用于hcv抑制劑抗性亞群表型檢測(cè)的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于有效和準(zhǔn)確測(cè)定丙型肝炎病毒(HCV)群對(duì)HCV抑制劑的易感性的方法和組合物。在某些方面,所述方法涉及向細(xì)胞導(dǎo)入患者來(lái)源的片段,其中所述細(xì)胞或患者來(lái)源的片段包含產(chǎn)生依賴于HCV的可檢測(cè)信號(hào)的指示物核酸;在改變濃度的HCV抑制劑存在下測(cè)量指示物基因的表達(dá);測(cè)定易感性的標(biāo)準(zhǔn)曲線;比較所述HCV群與對(duì)照HCV群的IC95倍數(shù)改變、斜率或最大抑制百分率。
【專利說(shuō)明】用于HCV抑制劑抗性亞群表型檢測(cè)的方法
[0001]本申請(qǐng)要求2011年12月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/566,595的優(yōu)先權(quán)。該申請(qǐng)的整個(gè)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0002]本發(fā)明的實(shí)施方式涉及測(cè)定丙型肝炎病毒(“HCV”)或HCV群對(duì)HCV抑制劑的易感性的方法。還提供了測(cè)定HCV或HCV群的復(fù)制能力的方法。
【【背景技術(shù)】】
[0003]HCV影響估計(jì)世界上1.7億人,包括4百萬(wàn)美國(guó)人,或約I %的美國(guó)人口,因而其為最常見(jiàn)的血液攜帶疾病。HCV感染在大致55~85%的患者中成為慢性病癥。慢性HCV感染的晚期并發(fā)癥包括肝硬化,肝細(xì)胞癌,及死亡。對(duì)于預(yù)防HCV感染沒(méi)有有效疫苗。
[0004]HCV是含有大致9,000個(gè)核苷酸(9kb)的正義線性單鏈RNA基因組的有包膜病毒。HCV與黃病毒及瘟病毒一起分類(lèi)進(jìn)黃病毒科(Flaviviridae)。HCV基因組的單開(kāi)放閱讀框被翻譯而產(chǎn)生單蛋白產(chǎn)物,然后其被進(jìn)一步加工產(chǎn)生更小的活性蛋白,包括3種結(jié)構(gòu)蛋白(核衣殼(C)和2種包膜糖蛋白(El和E2))和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(包括絲氨酸蛋白酶(非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)),輔因子(非結(jié)構(gòu)蛋白4A(NS4A)),非結(jié)構(gòu)蛋白5A (NS5A),及RNA依賴性RNA聚合酶(非結(jié)構(gòu)蛋白5B(NS5B)等)。
[0005]HCV株基于種系發(fā)生(遺傳序列)由“基因型”分組成6個(gè)基因型(即I~6)之一,其在基因型內(nèi)被進(jìn)一步表征為幾種不同亞型(例如la,lb,lc)。用一種HCV基因型感染不必然給患者提供針 對(duì)該基因型或任何其他基因型的HCV的免疫力,由此,用多于一種HCV基因型分離物同時(shí)感染是可能的。大部分HCV基因型是地理學(xué)上不同的。在北美洲,歐洲和日本,HCV基因型I是最普遍的。在基因型IHCV之內(nèi),亞型Ia和Ib更普遍,亞型Ic僅是少數(shù)成分。
[0006]護(hù)理HCV感染的當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)依賴于通過(guò)響應(yīng)于用聚乙二醇化干擾素a (PEG-1FN)組合利巴韋林(RBV)進(jìn)行24~48周治療的免疫調(diào)節(jié)的病毒復(fù)制的間接阻遏。對(duì)治療的響應(yīng)在患者之中有變化,大致40~60%的患者達(dá)到病毒復(fù)制的持續(xù)阻遏(持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答,SVR)。并非所有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PEG-1FN/RBV治療具有初始應(yīng)答的HCV-感染患者維持他們的應(yīng)答,如通過(guò)血漿中可檢測(cè)的HCV RNA的上升水平證明的。由于PEG-1FN/RBV治療的功效可變性和低耐受性,在臨床前發(fā)展程序和臨床試驗(yàn)中正在評(píng)價(jià)直接靶向HCV復(fù)制的大量新抗病毒藥劑(例如,波普瑞韋,替拉瑞韋)。靶向分別由HCV基因組的NS3,NS5A和NS5B區(qū)編碼的病毒蛋白酶、非結(jié)構(gòu)蛋白5Α或RNA-依賴性RNA聚合酶(RdRp)的抑制劑正在進(jìn)行深入開(kāi)發(fā)。
