用于檢測(cè)靶核酸的引物和其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及在樣品中檢測(cè)靶核酸的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及使用聚合酶和 熒光探針在樣品中檢測(cè)目標(biāo)核酸的引物和其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在分子診斷學(xué)領(lǐng)域中，使用核酸擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)微生物核酸進(jìn)行檢測(cè)和量化發(fā)揮重要 的作用。針對(duì)各種病毒或細(xì)菌的常規(guī)檢測(cè)是核酸擴(kuò)增和檢測(cè)反應(yīng)大規(guī)模應(yīng)用的一個(gè)例子。 核酸擴(kuò)增反應(yīng)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的方法是本領(lǐng)域已知的。然而，常規(guī)的PCR檢測(cè) 方式存在需要對(duì)樣品容器進(jìn)行開蓋取樣，造成擴(kuò)增反應(yīng)環(huán)境的污染和導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果的假陽(yáng) 性的缺陷。
[0003] 使用熒光探針監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域已知的?；赑CR的分析的自動(dòng) 化系統(tǒng)可利用PCR過(guò)程期間對(duì)產(chǎn)物擴(kuò)增給出的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。這類方法的關(guān)鍵是 使用攜帶報(bào)告基團(tuán)或標(biāo)記物的經(jīng)修飾的寡核苷酸。
[0004] 熒光探針的一個(gè)實(shí)例是雙標(biāo)記探針，一般由兩種不同染料，也就是報(bào)道分子和猝 滅劑標(biāo)記的寡核苷酸組成，能與特定的目標(biāo)核酸序列雜交。報(bào)道分子是被光激發(fā)時(shí)能夠發(fā) 射熒光的分子，而猝滅劑是能夠吸收?qǐng)?bào)道分子發(fā)射的熒光的分子。PCR反應(yīng)的監(jiān)測(cè)基于當(dāng) PCR反應(yīng)進(jìn)行時(shí)監(jiān)測(cè)熒光隨時(shí)間的強(qiáng)度。現(xiàn)在最常用的熒光檢測(cè)利用的是熒光共振能量轉(zhuǎn) 移（FRET)，這是一種非輻射能量躍遷，通過(guò)分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn) 移到受體激發(fā)態(tài)的過(guò)程。在這種情況下，當(dāng)報(bào)道分子被適當(dāng)波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，報(bào)道分子發(fā)射 的熒光被猝滅劑"猝滅"而觀察到相對(duì)低的熒光強(qiáng)度。如果在PCR的延伸階段期間探針被 DNA聚合酶裂解，報(bào)道分子與探針隔斷，這樣在報(bào)道分子和猝滅劑之間沒(méi)有FRET發(fā)生。監(jiān)測(cè) 熒光強(qiáng)度的變化可以用來(lái)定量地監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)。
[0005] 然而，現(xiàn)有的熒光雙標(biāo)記探針的使用存在相關(guān)的缺陷。例如需要使用大量昂貴的 熒光標(biāo)記的寡核苷酸(包括引物和/或探針)，引物和/或探針設(shè)計(jì)復(fù)雜。
[0006] 因此，本領(lǐng)域還需要一種更方便，精確度更高，而且能夠盡量避免假陽(yáng)性問(wèn)題的 PCR檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增、檢測(cè)和定量靶核酸的方法，其包括以下步驟：
[0008] (a)將樣品在聚合酶的存在下與一對(duì)引物接觸，所述引物與靶核酸的序列可特異 性雜交，其中所述聚合酶為具有3'_5'外切活性的聚合酶，并且所述一對(duì)引物中的至少一個(gè) 為報(bào)告引物，其特征在于：所述報(bào)告引物的3'和5'端分別標(biāo)記了報(bào)告基團(tuán)或淬滅基團(tuán)，所 述報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)被淬滅基團(tuán)淬滅，并且所述報(bào)告引物的3'端的一個(gè)或以上核苷酸與靶核 酸的序列錯(cuò)配，所述報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在錯(cuò)配的核苷酸上；
[0009] (b)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)循環(huán)擴(kuò)增步驟，其中循環(huán)步驟包括雜交步驟和核酸延長(zhǎng)步驟， 所述雜交步驟包括使由所述引物與靶核酸特異性雜交，所述核酸延長(zhǎng)步驟包括在所述聚合 酶的催化下，引物延伸和生成自所述靶核酸衍生的擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0010] (c)測(cè)量報(bào)告基因的信號(hào)，由此對(duì)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)和定量。
