湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，利用妊娠35天的湖北白豬胎兒，經(jīng)機(jī)械剪切和胰酶消化，通過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、液氮凍存、細(xì)胞復(fù)蘇，最終獲得形態(tài)均一、生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC?No.C201331。本發(fā)明得到的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系純度高，形態(tài)一致，無上皮細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞等的混雜。本發(fā)明所建細(xì)胞系可為基因工程、細(xì)胞工程、胚胎工程、免疫學(xué)和分子生物學(xué)提供高品質(zhì)的細(xì)胞素材；可作為豬體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞；是重要的基因資源庫，可作為優(yōu)良地方品種的保種手段之一。
【專利說明】湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系與相關(guān)生物學(xué)特性，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]生物基因資源是人類社會存在與發(fā)展的根本和基礎(chǔ)，是實現(xiàn)社會持續(xù)發(fā)展，維護(hù)國家糧食、生態(tài)安全和社會穩(wěn)定的戰(zhàn)略性資源。近年來，由于地球生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，生物基因資源面臨嚴(yán)重危機(jī)，有的甚至瀕臨衰竭、消亡。生物基因資源的保護(hù)、開發(fā)和利用已經(jīng)引起世界各國政府的高度重視。挽救瀕危物種、保存基因資源、加強開發(fā)利用已成為當(dāng)務(wù)之急。
[0003]我國幅員遼闊，地大物博，具有多彩多姿的生態(tài)、地理、氣候條件，加之擁有較多的民族及風(fēng)格迥異的生活習(xí)慣，在長期的社會發(fā)展和民族融合過程中，廣大勞動人民馴化、培養(yǎng)、選育了數(shù)目眾多的優(yōu)良畜禽品種。如產(chǎn)于關(guān)中平原一帶的秦川牛、華北平原的魯西黃牛，是我國發(fā)展肉牛養(yǎng)殖業(yè)的優(yōu)秀基因資源；灘羊和中衛(wèi)山羊是裘皮中的上品；太湖豬的高繁殖力舉世聞名；五指山豬、廣西巴馬豬、貴州小香豬等則是典型的小型豬的代表，對生物醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。
[0004]盡管我國擁有大量的優(yōu)良畜禽品種，但是受到人們認(rèn)識的限制和現(xiàn)代社會消費需求的影響，大多數(shù)品種的生產(chǎn)力較低，產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量難以滿足人們的需求。因此在農(nóng)業(yè)發(fā)展的過程中，一些地方優(yōu)良品種逐漸為外來品種、雜交品種所取代，地方品種的種群數(shù)量減少，基因資源流失。另外，由于大量引進(jìn)外國品種、生態(tài)環(huán)境惡化、人類過度利用等，優(yōu)良畜禽基因資源狀況堪憂。這將嚴(yán)重影響和制約我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展和競爭力。因此在世界各國展開基因資源搶奪和保護(hù)生物多樣性的今天，通過現(xiàn)代生物技術(shù)的運用，妥善保存優(yōu)良品種的基因資源，具有重大戰(zhàn)略意義 。
[0005]湖北白豬是我國培育成功的肉豬品種之一，湖北白豬原產(chǎn)于湖北武漢市，后引種推廣至鄰近幾省，該品種是選用英國大白豬，丹麥、英國、瑞典和法國的長白豬與地方豬種湖北通城豬雜交，經(jīng)多年的群體繼代選育而成。主要分布于華中地區(qū)。湖北白豬體格較大，全身被毛全白，頭稍輕、直長，兩耳前傾或稍下垂，背腰平直，中軀較長，腹小，腿臂豐滿，肢蹄結(jié)實，有效乳頭12個以上。成年公豬體重250~300公斤，母豬體重200~250公斤。該品種具有瘦肉率高、肉質(zhì)好、生長發(fā)育快、繁殖性能優(yōu)良等特點。6月齡公豬體重達(dá)90公斤；25~90公斤階段平均日增重0.6~0.65公斤，料肉比3.5:1以下，達(dá)90公斤體重為180日齡，產(chǎn)仔數(shù)初產(chǎn)母豬為9.5~10.5頭，經(jīng)產(chǎn)母豬12頭以上，以湖北白豬為母本與杜洛克和漢普夏豬雜交均有較好的配合力，特別與杜洛克豬雜交效果明顯。杜X湖雜交種一代肥育豬20~90公斤體重階段，日增重0.65~0.75公斤，雜交種優(yōu)勢率10%，料肉比3.1~
3.3:1，胴體瘦肉率62%以上，是開展雜交利用的優(yōu)良母本。
[0006]然而，在多年的生產(chǎn)中，由于對湖北白豬的過度使用和忽視原種培育等因素，湖北白豬自身的優(yōu)異基因資源未能得到有效推廣，近年來甚至出現(xiàn)萎縮勢頭，這直接影響到該品種的生存，對我國畜牧業(yè)將造成不能估量的損失。因此，對該品種基因資源進(jìn)行有效保藏，將是延續(xù)其優(yōu)良性能的有力手段。
[0007]目前保存生物基因資源的最佳手段是體細(xì)胞凍存。這是因為該方法簡單易行，穩(wěn)定可靠，且在多個物種基因資源的保藏中得到廣泛運用。而且，該方法獲得的體細(xì)胞適合體外大規(guī)模培養(yǎng)，便于開展各類研究。本發(fā)明即是采用通行的體細(xì)胞凍存法，獲得了形態(tài)均一、生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)。保藏編號為CCTCC No:C201331，保藏日為2013年3月26日，命名為豬屬家豬種(Sus Scrofa domesticus)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系。
