]在本發(fā)明中，所有所述抗旱性強的小麥均為抗旱指數(shù)在1.10以上的小麥；所有所述抗旱性弱的小麥均為抗旱指數(shù)在0.89以下的小麥。具體的，所述抗旱指數(shù)均為按照“小麥抗旱性鑒定評價技術(shù)規(guī)范(GB/T21127-2007)”中“全生育期抗旱性鑒定”中記載的方法及公式計算所得。更加具體而言，在本發(fā)明中，所有所述抗旱性強的小麥均為“小麥抗旱性鑒定評價技術(shù)規(guī)范(GB/T21127-2007)”中記載的小麥全生育期抗旱性等級高于中等(抗旱性等級為極強或強)的小麥；所有所述抗旱性弱的小麥均為“小麥抗旱性鑒定評價技術(shù)規(guī)范(GB/T21127-2007)”中記載的小麥全生育期抗旱性等級低于中等(抗旱性等級為極弱或弱)的小麥。
[0039]本發(fā)明對65份小麥品種的統(tǒng)計實驗結(jié)果表明，采用引物對Xbarc56擴增出IOlbp目的條帶(序列5)，且采用引物對Xbarcll7擴增出215bp目的條帶(序列7)的小麥品種中，有88.9%為抗旱性強的小麥品種；采用引物對Xbarc56擴增出117bp目的條帶(序列6)，且采用引物對Xbarc117擴增出219bp目的條帶(序列8)的小麥品種中，有90.9%為抗旱性弱的小麥品種?？梢?，本發(fā)明所提供的檢測小麥抗旱性的方法可靠、簡便、實用，在小麥種質(zhì)資源評價和育種標記的輔助選擇中具有重要應用前景，同時為培育抗旱性強的小麥品種提供了參考依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為引物對Xbarc56和引物對Xbarcll7分別對不同抗旱性等級的小麥品種(系)進行PCR擴增的結(jié)果。其中，A為引物對Xbarc56的擴增結(jié)果；B為引物對Xbarcl 17的擴增結(jié)果；A和B中，泳道M為DNA分子量標準，各條帶由大到小依次為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp ;泳道I為晉麥47 ;泳道2為西農(nóng)2208 ;泳道3為長旱58 ;泳道4為西
27;泳道5為CK6004 ;泳道6為臨旱917 ;泳道7為運旱21-30 ;泳道8為晉麥50 ;泳道9為普冰143 ;泳道10為中梁88375 ;泳道11為洛旱2號；泳道12為石家莊8號；泳道13為秦麥I號；泳道14為滄核030 ;泳道15為川96003 ;泳道16為1424 ;泳道17為長武134 ;泳道18為西農(nóng)979 ;泳道19為濟麥20 ;泳道20為泰山9818 ;泳道21為鄭麥9023 ;泳道22為德麥3號。
【具體實施方式】
[0041 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043]下述實施例中所涉及的65份小麥品種(系)均為市面常售品種。
[0044]實施例1、用于檢測小麥抗旱性的引物的獲得及其應用
[0045]一、小麥抗旱性的測定
[0046]以表2中65份小麥品種(系)作為實驗材料，測定小麥品種(系)全生育期的相對發(fā)芽率，并進行抗旱性等級的劃分。具體如下:
[0047]1、全生育期抗旱性鑒定
[0048](I)田間鑒定
[0049]在常年自然降雨量小于500mm的地區(qū)或小麥生育期內(nèi)自然降雨量小于150mm的地區(qū)進行田間抗旱性鑒定。
[0050](a)試驗設計
[0051]隨機排列，三次重復，小區(qū)面積6.7m2。
[0052](b)脅迫處理
[0053]播種前表土墑情應保證出苗，表墑不足時，要適量灌水。
[0054](C)對照處理
[0055]在鄰近脅迫處理的試驗地設置對照試驗。對照試驗地的土壤養(yǎng)分含量、土壤質(zhì)地和土層厚度等與脅迫處理的基本一致。田間水分管理要保證小麥全生育期處于水分適宜的狀況，播種前表土墑情應保證出苗，表墑不足時，要適量灌水，另外，分別在拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期灌水，使Ocm-50cm 土層水分達到田間持水量的80%±5%。
[0056](2)考察性狀
[0057]小區(qū)籽粒產(chǎn)量。
[0058](3)抗旱指數(shù)
[0059]以小區(qū)籽粒產(chǎn)量計算抗旱指數(shù)，公式如下:
[0060]DI=YdX (Yd/Yp)/Yffld=(YdAp) X (Yd/Ymd)式⑴
[0061]式中，DI——抗旱指數(shù)；
[0062]Yd 脅迫環(huán)境品種(系)廣量；
[0063]Yp——非脅迫環(huán)境品種(系)產(chǎn)量；
[0064]Yffld—所有參試品種(系)于脅迫環(huán)境的平均產(chǎn)量；
[0065]注意:在進行抗旱性鑒定期間，要及時防治病、蟲、鳥害，防治倒伏。
[0066]2、小麥全生育期抗旱性判定[0067]抗旱性分為五級:極強(HR,highly resistant)、強(R, resistant)、中等(MR,moderately resistant)、尋層(S，susceptible)、豐及尋層(HS，highly susceptible)。
[0068]具體的小麥全生育期抗旱性判定標準見表I。
[0069]表I小麥全生育期抗旱性判定標準
[0070]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測小麥抗旱性的引物對組，由如下引物對A和引物對B組成: 所述引物對A為由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對；所述引物對B為由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對組，其特征在于:所述引物對組中的四條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比為1:1:1:1。