[0011] 在本發(fā)明的方法中，所述報(bào)告引物在完整的情況下，例如游離在反應(yīng)溶液中，或是 雖然與靶核酸模板雜交和結(jié)合，但是未被聚合酶的外切活性將標(biāo)記了報(bào)告基團(tuán)或淬滅基團(tuán) 的堿基切除的情況下，報(bào)告基團(tuán)或淬滅基團(tuán)之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使得從報(bào)告染料的熒光發(fā) 射至少部分或完全淬滅。
[0012] 在步驟（b)中，當(dāng)靶核酸為雙鏈DNA時(shí)，循環(huán)步驟還可包括雜交步驟前的變性步 驟，其中雙鏈DNA模板退火，變成單鏈，由此引物可與模板上的靶序列特異性雜交。
[0013] 在步驟（b)中，所述聚合酶的催化作用包括在模板和與模板雜交的引物的存在 (引物提供3'-0H)的條件下，識(shí)別堿基和按5' 一3'的方向合成和延伸核酸，當(dāng)所述聚合 酶識(shí)別到堿基存在不配對(duì)時(shí)，由于聚合酶的3' -5'外切活性，3'端錯(cuò)配的堿基被水解。
[0014] 當(dāng)樣品中存在靶核酸時(shí)，在步驟（b)中，報(bào)告引物與靶核酸發(fā)生特異性雜交，在聚 合酶的作用下延伸，同時(shí)，由于聚合酶的3' -5'外切活性，3'端錯(cuò)配的堿基被水解，標(biāo)記在 所述錯(cuò)配的堿基上的報(bào)告基團(tuán)脫落和離開淬滅基團(tuán)；如果樣品中不存在靶核酸，所述報(bào)告 基團(tuán)的信號(hào)被淬滅基團(tuán)淬滅，檢測(cè)不到熒光信號(hào)；用光源激發(fā)報(bào)道分子；測(cè)量將報(bào)告引物 與靶核酸雜交和延伸的條件下獲得的熒光，或者將其與在對(duì)照核酸存在的條件下獲得的熒 光比較。
[0015] 在本發(fā)明中，有關(guān)術(shù)語(yǔ)具有現(xiàn)有的生物技術(shù)、有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)等領(lǐng)域的常規(guī) 定義。具體的，有關(guān)術(shù)語(yǔ)可如如下說(shuō)明和定義。
[0016] 術(shù)語(yǔ)〃樣品〃指的是包含或推測(cè)包含核酸的任何物質(zhì)。例如從個(gè)體分離的組織或 液體樣品，包括但不限于，例如，皮膚、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、淚液、血細(xì)胞、 器官、腫瘤，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)組分樣品。
[0017] 術(shù)語(yǔ)〃核酸〃、〃多核苷酸〃和〃寡核苷酸〃可互換地使用。這些術(shù)語(yǔ)僅僅涉及核 酸分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)?！ê怂?、〃多核苷酸〃和〃寡核苷酸〃可以為雙鏈和單鏈DNA，以及雙 鏈和單鏈RNA。寡核苷酸一般具有至少大約6個(gè)核苷酸的序列，例如至少大約10-12個(gè)核苷 酸，或至少大約15-20個(gè)核苷酸?！ㄏ鄳?yīng)〃表示與指定序列一致或互補(bǔ)。寡核苷酸可以是來(lái) 自天然的，也可以是合成的，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、逆轉(zhuǎn)錄或其組合。
[0018] 術(shù)語(yǔ)"聚合酶"是指催化核苷酸的聚合（即聚合酶活性）的酶，一般是指DNA聚合 酶。通常，該酶將在退火至多核苷酸模板序列的引物的3'-端開始合成，并將繼續(xù)朝向模板 鏈的5'端。"DNA聚合酶"可催化脫氧核苷酸的聚合。
[0019] 術(shù)語(yǔ)〃引物〃一般指的是在具有催化與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物合成的條件 (例如具有聚合酶和互補(bǔ)序列的模板，以及在合適的溫度）下能夠作為沿著互補(bǔ)鏈合成的起 始點(diǎn)的寡核苷酸。在聚合反應(yīng)體系中，引物可以為一條或多條。術(shù)語(yǔ)"引物對(duì)"表示一組或 一對(duì)引物，其包括與擴(kuò)增的核酸序列的5'末端的互補(bǔ)序列雜交的5'有義引物（有時(shí)稱為 "正向"或"上游"）以及與擴(kuò)增的序列的3'末端雜交的3'反義引物（有時(shí)稱為"反向"或 "下游"）。
[0020] 術(shù)語(yǔ)"堿基配對(duì)"或〃互補(bǔ)〃是指公知的Watson-Crick堿基配對(duì)，包括雙鏈DNA 中堿基對(duì)腺嘌呤-胸腺嘧啶和鳥嘌呤-胞嘧啶之間，或者RNA/DNA雜交分子中腺嘌呤-尿 嘧啶和鳥嘌呤-胞嘧啶之間的配對(duì)，以及非常規(guī)核苷酸或衍生物之間的類似組合。術(shù)語(yǔ)核 酸序列的互補(bǔ)物指的是當(dāng)與核酸序列對(duì)應(yīng)以便一條序列的5'末端與另一條的3'末端配 對(duì)時(shí)處于〃反向平行結(jié)合〃的寡核苷酸。例如，序列5' -AGTTC-3'與序列5' -GAACT-3'是 互補(bǔ)的。術(shù)語(yǔ)〃完全互補(bǔ)的〃或〃100%互補(bǔ)的〃等指的是在反向平行鏈之間具有完美的 Watson-Crick堿基配對(duì)(在多核苷酸雙螺旋中沒(méi)有錯(cuò)配）的互補(bǔ)序列。然而，互補(bǔ)有時(shí)不 是完全的，例如可以包含錯(cuò)配堿基對(duì)或不匹配堿基。術(shù)語(yǔ)〃部分互補(bǔ)〃、〃部分互補(bǔ)的〃、〃 非完全互補(bǔ)〃或〃非完全互補(bǔ)的〃等指的是反向平行多核苷酸鏈之間的任何堿基比對(duì)小 于100%完全的(例如，在多核苷酸雙螺旋中存在至少一個(gè)錯(cuò)配或不匹配堿基)，但仍能形成 比較穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)的情況。例如，反向平行多核苷酸鏈之間的堿基比對(duì)可以是至少99%、 95%、90%，或之間的任何值。
[0021] 術(shù)語(yǔ)〃靶核酸"、〃靶序列〃或〃靶核酸序列〃指