專利名稱：利用高通量組織芯片檢測bsp在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)領(lǐng)域，特別涉及一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中最多見的腫瘤，其中70%是惡性膠質(zhì)瘤，是CNS起源的腫瘤中最常見和最致命的腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率和死亡率。膠質(zhì)瘤中最有生物學(xué)侵襲性的亞型是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM，WHO IV級的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，其預(yù)后令人沮喪。目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括最大程度的切除腫瘤以及隨后使用DNA烷化劑、替莫唑胺進(jìn)行化療和放療。但盡管經(jīng)過上述的有效治療，GBM和間變型星形細(xì)胞瘤(WHO III級)的預(yù)后生存期仍很短，中位生存期分別只有約14-16個月和2-5年。目前已做了大量的 努力來鑒定GBM中的基因?qū)W變化或其分子靶標(biāo)，這些基因變化或分子靶標(biāo)有助于區(qū)分GBM患者的不同亞組，每個亞組有不同的預(yù)后和對特異性治療不同的臨床反應(yīng)。替莫唑胺臨床反應(yīng)最主要的決定因素之一是MGMT的甲基化水平。MGMT啟動子甲基化可見于40%-60%的病人，并與對替莫唑胺治療的良好反應(yīng)相關(guān)。最近，在多達(dá)75%的2級和3級彌漫性星形細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)了基因編碼的異檸檬酸脫氫酶(IDHl)的突變，目前已發(fā)現(xiàn)IDHl的突變是2-4級膠質(zhì)瘤總體生存期和無進(jìn)展生存期的一個主要的預(yù)后指標(biāo)。腫瘤的侵襲能力通?？赏ㄟ^癌細(xì)胞的高運(yùn)動性和用于降低胞外基質(zhì)的蛋白酶的表達(dá)量增加來預(yù)測。骨唾液蛋白(BSP)作為基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2)的一個特異性的調(diào)控者，由IBSP基因編碼，屬于小型N端連接整合糖蛋白(SIBLING)基因家族一員。BSP在諸如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥中都是高表達(dá)的，并可能有助于這些癌的侵襲潛能。一項早期的研究表明BSP對于臨床局限的前列腺惡性腺癌在統(tǒng)計學(xué)上有顯著的預(yù)后價值。類似的結(jié)果在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、人類上皮癌、胰腺癌和骨肉瘤中都有發(fā)現(xiàn)。但在膠質(zhì)瘤組織中尚未有BSP的表達(dá)及其預(yù)后價值的研究。組織芯片(TMA)技術(shù)的發(fā)展，得益于生物芯片技術(shù)等的延伸。TMA具有高通量、快速、低誤差、用途廣泛等特點(diǎn)，目前主要應(yīng)用在腫瘤病理學(xué)、實驗室檢測、藥物研究等。利用組織芯片技術(shù)可以在細(xì)胞水平定位和蛋白水平檢測相應(yīng)靶標(biāo)，從而實現(xiàn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物與組織形態(tài)學(xué)研究以及臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，同時還可以與原位雜交技術(shù)等相結(jié)合，因此TMA被廣泛應(yīng)用在腫瘤病理研究中，例如EMSY通路在乳癌及卵巢癌中的關(guān)系，AlphaB-Crystallin與乳癌的關(guān)系，TMPRSS2和ETS轉(zhuǎn)移因子在前列腺癌的重要作用等。TMA常見類型有演化TMA、預(yù)后TMA等。演化TMA指將某一腫瘤疾病發(fā)展的各個階段的標(biāo)本(諸如原發(fā)間變和繼發(fā)膠母、原發(fā)膠母和復(fù)發(fā)膠母等)集中在一塊TMA中，能在一張切片上同時看到腫瘤組織在原位、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等不同進(jìn)展階段的變化情況，可用以檢測特定腫瘤在不同發(fā)展階段的分子病理改變，有助于對腫瘤發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移等過程的研究。預(yù)后TMA是將帶有可利用的臨床隨訪數(shù)據(jù)的腫瘤標(biāo)本集中在一張TMA中。使用預(yù)后TMA可以研究已知的分子靶標(biāo)的改變或信號傳導(dǎo)通路的變化對腫瘤患者預(yù)后的影響[2]。TMA陣列中每個組織片段都對應(yīng)于相應(yīng)患者，因此利用TMA，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)和隨訪資料，可以對腫瘤患者進(jìn)行大規(guī)模的回顧性數(shù)據(jù)分析，為疾病的早期診斷、早期治療等提供指導(dǎo)。文獻(xiàn)報道利用預(yù)后TMA發(fā)現(xiàn)Cyclooxygenase-2對鼻咽癌患者放療預(yù)后有預(yù)測價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，該方法使得檢測BSP的表達(dá)的靈敏性大大提高，能保證在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息。本發(fā)明的一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括:(I)使用Trizol試劑將腦組織進(jìn)行總RNA的分離；(2)對步驟(I)得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；(3)將上述cDNA與SYBR熒光染料混合并進(jìn)行擴(kuò)增；(4)IBSP的表達(dá)通過抗GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用以下方程進(jìn)行比較閾值循環(huán)法:表
=2~^Δ目標(biāo)基因的ct值—Δ參照ct值).
