專利名稱：檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miRNA-128的專用引物、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miRNA-128的專用引物、試劑盒，以及檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miRNA-128表達(dá)量的方法，屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，隨著人民生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)。結(jié)直腸癌在早期階段相對(duì)容易治愈，而到晚期階段往往預(yù)后較差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，無侵襲轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸患者的5年生存率可高達(dá)90%，有局部轉(zhuǎn)移者的5年生存率有68%，而帶有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的5年生存率則僅有11%。因此早期發(fā)現(xiàn)是改善結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)鍵。CT和MRI等對(duì)于小于Icm的病灶無法早期診斷，不能用于結(jié)直腸癌的早期篩查和診斷。電子腸鏡檢查雖可早期診斷結(jié)直腸癌，但卻是有創(chuàng)檢查，一定程度上增加了病人的痛苦。腫瘤標(biāo)志物以其簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、非侵入性等特點(diǎn)日益受到關(guān)注。但是，目前臨床上推薦用于結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物只有CEA，而CEA作為腫瘤標(biāo)志物其特異性以及在結(jié)直腸癌診斷方面的應(yīng)用也備受質(zhì)疑。因此目前的結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求，尋找理想的用于早期診斷結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物具有重要的臨床意義。miRNAs是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質(zhì)的單鏈小分子RNAs,其通過對(duì)mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、凋亡、代謝等功能。近年來，腫瘤相關(guān)miRNAs陸續(xù)在腫瘤患者的血清中被發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的無創(chuàng)性早期診斷提供了一條新的途徑。作為潛在的生物標(biāo)志物，miRNAs具有蛋白標(biāo)志物無法比擬的優(yōu)勢(shì)。miRNAs穩(wěn)定性非常好，有研究顯示體液樣本中的miRNAs的穩(wěn)定性源于其在血液中以核酸-蛋白復(fù)合物形式存在或包被于外排顆粒當(dāng)中，使miRNAs耐受包括核糖核酸酶、反復(fù)凍融、PH變化、長(zhǎng)期保存等情況，不易被降解。miR-128最早作為一種抑癌基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中被發(fā)現(xiàn)，其有12 8-1和128-2兩種前體形式，基因分別定位在第2和3染色體。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，miR-128通過靶向癌基因Bm1-1和ABCC5導(dǎo)致對(duì)化療的耐受，并且miR-128在乳腺癌組織中的表達(dá)與患者的預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-128的上調(diào)表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡、遷移和血管生成等，與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，提示對(duì)miR-128的表達(dá)檢測(cè)可以成為腫瘤檢測(cè)的指標(biāo)之一。血清miRNAs主要的檢測(cè)方法有克隆測(cè)序、RNA印跡雜交、基因芯片、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，其中基于SYBR Green的逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是分析血清中miRNAs最常用的方法，其具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、重復(fù)性好，目前已在核苷酸檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。采用該方法通常情況下需先對(duì)血清樣本中的miRNAs進(jìn)行分離提取，然后再對(duì)分離得到的miRNAs進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增檢測(cè)，但目前關(guān)于miRNAs的提取步驟繁瑣、試劑昂貴，并且在提取過程中不可避免的造成miRNAs分子的丟失，給實(shí)驗(yàn)造成了誤差。因此，如果建立一種對(duì)血清中miRNAs直接進(jìn)行檢測(cè)的方法，無疑會(huì)給研究帶來方便。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miRNA-128的專用引物、試劑盒，以及檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miRNA-128表達(dá)量的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用引物，包括:(I) miR-128的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID NO:1所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miR-128-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG-3’ ；miR-128-F:5， -GGCTCACAGTGAACCGGT-3，；miR-128-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3J ；(2)U6的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID NO:4所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:U6-RT:5’ -GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3’ ；U6-F:5’ -GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3’ ；U6-R:5， -AAATATGGAACGCTTCACGAATT-3，；