[0007]HCV的NS5B區(qū)是1,773個(gè)核苷酸長(zhǎng),編碼HCV RdRp酶。HCV RdRp酶“拷貝TCV RNA基因組并產(chǎn)生正義和負(fù)義HCV RNA,因此RdRp對(duì)于病毒復(fù)制是必要的。目前正開(kāi)發(fā)許多核苷抑制劑(NI)和小分子非核苷抑制劑(NNI)。NI通過(guò)與用于在活性位點(diǎn)結(jié)合的RdRp的天然底物(三磷酸核糖核苷)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)發(fā)揮作用。NNI別構(gòu)性地結(jié)合并由非-競(jìng)爭(zhēng)性機(jī)理抑制RdRp活性。NNI可還被分組為基于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和靶結(jié)合位點(diǎn)相區(qū)別的幾個(gè)亞類(lèi)。對(duì)特定RdRp抑制劑的抗性已被報(bào)道與位于該酶內(nèi)、通過(guò)改變RdRp結(jié)構(gòu)(例如,NNI)或通過(guò)改善RdRp區(qū)別抑制劑和天然底物的能力(例如,NI)來(lái)限制抑制劑結(jié)合的某些氨基酸突變有關(guān)。
[0008]盡管幾種目前可利用的抑制劑已顯示在抑制病毒復(fù)制方面是有效的,它們因具有快速突變速度(導(dǎo)致該藥物施用給感染的個(gè)體后快速出現(xiàn)對(duì)抗病毒藥劑治療劑的易感性降低的突變HCV)而易受病毒抗性發(fā)展的影響。這種對(duì)特定藥物的易感性降低致使用該藥物治療對(duì)于所述被感染個(gè)體無(wú)效。由于此原因,醫(yī)師能監(jiān)測(cè)藥物易感性以便為各HCV感染個(gè)體確定最適當(dāng)?shù)闹委煼桨甘侵匾摹?br>
[0009]因此,對(duì)于可以用于有效且準(zhǔn)確地測(cè)定對(duì)靶向HCV多肽的藥物的易感性的方法和組合物有需求。期望的方法和組合物會(huì)有助于評(píng)估(a)HCV抑制劑易感性的天然變化和/或(b)會(huì)表示HCV抑制劑抗性群的出現(xiàn)和存留或衰變的預(yù)處理、處理中和處理后抑制劑易感性的差異。也需要可用于評(píng)價(jià)HCV群的相對(duì)復(fù)制能力(RC)的方法。由本發(fā)明滿足這些和其他需求。
[0010]【發(fā)明概述】
[0011]本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜谟行覝?zhǔn)確確定混合的丙型肝炎病毒(HCV)群對(duì)HCV抑制劑的易感性的方法和組合物。
[0012]提供了用于測(cè)定丙 型肝炎病毒(HCV)群對(duì)HCV抑制劑的易感性的方法,包括下列步驟:向細(xì)胞導(dǎo)入包含來(lái)自HCV病毒群的患者來(lái)源片段的抗性測(cè)試載體,其中所述細(xì)胞或抗性測(cè)試載體包括產(chǎn)生依賴于HCV的可檢測(cè)信號(hào)的指示物核酸;在增加濃度的HCV抑制劑不存在或存在下測(cè)量細(xì)胞中指示物基因的表達(dá);對(duì)所述HCV抑制劑求出藥物易感性的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中在標(biāo)準(zhǔn)曲線中檢測(cè)IC95倍數(shù)改變值;比較HCV群的IC95倍數(shù)改變值與對(duì)照HCV群的IC95倍數(shù)改變值;及當(dāng)HCV群的IC95倍數(shù)改變相比對(duì)照HCV群的IC95倍數(shù)改變更大時(shí),確定HCV群包含對(duì)HCV抑制劑具有減小的易感性的HCV顆粒。在一些實(shí)施方式中,所述HCV群包含亞群,并且所公開(kāi)的方法檢測(cè)HCV群的小物種亞群中的減小的易感性。在某些特定實(shí)施方式中,所述方法檢測(cè)占HCV群約20%~約60%的亞群中減小的易感性。在某些方面,HCV抑制劑靶向HCV聚合酶。