(5)構(gòu)建組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。步驟(I)中所述的腦組織為膠質(zhì)瘤或正常腦組織。步驟(2)中所述的總RNA的質(zhì)量為2ug,得到cDNA的質(zhì)量為20ng。步驟(2)中所述的反轉(zhuǎn)錄為使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄箱進(jìn)行的。步驟(3)中所述的擴(kuò)增為在CFX96實時探測系統(tǒng)中進(jìn)行。步驟(3)中所述的擴(kuò)增條件為42°C孵育60分鐘，95°C孵育5分鐘后冰上冷卻。所用的引物為:IBSP，5’-AAAGTGAGAACGGGGAACCTR-3’正鏈，5’-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3’ 反鏈；GAPDH, 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ 正鏈，5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ 反鏈。在本發(fā)明中我們試圖通過實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)和組織芯片的免疫組化來檢測BSP的表達(dá)，以研究BSP的表達(dá)和膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征間的關(guān)系。我們的研究顯示BSP在特定的膠質(zhì)瘤組織中是高表達(dá)的，并且其高表達(dá)與腫瘤級別相關(guān)，預(yù)示了膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后不良。本發(fā)明利用高通量組織芯片進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤預(yù)后方面的研究，制備的組織芯片屬于預(yù)后TMA。進(jìn)行的TMA制備總共包含300例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和16例正常腦組織標(biāo)本。300例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，星形細(xì)胞起源占78.1%，其他包括少突、室管膜、原始神經(jīng)外胚層等起源占21.9% ;病理級別中，高級別膠質(zhì)瘤占60.1%，GBM占39.5%。制備的腦膠質(zhì)瘤組織芯片目前在國內(nèi)樣本量最大，隨訪周期較長，94%左右(284/300)的患者獲得了詳細(xì)的隨訪。腦膠質(zhì)瘤組織芯片的制備為潛在性的腦膠質(zhì)瘤靶標(biāo)G0LPH3、BSP與膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)性研究提供了堅實的基礎(chǔ)。BSP通過何種分子機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展已在多項研究中有闡述。BSP可以與MMP2結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性，從而激活MMP通路。 它還可加快增殖、侵襲以及癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。BSP也可以作為一個前血管生成因子通過與整合蛋白ανβ3結(jié)合促進(jìn)血管生成。然而，BSP在膠質(zhì)瘤發(fā)生和進(jìn)展中的作用尚未知。膠質(zhì)瘤患者血清中BSP的含量及其與預(yù)后和治療反應(yīng)的關(guān)系仍有待研究。血清BSP含量已被證明可用于預(yù)測乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移和生存以及前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。研究血清BSP是否能作為一個便利的分子標(biāo)記物來定義有腫瘤進(jìn)展或預(yù)后不良風(fēng)險的膠質(zhì)瘤病人亞組是很有臨床意義的。2級或3級的膠質(zhì)瘤病人在復(fù)發(fā)時有可能向4級GBM進(jìn)展(繼發(fā)性GBM)。同樣也有可能部分原發(fā)的GBM是在經(jīng)過了一系列類似繼發(fā)GBM的遺傳學(xué)改變后才發(fā)生的，但在腫瘤發(fā)生前并沒有引起臨床的重視，直到其惡性進(jìn)展為GBM發(fā)生才發(fā)現(xiàn)。目前為止還沒有一個很好的方法能區(qū)分原發(fā)和繼發(fā)的GBM，因為二者的組織病理改變還無法區(qū)分。我們使用實時RT-PCR和組織芯片的免疫組化方法檢測了包含15例正常腦組織及270例膠質(zhì)瘤樣本中BSP的表達(dá)量。通過Kaplan-Meier方法計算累積生存并使用log-rank測試來分析。應(yīng)用階梯式前行Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素分析。高級別膠質(zhì)瘤樣本中BSP無論在mRNA還是蛋白水平的表達(dá)上都明顯高于正常腦組織及低級別膠質(zhì)瘤樣本，且明顯與腫瘤級別相關(guān)(P <0.001)。單因素和多因素分析顯示在3級和4級膠質(zhì)瘤患者中，BSP的高表達(dá)對于較短的無進(jìn)展生存期(PFS)和總體生存期(OS)來說是一個獨(dú)立預(yù)后相關(guān)因素(3級和4級的危害比(HR)分別為2.549，3.154和1.637，1.574)。相比BSP高表達(dá)的患者，BSP表達(dá)低的患者則有明顯較長的中位OS和PFS。在3級膠質(zhì)瘤患者中，切除程度小和星形細(xì)胞系起源是較短的PFS和OS的獨(dú)立危險因素；有O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)甲基化和卡諾夫斯基評分(KPS)低于70分的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者預(yù)后較差。高級別膠質(zhì)瘤中，未做放療治療與較短的OS有關(guān)，但不影響PFS。BSP的表達(dá)在高級別膠質(zhì)瘤患者中明顯升高，并預(yù)示了不良預(yù)后。這項研究發(fā)現(xiàn)了一個可用于膠質(zhì)瘤分類及靶向治療的潛在分子靶標(biāo)?？