[0009]本發(fā)明還提供上述細(xì)胞系的分離、培養(yǎng)、傳代和凍存方法及相關(guān)生物學(xué)特性。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案:
[0011](I)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離
[0012]將發(fā)育至35天的湖北白豬胎兒從母體內(nèi)取出，在滅菌的超凈工作臺上，首先用加1%青鏈雙抗的DPBS (杜氏磷酸緩沖液)洗滌6-8遍，盡可能去除外源污染物質(zhì)；用消毒的鑷子取出背部及臀部的肌肉組織，用剪刀剪成體積約Imm3細(xì)小碎塊，盡可能去除內(nèi)臟及頭部組織以防止混雜其它類型的細(xì)胞。用胰酶消化液消化組織碎塊，培養(yǎng)于39°C、飽和濕度、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)基配方為DMEM+10%胎牛血清。
[0013](2)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)
[0014]密切觀察上述步驟中培養(yǎng)的細(xì)胞。開始培養(yǎng)的3-5天后，即可觀察到成纖維細(xì)胞從組織塊的邊緣向四周擴(kuò)散。此時`每隔3天左右更換新鮮培養(yǎng)基，直到成纖維細(xì)胞鋪滿整個培養(yǎng)板底部。
[0015](3)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
[0016]待步驟(2)中的原代細(xì)胞匯合度達(dá)到100%時，將廢棄的液體培養(yǎng)基倒掉，用預(yù)熱至39°C的加1%青鏈雙抗的DPBS (杜氏磷酸緩沖液)洗滌2次，以徹底去除殘留培養(yǎng)基。加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，再加入等體積完全培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，吸打細(xì)胞成為單細(xì)胞懸液，平均分到2-3個培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)于39°C、飽和濕度、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)。
[0017](4)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的凍存
[0018]待傳代細(xì)胞的匯合度達(dá)到100%時，去除廢棄培養(yǎng)基，DPBS洗滌，胰酶消化為單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到新鮮滅菌的1.5ml離心管內(nèi)，在臺式離心機(jī)上以6000rpm、2min將細(xì)胞聚集于管底，徹底去除上清，加入細(xì)胞凍存液。凍存液的配方為DMEM:胎牛血清:DMS0=6:3:1。仍然將細(xì)胞混勻，用棉花包裹，先在_80°C超低溫冰箱內(nèi)凍存過夜，第二天將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)長期保存。注意標(biāo)明日期和樣品名稱。
[0019](5)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的復(fù)蘇與存活率測定
[0020]從液氮內(nèi)取出I管凍存的細(xì)胞，迅速置于39°C溫水浴內(nèi)不斷搖晃使其融化。吸出細(xì)胞后加到培養(yǎng)瓶內(nèi)，在補加適當(dāng)體積的完全培養(yǎng)基，輕輕搖晃混勻，培養(yǎng)于39 °C、飽和濕度、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)。采用臺盼藍(lán)斥染法計算細(xì)胞存活率。取出適量細(xì)胞加到臺盼藍(lán)染液內(nèi)，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)藍(lán)色細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞存活率的計算公式為:存活率=(1-藍(lán)色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))X 100%。
[0021](6)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的倍增時間測定
[0022]將生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞按照IO4個細(xì)胞/ml的密度鋪到24孔板內(nèi)，從第二天開始以血球計數(shù)板每隔24小時計數(shù)細(xì)胞總數(shù)，至第五天停止。按照細(xì)胞數(shù)量繪制其生長曲線，得到其倍增時間。
[0023](7)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的核型分析
[0024]用秋水仙素處理生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞使其停在分裂中期，經(jīng)固定、Giemsa染色、鏡檢等，獲取100個分裂相的染色體照片，統(tǒng)計整二倍體細(xì)胞的出現(xiàn)比例。湖北白豬細(xì)胞二倍體的染色體數(shù)目為2n=38。
[0025](8)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的G418耐受性測試