HCV抑制劑可為例如核苷抑制劑(NI)或非核苷抑制劑(NNI)。在一些實(shí)施方式中,HCV是靶向聚合酶的位點(diǎn)A、B、C或D的非核苷抑制劑(NN1-A,NN1-B,NN1-C或NN1-D)。在某些方面,HCV抑制劑靶向NS5A。在一些實(shí)施方式中,HCV群和對(duì)照HCV群包含HCV基因型I。在某些實(shí)施方式中,HCV群和對(duì)照HCV群可包含HCV基因型Ia或lb。在某些特定的實(shí)施方式中,對(duì)照HCV群包含ConlHCV或H77HCV。在某些其它某些實(shí)施方式中,對(duì)照HCV群是在用HCV抑制劑治療之前來(lái)自患者的HCV群。在某些實(shí)施方式中,抗性測(cè)試載體包含患者來(lái)源的片段和指示物核酸。在一些實(shí)施方式中,患者來(lái)源的片段包含HCV的NS5B區(qū)。在某些實(shí)施方式中,指示物基因包含螢光素酶基因。在這些方法的某些實(shí)施方式中,宿主細(xì)胞是Huh7細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中,所述方法用于輔助為患者確定適合的治療方案。在某些實(shí)施方式中,該方法還包含測(cè)定IC5tl倍數(shù)改變值,及測(cè)定所檢測(cè)的ICm倍數(shù)改變值與IC5tl倍數(shù)改變值的比,其中比的變化指示HCV對(duì)抑制劑的易感性的變化。
[0013]也提供了測(cè)定丙型肝炎病毒(HCV)群對(duì)HCV抑制劑的易感性的方法,包含下列步驟:向細(xì)胞導(dǎo)入包含來(lái)自HCV病毒群的患者來(lái)源片段的抗性測(cè)試載體,其中所述細(xì)胞或抗性測(cè)試載體包含產(chǎn)生依賴于HCV的可檢測(cè)信號(hào)的指示物核酸;在缺乏或存在增加濃度的HCV抑制劑的情況下測(cè)量細(xì)胞中指示物基因的表達(dá);測(cè)定HCV群對(duì)HCV抑制劑的藥物易感性的標(biāo)準(zhǔn)曲線;比較HCV群的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與對(duì)照HCV群的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;以及當(dāng)HCV群的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率相比對(duì)照群的標(biāo)準(zhǔn)曲線降低時(shí),確定HCV群包含對(duì)所述HCV抑制劑具有減小的易感性的HCV顆粒。在一些實(shí)施方式中,所述HCV群包含亞群,并且所述公開(kāi)的方法檢測(cè)HCV群的小部分種類(lèi)亞群中的減小的易感性。在某些實(shí)施方式中,所述方法檢測(cè)是HCV群的約20%~約60%的亞群中的減小的易感性。在某些方面,HCV抑制劑靶向HCV聚合酶。HCV抑制劑可為例如核苷抑制劑(NI)或非核苷抑制劑(NNI)。在一些實(shí)施方式中,HCV是靶向HCV聚合酶的位點(diǎn)A、B、C或D的非核苷抑制劑(NN1-A,NN1-B, NN1-C或NN1-D)。在某些方面,HCV抑制劑靶向NS5A。在一些實(shí)施方式中,HCV群和對(duì)照HCV群包含HCV基因型I。在某些實(shí)施方式中,HCV群和對(duì)照HCV群可包含HCV基因型Ia或lb。在某些特定實(shí)施方式中,對(duì)照HCV群包含ConlHCV或H77HCV。在某些其他特定實(shí)施方式中,對(duì)照HCV群是在用HCV抑制劑治療之前來(lái)自患者的HCV群。在某些實(shí)施方式中,抗性測(cè)試載體包含患者來(lái)源片段和指示物基因。在一些實(shí)施方式中,患者來(lái)源片段包含HCV的NS5B區(qū)。在某些實(shí)施方式中,指示物基因包含螢光素酶基因。在這些方法的某些實(shí)施方式中,宿主細(xì)胞是Huh7細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中,所述方法被用于輔助為患者確定適合的治療方案。