3.權(quán)利要求1或2所述的引物對組在檢測小麥抗旱性中的應用。
4.一種檢測小麥抗旱性的方法,為如下(a) - (c)中任一種: (a)包括如下(al)- (a2)步驟: (al)以待測小麥的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1或2中所述的引物對A進行PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物； (a2)檢測步驟(al)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測小麥的抗旱性:若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為IOlbp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性強的小麥或候選為抗旱性強的小麥；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為117bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥； (b)包括如下(bl)-(b2)步驟: (bl)以待測小麥的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1或2中所述的引物對B進行PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物； (b2)檢測步驟(bl)所得PCR產(chǎn)`物的大小，按照如下方法確定所述待測小麥的抗旱性:若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為215bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性強的小麥或候選為抗旱性強的小麥；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為219bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥； (c)包括如下(cl)- (c2)步驟: (cl)以待測小麥的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1或2中所述的引物對A和所述的引物對B分別進行PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物； (c2)檢測步驟(Cl)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測小麥的抗旱性:若采用所述引物對A擴增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為IOlbp的DNA片段，且采用所述引物對B擴增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為215bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性強的小麥或候選為抗旱性強的小麥；若采用所述引物對A擴增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為117bp的DNA片段，且采用所述引物對B擴增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為219bp的DNA片段，則所述待測小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述大小為IOlbp的DNA片段為序列表中序列5所示DNA片段；所述大小為117bp的DNA片段為序列表中序列6所示DNA片段；所述大小為215bp的DNA片段為序列表中序列7所示DNA片段；所述大小為219bp的DNA片段為序列表中序列8所示DNA片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:以所述引物對A進行PCR擴增的退火溫度為53°C ；以所述引物對B進行PCR擴增的退火溫度為53°C。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的引物對組或方法在如下(I)- (IV)中的應用: (I)篩選抗旱性強的小麥品種；(II)篩選抗旱性弱的小麥品種； (III)培育抗旱性強的小麥品種； (IV)培育抗旱性弱的小麥品種。
8.培育抗旱性強的小麥品種的方法，包括采用通過權(quán)利要求4-6中任一所述方法檢測得到的所述抗旱性強的小麥品種作為親本進行育種的步驟。
9.培育抗旱性弱的小麥品種的方法，包括采用通過權(quán)利要求4-6中任一所述方法檢測得到的所述抗旱性 弱的小麥品種作為親本進行育種的步驟。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451286SQ201310381510
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】陳東升, 張曉科, 王憲國, 張維軍, 亢玲, 金秀峰, 王小亮, 何進尚 申請人:寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)作物研究所