一種檢測七星瓢蟲的引物對、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測七星瓢蟲的引物對，所述引物對序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明還涉及含有所述引物對的試劑盒及用引物對和試劑盒檢測七星瓢蟲的檢測方法。本發(fā)明的檢測方法簡單、快速、特異、靈敏。
【專利說明】一種檢測七星瓢蟲的弓I物對、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及用于檢測七星瓢蟲的引物對、試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]七星瓢蟲Coccinella septempunctata L.是一種鞘翅目瓢蟲科捕食性天敵昆蟲，成蟲和幼蟲可捕食麥蚜、棉蚜、槐蚜、桃蚜、介殼蟲、壁虱等害蟲，減輕樹木、瓜果及各種農(nóng)作物遭受害蟲的損害，被人們稱為“活農(nóng)藥”。除了冬季外，戶外有蚜蟲發(fā)生的地方均有機(jī)會找到前來覓食的七星瓢蟲成蟲，但其較少成群聚集。一年發(fā)生多代，以成蟲過冬，次年4月出蟄，產(chǎn)卵于有蚜蟲的植物上。分布范圍廣，在中國(北京、河北、黑龍江、吉林、河南、陜西、甘肅、新疆、西藏、云南、貴州、四川、湖北、湖南、浙江、福建、廣東、廣西、海南、臺灣等)、蒙古、朝鮮、日本、印度、前蘇聯(lián)、古北區(qū)、歐洲都有它的蹤跡。
[0003]七星瓢蟲成蟲體長:5.2-7.0mm,體寬:4.0-5.6mm。體周緣卵形,背面光滑無毛。頭黑色。前胸背板黑色，在其前角上各有一個(gè)大型近于四邊形的淡黃色斑，伸展到緣折上形成窄條。小盾片黑色。鞘翅紅色或橙紅色，兩鞘翅·上共有7個(gè)黑斑，其中位于小盾片下方的小盾斑被鞘翅分割為兩邊一半，其余每一鞘翅上各有3個(gè)黑斑。鞘翅基部靠小盾片兩側(cè)各有一個(gè)小三角形的白斑。七星瓢蟲以鞘翅上有7個(gè)黑色斑點(diǎn)而得名。每年發(fā)生世代數(shù)因地區(qū)不同而異。例如，在河南安陽地區(qū)每年發(fā)生6-8代。北方寒冷地區(qū)，發(fā)生世代數(shù)則較少。七星瓢蟲成蟲壽命長，平均77天。I頭七星瓢蟲雌蟲可產(chǎn)卵567-4475粒，平均每天產(chǎn)卵78.4粒，最多可達(dá)197粒。七星瓢蟲取食量大小與氣溫和獵物密度有關(guān)。以捕食蚜蟲為例，在獵物密度較低時(shí)，捕食量隨密度上升而呈指數(shù)增長；在密度較高時(shí)，捕食量則接近極限水平。較高的氣溫可影響七星瓢蟲的活動能力，提高其捕食率。據(jù)統(tǒng)計(jì)，不同蟲態(tài)七星瓢蟲對煙蚜的平均日取食量分別為:I齡10.7頭，2齡33.7頭，3齡60.5頭，4齡124.5頭，成蟲130.8頭。七星瓢蟲近80天的生命期可取食上萬頭蚜蟲。七星瓢蟲對人、畜和天敵動物無毒無害，作為農(nóng)田重要的天敵昆蟲，其合理利用可減輕農(nóng)藥使用，減少環(huán)境污染，取得良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。早在20世紀(jì)70年代黃河下游地區(qū)即已用助遷法利用七星瓢蟲防治棉花和小麥蚜蟲，90年代開始人工繁殖，并用于生產(chǎn)。
[0004]瓢蟲種類全世界記載約500屬5000種，中國已記錄近400種。種類繁多且僅根據(jù)形態(tài)描述準(zhǔn)確判斷瓢蟲種類有一定的難度。此外，不同瓢蟲間還普遍存在集團(tuán)內(nèi)捕食的現(xiàn)象，但常規(guī)的腸道解剖、行為觀察等方法無法準(zhǔn)確評估這種重要的捕食關(guān)系。因此要更好地鑒定瓢蟲種類及研究瓢蟲的集團(tuán)內(nèi)捕食作用，需要建立一套快速而準(zhǔn)確的分子檢測方法，但目前對于七星瓢蟲尚沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction, PCR)技術(shù)可根據(jù)物種特異性引物清楚區(qū)分至種，以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速的特點(diǎn)在物種種類鑒定中占據(jù)重要地位。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:提供一種快速、簡單、特異且靈敏地檢測七星瓢蟲的鑒定方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供一種用于檢測七星瓢蟲的引物對，所述引物對序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的序列。
[0007]本發(fā)明還提供一種含有SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示序列的引物對的試劑盒。
[0008]本發(fā)明還提供一種檢測七星瓢蟲的方法，包括用所述引物對或者含所述引物對的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
[0009]具體步驟為，從樣品中提取基因組DNA為模板；利用所述引物對或者含所述引物對的試劑盒中的弓I物對作為PCR擴(kuò)增的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并作出判斷。
[0010]所述PCR 反應(yīng)體系為 20 μ L，其中 10 X EasyTaq buffer2.0 μ L、dNTP (2.5mM)
0.4μ UEasyTaq聚合酶(5U/y L) 0.2 μ L、上游引物和下游引物(10p/mol)各0.4 μ L、樣品基因組DNAL O μ L、超純水15.6 μ L。
[0011]所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、54°C退火30s、72°C延伸30s, 40個(gè)循環(huán)。
[0012]所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物是采用 電泳檢測，出現(xiàn)189bp左右的特異性擴(kuò)增條帶即判斷為檢出七星瓢蟲。
[0013]本發(fā)明提供了前述引物對及試劑盒在檢測七星瓢蟲中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明弓I物對是通過通用弓丨物對L印Fl (ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG)和L印Rl (TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA)擴(kuò)增不同瓢蟲線粒體細(xì)胞色素氧化酶I亞基(cytochromeoxidase subunit I，C0I)基因序列進(jìn)行比對設(shè)計(jì)得到。
[0015]使用本發(fā)明的引物對，能夠特異、靈敏地?cái)U(kuò)增出目的片段。
[0016]使用本發(fā)明的引物對進(jìn)行檢測，實(shí)施例顯示，只有七星瓢蟲特異性產(chǎn)生189bp的擴(kuò)增條帶，其他58種近源種、屬瓢蟲以及其他昆蟲均未產(chǎn)生189bp的擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明建立的PCR方法具有良好的特異性，可用于七星瓢蟲的檢測。