[0014]也提供了測(cè)定丙型肝炎病毒(HCV)群對(duì)HCV抑制劑的易感性的方法,包括下列步驟:向細(xì)胞導(dǎo)入包含來(lái)自HCV病毒群的患者來(lái)源片段的抗性測(cè)試載體,其中所述細(xì)胞或抗性測(cè)試載體包含產(chǎn)生依賴于HCV的可檢測(cè)信號(hào)的指示物核酸;在缺乏或存在增加濃度的HCV抑制劑的情況下測(cè)量細(xì)胞中指示物基因的表達(dá);測(cè)定HCV群對(duì)HCV抑制劑的藥物易感性的標(biāo)準(zhǔn)曲線;比較HCV群的最大百分率抑制與對(duì)照HCV群的最大百分率抑制;及當(dāng)HCV群的最大百分率抑制相比對(duì)照群的最大百分率抑制降低時(shí),確定該HCV群包含對(duì)所述HCV抑制劑具有減小的易感性的HCV顆粒。在一些實(shí)施方式中,HCV群包含亞群,并且所公開(kāi)的方法檢測(cè)HCV群的小部分種類(lèi)亞群中的減小的易感性。在某些實(shí)施方式中,所述方法檢測(cè)占HCV群約20%~約60%的亞群中的減小的易感性。在某些方面,HCV抑制劑靶向HCV聚合酶。HCV抑制劑可為例如核苷抑制劑(NI)或非核苷抑制劑(NNI)。在一些實(shí)施方式中,HCV是靶向HCV聚合酶的位點(diǎn)A、B、C或D的非核苷抑制劑(NN1-A,NN1-B,NN1-C或NN1-D)。在某些方面,HCV抑制劑靶向NS5A。在一些實(shí)施方式中,HCV群和對(duì)照HCV群包含HCV基因型
I。在某些實(shí)施方式中,HCV群和對(duì)照HCV群可包含HCV基因型Ia或lb。在某些特定實(shí)施方式中,對(duì)照HCV群包含ConlHCV或H77HCV。在某些其他某些實(shí)施方式中,對(duì)照HCV群是在用HCV抑制劑治療之前來(lái)自患者的HCV群。在某些實(shí)施方式中,抗性測(cè)試載體包含患者來(lái)源片段和指示物基因。在一些實(shí)施方式中,患者來(lái)源的片段包含HCV的NS5B區(qū)。在某些實(shí)施方式中,指示物基因包含螢光素酶基因。在這些方法的某些實(shí)施方式中,宿主細(xì)胞是Huh7細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中,所述方法用于輔助為患者確定適合的治療方案。
【【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】】
[0015]本發(fā)明方法的非限制性實(shí)施方式例示于以下圖。
[0016]圖1是測(cè)定HCV抑制劑易感性的表型測(cè)定的示意性模式圖。此圖使用HCV抑制劑靶向HCV聚合酶NS5B作為實(shí)例。因此,在此例中,測(cè)試群的NS5B區(qū)包括在復(fù)制子測(cè)試載體中。[0017]圖2是顯示代表性的HCV抑制劑易感性曲線的圖,在X-軸上標(biāo)繪HCV抑制劑濃度,在y-軸上標(biāo)繪作為百分率抑制的易感性的倍數(shù)改變。指示了 IC5tl和IC95。斜率可由基于對(duì)數(shù)S形函數(shù)的曲線擬合計(jì)算。例如,抑制等于上部_(上部+下部)除以(1+濃度/中心斜率)。簡(jiǎn)言之,斜率等于 log (95/100-95)/Λ X。Λ χ 等于 log (IC95)-1o (IC5tl)。
[0018]圖3是比較HCV基因型Ib對(duì)照(Conl)和HCV基因型Ia對(duì)照(H77)與突變HCV相比的IC5tl倍數(shù)改變的表,其中所述突變HCV在NS5B中具有已知與對(duì)HCV抑制劑的易感性變化相關(guān)的特定氨基酸取代。
[0019]圖4A~4F是顯不代表性的精確度數(shù)據(jù)(圖4A(對(duì)于一種樣品和不同抑制劑的IC50倍數(shù)改變)和4B (3個(gè)樣品的復(fù)制能力)),重復(fù)性數(shù)據(jù)(圖4C (2個(gè)測(cè)定中的NN1-A IC50倍數(shù)改變)和4D (2個(gè)測(cè)定中的復(fù)制能力)),及線性數(shù)據(jù)(圖4E (4種抑制劑的IC5tl倍數(shù)改變)和4F(6個(gè)樣品的復(fù)制能力))的圖。
[0020]圖5是顯示通過(guò)使用HCV基因型Ib對(duì)照(Conl)和HCV基因型Ia對(duì)照(H77)以及突變HCV產(chǎn)生的表型數(shù)據(jù)結(jié)果的表,其中所述突變HCV在NS5B中具有已知與對(duì)抑制劑的易感性變化相關(guān)的特定氨基酸取代。百分率突變體檢測(cè)列指示在何處ICFC值大于或等于2,分析含有20,40,60,80或100%突變體的樣品。該表顯示,當(dāng)相比IC5tl倍數(shù)改變測(cè)量IC95倍數(shù)改變時(shí),小部分種類(lèi)的靈敏度增加。