(3)miRNA-16的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID N0:7所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5，-CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3，；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。所述引物的序列是根據(jù)microRNA數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.0rg/)上報(bào)的核苷酸序列 miR-128 (MIMAT0000424),miRNA-16 (MIMAT0000069)以及 GeneBank 數(shù)據(jù)庫中的U6序列(X07425.1)為模板自主設(shè)計(jì)的。一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用試劑盒，包括上述引物，以及RNA分離液；所述RNA分離液由吐溫20、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水組成，其中，濃度如下:吐溫20:2.5% (體積百分?jǐn)?shù))；三羥甲基氨基甲烷:50mmol/L ;乙二胺四乙酸:lmmol/L ;牛血清白蛋白:1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))。所述檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用試劑盒還包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液由IXSyber Green I熒光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成，優(yōu)選的，各物質(zhì)的濃度如下:DNA聚合酶:100U/ml，dNTPs:0.2mM ;氯化鎂:6mM ；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽:16.5mM ;氯化鉀:89.3mM。上述檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用引物、檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用試劑盒在定性檢測(cè)血清miR-128或定量檢測(cè)血清miR-128表達(dá)量中的應(yīng)用。一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128表達(dá)量的方法，步驟如下:(I)將待檢測(cè)的血清標(biāo)本與等體積RNA分離液混合，16000g離心10分鐘，分離上
清液；(2) RT-PCR擴(kuò)增:向上述分離的上清液中加入SEQ ID NO:1所示的miR-128的逆轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，取cDNA為模板，加入SEQ ID NO:2、3所示的引物以及PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)樣本閾值Cq (test sample);同時(shí)，從人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞(購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)中提取miRNAs，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 10倍梯度稀釋，作為校對(duì)樣本，在每個(gè)PCR反應(yīng)板中進(jìn)行檢測(cè)，記錄Cq值；內(nèi)參基因U6、miR-16的RT-PCR擴(kuò)增，除引物采用相對(duì)應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物外，方法相同；(3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:上述檢測(cè)完成后，拷貝數(shù)以10為底取對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Cq值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算斜率S，然后根據(jù)公式E=IO (_vs)-l，計(jì)算擴(kuò)增效率E ;(4)計(jì)算:選中樣本和校對(duì)樣本檢測(cè)孔，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件得出樣本閾值Cq (T)和校對(duì)樣本閾值Cq (C)，根據(jù)公式Q= (E+1) _△ A Cq= [Cq (T)-Cq(C)]，得出基因的校正起始拷貝數(shù)Q ;將miR-128的Q值與內(nèi)參基因U6、miR_16的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到miR-128的相對(duì)表達(dá)量。本發(fā)明所建立的結(jié)直腸癌血清miR-128檢測(cè)方法，為結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了重要的參考依據(jù)。本發(fā)明利用RNA分離液對(duì)血清樣本進(jìn)行處理，得到的混合液直接用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，省略了對(duì)需求樣本RNA的提取過程，不僅簡(jiǎn)化了操作步驟，降低了檢測(cè)成本，還避免了傳統(tǒng)方法提取RNA降解的問題。本發(fā)明根據(jù)公式E=10(_1/S)_l，計(jì)算擴(kuò)增效率(E)，根據(jù)公式Q= (E+l)_AQl計(jì)算miR-128基因相對(duì)miR-191、miR-16的表達(dá)量，避免了傳統(tǒng)2_AAe<1法必須要求PCR擴(kuò)增效率為100%的限制，使結(jié)果分析更加可靠。


圖1為U6、miR-1 6和miR-128的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，A:U6的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B:miR-16的標(biāo)準(zhǔn)曲線；C:miR-128的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為血清miR-128在38例結(jié)直腸癌患者和20例健康對(duì)照者中的相對(duì)表達(dá)水平。圖3為血漿血清miR-128檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌診斷的ROC曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1( I)試劑盒的組成及配制:所述引物的序列是根據(jù)microRNA數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.0rg/)上報(bào)的核苷酸序列 miR-128 (MIMAT0000424),miRNA-16 (MIMAT0000069)以及 GeneBank 數(shù)據(jù)庫中的U6序列(X07425.1)為模板自主設(shè)計(jì)的，其引物序列、Tm值見表I。表I引物序列、Tm值