[0026]將生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞按照IO4個細(xì)胞/ml密度鋪板于24孔板，第二天更換為新鮮完全培養(yǎng)基后，按照下列G418濃度加藥:200 μ g/ml、400 μ g/ml、600μ g/ml、800l.! g/ml、1000l.! g/ml，放回到培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的死亡情況。當(dāng)在第7天時引起細(xì)胞全部死亡的G418濃度，作為該細(xì)胞系的最佳篩選濃度。
[0027](9)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞攝取外源基因的能力測試
[0028]將生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞按照IO4個細(xì)胞/ml密度鋪板于24孔板，第二天更換為新鮮完全培養(yǎng)基后，按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,報告載體為PEGFP-Nl。48小時后計數(shù)綠色熒光蛋白的細(xì)胞比例，計算該細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率，作為評價其攝取外源基因能力的指標(biāo)。
[0029](10)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的篩選
[0030]將生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞按照50%匯合度鋪板于24孔板，第二天更換為新鮮完全培養(yǎng)基后，按照LipOfectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，報告載體為pEGFP-Nl。48小時后，按照測定的濃度加入G418，篩選7天，此時可見發(fā)出均勻綠色熒光的單克隆。采用胰酶點消化法分離單克隆后，在培養(yǎng)板內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到足量的帶有外源報告基因的轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞。
[0031](11)湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的重編程能力
[0032]將步驟(10)分離到的轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞通過核移植的方法，注射到去核的體外成熟豬卵母細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過融合、激活、體外培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察重構(gòu)胚的卵裂、熒光表達(dá)等，評價其發(fā)育能力，即重編程能力。
[0033]本發(fā)明所提供的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系，可以作為豬體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞使用。
[0034]本發(fā)明利用妊娠35天的湖北白豬的胎兒，取出背部及臀部的肌肉組織，經(jīng)機(jī)械剪切和胰酶消化，通過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、液氮凍存、細(xì)胞復(fù)蘇，最終獲得形態(tài)均一、生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系。本發(fā)明對其培養(yǎng)、傳代、凍存等體系進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。該細(xì)胞系可為基因工程、細(xì)胞工程、胚胎工程、免疫學(xué)和分子生物學(xué)提供高品質(zhì)的細(xì)胞素材；可作為豬體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞；在畜牧業(yè)上能為豐富并改良地方品種提供優(yōu)異的實驗材料；是重要的基因資源庫，可作為優(yōu)良地方品種的保種手段之一；可為基因功能解析、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等基礎(chǔ)研究提供優(yōu)良的細(xì)胞模型；是建立豬誘導(dǎo)干細(xì)胞和轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的重要原始素材。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)照片
[0036]將妊娠35天的湖北白豬胎兒用剪刀剪成細(xì)小碎片，用胰酶消化后接種到培養(yǎng)板內(nèi)，添加完全培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在第5天左右,可在光學(xué)顯微鏡下觀察到有成纖維細(xì)胞從組織塊周圍溢出，并向四周擴(kuò)散。圖中視野的放大倍數(shù)為20X。
[0037]圖2湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞生長曲線
[0038]湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的生長呈現(xiàn)“S”形，即在一定密度接種后，其生長密度以“慢-快-慢”的形式遞增。第I天為適應(yīng)期，此后進(jìn)入快速增值期，在第4天后進(jìn)入平臺期。平均倍增時間為24小時，屬于生長旺盛的細(xì)胞類型。圖中數(shù)據(jù)點表示三個生物學(xué)重復(fù)的均數(shù)(Mean),誤差棒表不標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。