[0021]圖6A~6W是顯示包含抑制劑抗性HCV的群的檢測(cè)靈敏度的圖,觀察標(biāo)準(zhǔn)化的斜率(圖 6A,6H, 6L, 6P 或 6T),IC50 (圖 6B,6E,61,6M,6Q 或 6U),或 IC95 (圖 6C, 6F, 6J, 6N, 6R或6V)(全部在χ-軸上標(biāo)繪為群中抑制劑(NN1-A,NN1-B或NN1-C)抗性病毒的百分率,對(duì)比在1-軸上標(biāo)繪為標(biāo)準(zhǔn)化的斜率或IC倍數(shù)改變),以及在y-軸上標(biāo)繪混合群(圖6D,6G,6K,60,6S和6W)的復(fù) 制能力,相對(duì)于在χ-軸上標(biāo)繪群中抗性病毒的百分率。
[0022]圖7A~7D是通過(guò)使用更高倍數(shù)改變值顯示群中少數(shù)變體的改善檢測(cè)的圖。圖7A和7C是y-軸上是抑制性濃度(IC)倍數(shù)改變對(duì)比χ-軸上是少數(shù)變體群的百分率的圖。在這些實(shí)驗(yàn)中的少數(shù)變體是在聚合酶的第495位具有脯氨酸至丙氨酸取代(P495A)的HCV (圖7A)和在聚合酶的第392位具有亮氨酸至異亮氨酸取代(L392I)的HCV (圖7B)。測(cè)量少數(shù)變體群的各百分率下的IC5tl, IC80, IC90和IC95倍數(shù)改變,并分別用帶有圓形,方形,三角形和菱形的線顯示。圖7A和7C反映應(yīng)答靶向HCV聚合酶的位點(diǎn)A的非核苷抑制劑(NN1-A)產(chǎn)生的數(shù)據(jù),圖7B和7D反映應(yīng)答作為對(duì)照抑制劑的干擾素產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)展示,IC95倍數(shù)改變的測(cè)量最有能力檢測(cè)HCV群中增加對(duì)HCV抑制劑具有減小的易感性的少數(shù)變體。
[0023]圖8A~8X是展示在混合的HCV群中增加減小的易感性變體后易感性曲線的斜率減小的圖。圖8A~8F和8M~8R反映了在向2個(gè)不同HCV群(分別為P495A和L392I)中響應(yīng)于靶向HCV聚合酶位點(diǎn)A的非核苷抑制劑(NN1-A)產(chǎn)生的數(shù)據(jù),和圖8G~8L和8S~8X反映了在向2個(gè)不同HCV群(分別為P495A和L392I)中響應(yīng)于作為對(duì)照抑制劑的干擾素產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。各圖在χ-軸上標(biāo)繪抑制劑的濃度,在y_軸上標(biāo)繪百分率抑制。HCV群中易感性減小的HCV變體的濃度是O % (圖8A,8G,8M,8S),20% (圖8B,8H,8N,8T),40 % (圖8C,8I,80,8U) ,60% (圖 8D,8J,8P,8V),80 % (圖 8E,8K,8Q,8W)或 100 % (圖 8F,8L,8R,8X)。圖8A~8F中,當(dāng)HCV變體以小于80%濃度存在時(shí),易感性曲線的斜率隨著易感性減小的HCV變體的濃度增加而減小。
[0024]圖9顯示NS5A核苷酸序列的系統(tǒng)樹(shù),顯示野生型NS5A序列(空心形狀)和具有來(lái)自HCV基因型Ia (圓形)和基因型Ib (方形)的至少一個(gè)抗性相關(guān)突變(RAM)(實(shí)心形狀)的序列。
[0025]圖10中的表顯示在8個(gè)不同HCV樣品中NS5A內(nèi)的突變。在表頂部顯示NS5A中的野生型氨基酸殘基和其位置數(shù),表內(nèi)顯示存在于各樣品的氨基酸殘基。
[0026]圖1lA~IlJ中的圖顯示了關(guān)于干擾素(各小圖中的左圖),第一 NS5A抑制劑(各小圖中的中圖),及第二 NS5A抑制劑(各小圖中的右圖)而言圖10中顯示的幾種HCV樣品的易感性曲線。圖1IA~IlJ顯不樣品23,克隆1(小圖A);樣品23,克隆2(小圖B);樣品23,克隆3 (小圖C);樣品50,克隆I (小圖D);樣品50,克隆2 (小圖E);樣品78,克隆1(小圖F);樣品78,克隆2 (小圖G);樣品109,克隆I (小圖H);樣品109,克隆2 (小圖1);及Conl野生型對(duì)照(小圖J,顯示對(duì)各抑制劑的易感性)的結(jié)果。各克隆的基因型和該樣品總數(shù)中具有該基因型的克隆數(shù)顯示在各小圖上部。