[0017]使用本發(fā)明的引物對進(jìn)行檢測，可從七星瓢蟲DNA濃度為0.375ng/ μ L的樣品中成功檢測出七星瓢蟲。具有較高的靈敏度，符合日常檢測的要求。
[0018]使用本發(fā)明的引物對進(jìn)行檢測，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)；本發(fā)明的PCR檢測方法，具有高效、快速和敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為七星瓢蟲引物CsF6/R6特異性檢測瓊脂凝膠電泳圖(1_114為棉田常見昆蟲模板；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp ladder ； 一:陰性對照)。
[0020]圖2為七星瓢蟲引物CsF6/R6質(zhì)粒濃度梯度檢測瓊脂凝膠電泳圖(1_7為模板質(zhì)粒濃度1.385541649E+07依次10倍稀釋濃度梯度；一:陰性對照；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp ladder)。
[0021]圖3為七星瓢蟲引物CsF6/R6DNA濃度梯度檢測瓊脂凝膠電泳圖(1-7為模板DNA濃度3ng/ μ L依次2倍稀釋濃度梯度；一:陰性對照；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp ladder)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0023]實(shí)施例1檢測引物CsF6/R6對七星瓢蟲的擴(kuò)增效果
[0024](I)瓢蟲模板DNA的制備
[0025]將單頭瓢蟲放入1.5ml離心管中將其磨碎,用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生物(北京)有限公司)提取單頭瓢蟲
基因組。
[0026](2)合成檢驗(yàn)七星瓢蟲的特異性COI引物
[0027]本發(fā)明弓I物對是通過通用弓I物對L印Fl (ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG)和L印Rl (TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA)擴(kuò)增不同瓢蟲線粒體細(xì)胞色素氧化酶I亞基(cytochromeoxidase subunit I， C0I)基因序列進(jìn)行比對設(shè)計(jì)得到。
[0028]設(shè)計(jì)得到檢驗(yàn)七星瓢蟲的特異性COI引物對:
[0029]Primer CsF6:5，-AATATACGACCATTTGGC-3，
[0030]Primer CsR6:5，-TTGATAAAGGATGGGATCT-3’
[0031](3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0032]I)反應(yīng)體系
[0033]反應(yīng)體系為20 μ L，其中 IOX EasyTaq buffer2.0 μ L、dNTP (2.5mM) 0.4 μ L、EasyTaq聚合酶(5U/ μ L) 0.2 μ L、上游引物和下游引物(I Op/mo I)各0.4 μ L、模板DNAL O μ L、超純水 15.6μ L0
[0034]2) PCR擴(kuò)增程序
[0035]本發(fā)明PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、54°C退火30s、72°C延伸30s, 40個(gè)循環(huán)。
[0036](4)鑒定PCR產(chǎn)物
[0037]取10 μ L產(chǎn)物用1.0% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化以錠染色后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
[0038](5)實(shí)施結(jié)果
[0039]利用引物CsF6/CsR6以七星瓢蟲基因組DNA為模板，以常見瓢蟲以及其他昆蟲種類(見表I)為對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。從圖1中可以看到，利用引物CsF6/CsR6擴(kuò)增后，在1、2泳道的七星瓢蟲中擴(kuò)增出了 189bp的目的條帶，在其他3-114泳道中均無擴(kuò)增產(chǎn)物。說明本發(fā)明的特異性PCR引物CsF6/CsR6的特異性強(qiáng)。擴(kuò)增出的189bp片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0040]表I引物種特異性檢驗(yàn)中所用的昆蟲種類
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測七星瓢蟲的引物對，其特征在于，所述引物對序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的序列。
2.含有權(quán)利要求1所述引物對的試劑盒。
3.—種檢測七星瓢蟲的方法，其特征在于，包括用權(quán)利要求1的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從樣品中提取基因組DNA為模板；利用權(quán)利要求I所述的引物對作為PCR擴(kuò)增的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并作出判斷。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為20yL，其中IOXEasyTaq buffer2.0 μ L.dNTP (2.5mM) 0.4 μ UEasyTaq 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L、上游弓丨物和下游引物(10p/mol)各0.4μ L、樣品基因組DNA1.0μ L、超純水15.6 μ L0
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min;94°C變性30s、54°C退火30s、72°C延伸30s，40個(gè)循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的檢測擴(kuò)增產(chǎn)物是采用電泳檢測，出現(xiàn)189bp左右的特異性擴(kuò)增條帶即判斷為檢出七星瓢蟲。
8.權(quán)利要求1所述的引物對在檢測七星瓢蟲中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2所述的 試劑盒在檢測七星瓢蟲中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK103436617SQ201310373403
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日
【發(fā)明者】楊帆, 王倩, 陸宴輝, 徐建祥 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所