[0039]圖3湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞核型
[0040]豬的染色體數(shù)目為2X 19=38條。采用DAPI染色法分析處于分裂中期的染色體形態(tài)特征，采用LSM510META共聚焦顯微鏡成像,LSM Image Examiner分析圖像。圖中顯示所分離的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞具有19對清晰染色體，表明核型正常。
[0041]圖4湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞G418耐受性
[0042]將生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞按照一定密度接種后加入G418濃度梯度進(jìn)行耐藥實驗，以在第7天全部死亡的細(xì)胞作為該細(xì)胞系的最佳篩選濃度。圖中顯示在600 μ g/ml的G418作用下，該細(xì)胞系在第7天的時候全部死亡。低于此濃度，細(xì)胞仍然存活；高于此濃度，細(xì)胞提前開始全部死亡?；疑菫樵摑舛鹊淖饔们€。圖中數(shù)據(jù)點表示三個生物學(xué)重復(fù)的均數(shù)(Mean)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。
[0043]圖5湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率
[0044]以紅色突光蛋白表達(dá)載體pDsred-monomer為報告基因，按照脂質(zhì)體Lipofectamine2000的標(biāo)準(zhǔn)步驟轉(zhuǎn)染湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞，48小時后觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)并計算轉(zhuǎn)染效率。左圖為亮視野，右圖為紅色熒光視野。轉(zhuǎn)染效率為75%。
[0045]圖6湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系單克隆
[0046]將報告載體pEGFP-Nl轉(zhuǎn)染于湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞，G418篩選，胰酶點消化法挑取單克隆。圖中為正在生長的轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞系，可見所有細(xì)胞發(fā)出均勻綠色熒光。
[0047]圖7湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的重編程能力
[0048]將表達(dá)EGFP的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體，以體外成熟的豬卵母細(xì)胞作為受體，采用盲吸法去核、移植、融合、激活，體外培養(yǎng)，觀察重構(gòu)胚的卵裂和EGFP的表達(dá)水平。以無供體細(xì)胞的豬孤雌胚作為對照。左上圖為孤雌胚的亮視野，右上圖為孤雌胚的熒光視野，左下圖為重構(gòu)胚的亮視野，右下圖為重構(gòu)胚的熒光視野。圖中顯示孤雌胚在熒光激發(fā)下無熒光細(xì)胞，證明孤雌胚本身的背景熒光極低；而重構(gòu)胚在熒光激發(fā)下發(fā)出明亮的綠色熒光，證明重構(gòu)胚卵裂球的熒光是來自表達(dá)EGFP的供體細(xì)胞，說明湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞具有重編程能力，可以用于體細(xì)胞核移植以及相關(guān)研究。
【具體實施方式】[0049]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體實驗條件和方法者，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實驗指南第三版所建議的條件。
[0050]實施例1湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)。
[0051]⑴材料
[0052]
【權(quán)利要求】
1.湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0.201331。
2.權(quán)利要求1所述的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，利用妊娠35天的湖北白豬的胎兒，取出背部及臀部的肌肉組織，經(jīng)機(jī)械剪切和胰酶消化，通過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、液氮凍存、細(xì)胞復(fù)蘇，最終獲得形態(tài)均一、生長旺盛的湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系。
3.權(quán)利要求1所述的 湖北白豬胎兒成纖維細(xì)胞系作為豬體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞的用途。
【文檔編號】C12N15/873GK103509752SQ201310381274
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】畢延震, 劉西梅, 肖紅衛(wèi), 鄭新民, 華文君, 張立蘋 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所