[0027]【發(fā)明詳述】
[0028]本發(fā)明特別地提供了測(cè)定HCV群對(duì)抗-HCV藥物的易感性或測(cè)定感染患者的HCV的復(fù)制能力的方法。下文進(jìn)一步描述所述方法,及實(shí)施所述方法中有用的組合物。
[0029]【定義和縮寫(xiě)】
[0030]以下是在本文定義的術(shù)語(yǔ),如它們用于本申請(qǐng):
[0031]“PCR”是“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的縮寫(xiě)。
[0032]“HCV”是丙型肝炎病毒的縮寫(xiě)。在某些實(shí)施方式中,HCV指稱HCV基因型I。在某些實(shí)施方式中,HCV指稱HCV基因型Ia或lb。
[0033]本文所用的20種遺傳編碼的L-氨基酸的氨基酸名稱是常規(guī)的,示意如下:
[0034]表1
[0035]
【權(quán)利要求】
1.測(cè)定丙型肝炎病毒(HCV)群對(duì)HCV抑制劑的易感性的方法,包括: (a)向細(xì)胞導(dǎo)入包含來(lái)自HCV病毒群的患者來(lái)源片段的抗性測(cè)試載體,其中所述細(xì)胞或抗性測(cè)試載體包含產(chǎn)生依賴于HCV的可檢測(cè)信號(hào)的指示物核酸; (b)在缺乏或存在增加濃度的HCV抑制劑的情況下測(cè)量細(xì)胞中指示物基因的表達(dá); (c)對(duì)HCV抑制劑作藥物易感性的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中在標(biāo)準(zhǔn)曲線中檢測(cè)IC95倍數(shù)改變值; (d)比較所述HCV群的IC95倍數(shù)改變值與對(duì)照HCV群的IC95倍數(shù)改變值;以及 (e)當(dāng)所述HCV群的IC95倍數(shù)改變與對(duì)照HCV群的IC95倍數(shù)改變相比而言更大時(shí),確定該HCV群包含對(duì)所述HCV抑制劑具有減小的易感性的HCV顆粒。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述HCV群包含亞群,且其中所述方法檢測(cè)該HCV群的小部分種類(lèi)亞群中的減小的易感性。
3.權(quán)利要求2的方法,其中所述方法檢測(cè)占所述HCV群約20%~約60%的亞群中的減小的易感性。
4.權(quán)利要求1的方法,其中所述HCV抑制劑靶向HCV聚合酶。
5.權(quán)利要求4的方法,其中所述HCV抑制劑是核苷抑制劑(NI)。
6.權(quán)利要求4的方法,其中所述HCV抑制劑是非核苷抑制劑(NNI)。
7.權(quán)利要求4的方法,其中所述HCV抑制劑靶向HCV聚合酶的位點(diǎn)A、B、C或D。
8.權(quán)利要求1的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含HCV基因型I。
9.權(quán)利要求8的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含HCV基因型la。
10.權(quán)利要求9的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含ConlHCV。
11.權(quán)利要求8的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含HCV基因型lb。
12.權(quán)利要求11的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含H77HCV。
13.權(quán)利要求1的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含用所述HCV抑制劑處理之前的患者HCV 群。
14.權(quán)利要求1的方法,其中所述抗性測(cè)試載體包含患者來(lái)源的片段和指示物基因。
15.權(quán)利要求1的方法,其中所述患者來(lái)源的片段包含HCV的NS5B區(qū)。
16.權(quán)利要求1的方法,其中所述指示物基因包含螢光素酶基因。
17.權(quán)利要求1的方法,其中所述細(xì)胞是Huh7細(xì)胞。