傊?，我們證明了 BSP的高表達(dá)與腫瘤級別增高以及術(shù)后較短的PFS和OS相關(guān)，并且BSP可有助于定義具有腫瘤進(jìn)展或預(yù)后不良風(fēng)險的膠質(zhì)瘤病人亞組，因此作為膠質(zhì)瘤病人的一個獨(dú)立預(yù)后因素。此外，理解BSP相關(guān)的分子通路可有助于膠質(zhì)瘤最新治療藥物的發(fā)展。 有益.效果( I)本發(fā)明的方法使得檢測BSP的表達(dá)的靈敏性大大提高，能保證在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息；(2)腦膠質(zhì)瘤組織芯片的制備為潛在性的腦膠質(zhì)瘤靶標(biāo)G0LPH3、BSP與膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)性研究提供了堅實的基礎(chǔ)；(3)因BSP的高表達(dá)與腫瘤級別增高以及術(shù)后較短的PFS和OS相關(guān)，檢測BSP的表達(dá)具有重要的醫(yī)學(xué)價值。


圖1為正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中BSP的免疫組化染色。正常腦組織中BSP的免疫組化染色(A，B，染色強(qiáng)度評分=2)，I級毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤(C，染色強(qiáng)度評分=3)，2級星形細(xì)胞瘤(D，染色強(qiáng)度評分=3)，2級少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(E，染色強(qiáng)度評分=3)，3級間變少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(F，染色強(qiáng)度評分=6)，3級間變星形細(xì)胞瘤(G，染色強(qiáng)度評分=6)和4級(H，染色強(qiáng)度評分=9)膠質(zhì)瘤組織樣本。
圖2為膠質(zhì)瘤病人的存活和BSP表達(dá)圖。270例膠質(zhì)瘤病人和162例高級別膠質(zhì)瘤病人的無進(jìn)展生存期曲線圖(A)和總體生存期曲線圖(B)。定量RT-PCR試驗(C)和免疫組化染色(D)顯示高級別膠質(zhì)瘤組織中BSP mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均明顯高于低級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織。數(shù)據(jù)以平均值+_標(biāo)準(zhǔn)差來顯示，使用曼-惠特尼U檢驗來比較兩組間的不同。圖3為在3級和4級膠質(zhì)瘤病人中，BSP的高表達(dá)與較短的無進(jìn)展生存期和總體生存期有關(guān)。利用BSP表達(dá)對3級膠質(zhì)瘤病人的無進(jìn)展生存期(A)及K-M生存曲線(B)進(jìn)行分層。利用BSP表達(dá)對4級膠質(zhì)瘤病人的無進(jìn)展生存期(C)及K-M生存曲線(D)進(jìn)行分層。圖4為3級和4級膠質(zhì)瘤病人生存和進(jìn)展的多因素分析。3級膠質(zhì)瘤病人中與OS(A)和PFS (B)相關(guān)因素及4級膠質(zhì)瘤病人中與OS (C)和PFS (D)相關(guān)因素的危害比及95%可信區(qū)間。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。 實施例1(I)組織樣本的獲取這項研究的方案和組織樣本的獲取是經(jīng)過中國，上海，第二軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)的。膠質(zhì)瘤組織樣本來源于之前已收集的病人組織樣本，這些樣本是從1999年I月至2008年12月間在上海長征醫(yī)院神經(jīng)外科住院接受外科手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤患者身上獲得。正常腦組織樣本則是來源于嚴(yán)重的腦創(chuàng)傷病人，這些病人必須切除部分正常腦組織以減輕顱內(nèi)壓。這些病人或其法律代理人已簽署了書面的手術(shù)治療知情同意書并允許我們使用切除的組織樣本。這項研究中病人的選擇標(biāo)準(zhǔn)如下:1、診斷為原發(fā)膠質(zhì)瘤且無其他腫瘤病史；2、有完整的臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、臨床表現(xiàn)、平均腫瘤直徑(MTD，定義為MRI掃描上腫瘤3條直徑的幾何平均值)、切除程度、組織學(xué)類型、病理級別和輔助治療等；3、病人術(shù)后至少每6個月接受一次增強(qiáng)的頭部MRI掃描以觀察腫瘤是否有復(fù)發(fā)或進(jìn)展；
4、組織樣本有足夠?qū)嶒炇褂玫牧?。這些病人被分為兩組，兩組之間無交叉。所有的病理診斷均經(jīng)過兩位有經(jīng)驗的病理學(xué)家獨(dú)立診斷，依據(jù)2007年WHO對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類。在第一組中，從25例低級別膠質(zhì)瘤、30例高級別膠質(zhì)瘤和7例正常腦組織樣本中取下的新鮮冰凍樣本是從手術(shù)中直接獲取的并用于real-time RT-PCR。在第二組中，從300例不同級別膠質(zhì)瘤病人中獲取了石蠟包埋組織樣本，從16例創(chuàng)傷病人中獲取了正常腦組織樣本(均得到了病人家屬的同意)?；谶@些樣本構(gòu)建了組織芯片(TMA)。(2)實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)從25例低級別膠質(zhì)瘤、30例高級別膠質(zhì)瘤和7例正常腦組織中獲取的62例新鮮速凍組織使用Trizol試劑進(jìn)行總RNA的分離。隨后使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄箱(Promega公司)對總RNA (2μ g)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA(20ng)與SYBR熒光染料混合并在CFX96實時探測系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增。每一步反應(yīng)均一式三份。IBSP的表達(dá)通過抗GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用以下方程進(jìn)行比較閾值循環(huán)(ct)法:表達(dá)折疊差異=2_u下列引物用于