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用引物，其特征在于:包括: (1)miR-128的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQID NO:1所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miR-128-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG-3’ ；miR-128-F:5，-GGCTCACAGTGAACCGGT-3，；miR-128-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (2)U6的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQID NO:4所示，檢測(cè)引物的序列如 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 所示:U6-RT:GTGCTCGCTT CGGCAGCACATATAC ；U6-F:GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC ；U6-R:AAATATGGAACGCTTCACGAATT ； (3)miRNA-16的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQID NO:7所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
2.一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用試劑盒，其特征在于:包括權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用引物，以及RNA分離液；所述RNA分離液由吐溫20、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水組成，其中，濃度如下:吐溫20:2.5%；三輕甲基氨基甲燒:50mmol/L ;乙二胺四乙酸:lmmol/L ;牛血清白蛋白:1%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用試劑盒，其特征在于:所述檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用試劑盒還包括PCR反應(yīng)液,PCR反應(yīng)液由Syber GreenI熒光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用試劑盒，其特征在于:所述反應(yīng)液中各物質(zhì)的濃度如下:DNA聚合酶:100U/ml，dNTPs:0.2mM ;氯化鎂:6mM ;三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽:16.5mM ;氯化鉀:89.3mM。
5.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用引物在定性檢測(cè)血清miR-128或定量檢測(cè)血清miR-128表達(dá)量中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2或3或4所述的檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用試劑盒在定性檢測(cè)血清miR-128或定量檢測(cè)血清miR-128表達(dá)量中的應(yīng)用。
7.一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128表達(dá)量的方法，其特征在于:步驟如下: (1)將待檢測(cè)的血清標(biāo)本與等體積RNA分離液混合，離心，分離上清液； (2)RT-PCR擴(kuò)增:向上述分離的上清液中加入SEQ ID NO:1所示的miR-128的逆轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，取cDNA為模板，加入SEQ ID NO:2、3所示的引物以及PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)樣本閾值Cq ;同時(shí)，從人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞中提取miRNAs，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，10倍梯度稀釋，作為校對(duì)樣本，在每個(gè)PCR反應(yīng)板中進(jìn)行檢測(cè)，記錄Cq值；內(nèi)參基因U6、miR-16的RT-PCR擴(kuò)增，除引物采用相對(duì)應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物外，方法相同； (3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:上述檢測(cè)完成后，拷貝數(shù)以10為底取對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Cq值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算斜率S，然后根據(jù)公式E=IO (_vs)-l，計(jì)算擴(kuò)增效率E ; (4)計(jì)算:選中樣本和校對(duì)樣本檢測(cè)孔，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件得出樣本閾值Cq (T)和校對(duì)樣本閾值Cq (C)，根據(jù)公式Q= (E+1)_Ag% A Cq=[Cq (T)-Cq (C)]，得出基因的校正起始拷貝數(shù)Q ;將miR-128的Q值與內(nèi)參基因U6、miR-16的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到miR-1 28的相對(duì)表達(dá)量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用引物，包括miR-128的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物、U6的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物、miRNA-16的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，如SEQ IDNO1～9所示。一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128的專用試劑盒，包括上述引物，以及RNA分離液。一種檢測(cè)結(jié)直腸癌血清miR-128表達(dá)量的方法，步驟如下(1)將待檢測(cè)的血清標(biāo)本與等體積RNA分離液混合，16000g離心10分鐘，分離上清液；(2)RT-PCR擴(kuò)增；(3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(4)計(jì)算得出基因的校正起始拷貝數(shù)Q；將miR-128的Q值與內(nèi)參基因U6、miR-16的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到miR-128的相對(duì)表達(dá)量。本發(fā)明的檢測(cè)方法，為結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了重要的參考依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103074431SQ20131001219
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者王傳新, 張欣, 王海燕 申請(qǐng)人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院