RT-PCR:1BSP，5’ -AAAGTGAGAACGGGGAACCTR-3’(正鏈)和 5’ -GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3’(反鏈)；GAPDH, 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ 正鏈)和 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(反鏈)。具體RT-PCR反應(yīng)步驟:I)總RNA抽提:根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說明書進(jìn)行,均為RNase-free操作。a.使用經(jīng)過培育的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，離心去細(xì)胞上清，每孔加入1000 μ I Trizol，吹打后室溫靜置5min,后轉(zhuǎn)移至另一新的L 5ml eppendorf管中；b.每管加入200 μ I氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置15min ；c.4°C,離心機(jī) 12000rpm,離心 15min ；d.從每管中吸取上清至另一新的1.5ml eppendorf管,加入等體積異丙醇,混勻后4。。沉淀IOmin ；e.4°C,離心機(jī)12000rpm離心IOmin后，去上清；f.加入至少lml4°C預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁；g.4°C,離心機(jī) IOOOOrpm 離心 5min,棄上清；h.40C,離心機(jī)IOOOOrpm再次離心5min,吸去殘液,室溫干燥(不需完全干燥)；1.加入20 μ I RNase-free 7jC,至完全溶解，紫外分析儀測定所抽提RNA的濃度；2)總 RNA 純化a.按下表配置反應(yīng)體系；
權(quán)利要求
1.種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括: (1)使用Trizol試劑將腦組織進(jìn)行總RNA的分離； (2)對步驟(1)得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA； (3)將上述cDNA與SYBR熒光染料混合并進(jìn)行擴(kuò)增； (4)IBSP的表達(dá)通過抗GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用以下方程進(jìn)行比較閾值循環(huán)法:表達(dá)折 =2 目標(biāo)基因的ct值-Δ參照ct值).(5)構(gòu)建組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(1)中所述 的腦組織為膠質(zhì)瘤或正常腦組織。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的總RNA的質(zhì)量為2ug，得到cDNA的質(zhì)量為20ng。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的反轉(zhuǎn)錄為使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄箱進(jìn)行的。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的擴(kuò)增為在CFX96實時探測系統(tǒng)中進(jìn)行。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的擴(kuò)增條件為42°C孵育60分鐘，95°C孵育5分鐘后冰上冷卻。
7.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:所用的引物為:IBSP，5’ -AAAGTGAGAACGGGGAACCTR-3’正鏈，5’-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3’ 反鏈；GAPDH, 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ 正鏈，5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ 反鏈。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用高通量組織芯片檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括(1)使用Trizol試劑將腦組織進(jìn)行總RNA的分離；(2)對步驟(1)得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA；(3)將上述cDNA與SYBR熒光染料混合并進(jìn)行擴(kuò)增；(4)IBSP的表達(dá)通過抗GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用方程進(jìn)行比較閾值循環(huán)法；(5)構(gòu)建組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢測BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。本發(fā)明的方法使得檢測BSP的表達(dá)的靈敏性大大提高，能保證在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息；檢測BSP的表達(dá)具有重要的醫(yī)學(xué)價值。
文檔編號C12Q1/68GK103088130SQ201310012888
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者陳菊祥, 徐濤, 秦榮, 盧亦成, 嚴(yán)勇, 周勁旭, 王洪祥 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)