18.權(quán)利要求1的方法,其中還包括基于步驟(e)的易感性測(cè)定為患者確定適當(dāng)?shù)闹委煼桨浮?br>
19.測(cè)定丙型肝炎病毒(HCV)群對(duì)HCV抑制劑的易感性的方法,包括 (a)向細(xì)胞導(dǎo)入包含來(lái)自HCV病毒群的患者來(lái)源片段的抗性測(cè)試載體,其中所述細(xì)胞或抗性測(cè)試載體包含產(chǎn)生依賴于HCV的可檢測(cè)信號(hào)的指示物核酸; (b)在缺乏或存在增加濃度的所述HCV抑制劑的情況下測(cè)量所述細(xì)胞中指示物基因的表達(dá); (c)測(cè)定所述HCV群對(duì)所述HCV抑制劑的藥物易感性的標(biāo)準(zhǔn)曲線; (d)比較所述HCV群的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與對(duì)照HCV群的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;以及 (e)當(dāng)所述HCV群的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相比于對(duì)照群的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率有降低時(shí),確定所述HCV群包含對(duì)該HCV抑制劑具有減小的易感性的HCV顆粒。
20.權(quán)利要求19的方法,其中所述HCV群包含亞群,且其中所述方法檢測(cè)該HCV群的小部分種類(lèi)亞群中的減小的易感性。
21.權(quán)利要求20的方法,其中所述方法檢測(cè)占HCV群約20%~約60%的亞群中的減小的易感性。
22.權(quán)利要求19的方法,其中所述HCV抑制劑靶向HCV聚合酶。
23.權(quán)利要求22的方法,其中所述HCV抑制劑是核苷抑制劑(NI)。
24.權(quán)利要求22的方法,其中所述HCV抑制劑是非核苷抑制劑(NNI)。
25.權(quán)利要求22的方法,其中所述HCV抑制劑靶向HCV聚合酶的位點(diǎn)A、B、C或D。
26.權(quán)利要求19的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含HCV基因型I。
27.權(quán)利要求26的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含HCV基因型la。
28.權(quán)利要求27的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含ConlHCV。
29.權(quán)利要求26的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含HCV基因型lb。
30.權(quán)利要求29的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含H77HCV。
31.權(quán)利要求19 的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含用HCV抑制劑處理之前的患者HCV群。
32.權(quán)利要求19的方法,其中所述抗性測(cè)試載體包含患者來(lái)源的片段和向宿主細(xì)胞的指不物基因。
33.權(quán)利要求19的方法,其中所述患者來(lái)源的片段包含HCV的NS5B區(qū)。
34.權(quán)利要求19的方法,其中所述指示物基因包含螢光素酶基因。
35.權(quán)利要求19的方法,其中所述宿主細(xì)胞是Huh7細(xì)胞。
36.權(quán)利要求19的方法,其中還包括基于步驟(e)的易感性測(cè)定為患者確定適當(dāng)?shù)闹委煼桨浮?br>
37.測(cè)定丙型肝炎病毒(HCV)群對(duì)HCV抑制劑的易感性的方法,包括 (a)向細(xì)胞導(dǎo)入包含來(lái)自所述HCV病毒群的患者來(lái)源片段的抗性測(cè)試載體,其中所述細(xì)胞或抗性測(cè)試載體包含產(chǎn)生依賴于HCV的可檢測(cè)信號(hào)的指示物核酸; (b)在缺乏或存在增加濃度的HCV抑制劑的情況下測(cè)量細(xì)胞中指示物基因的表達(dá); (c)測(cè)定所述HCV群對(duì)所述HCV抑制劑的藥物易感性的標(biāo)準(zhǔn)曲線; (d)比較所述HCV群的最大百分率抑制與對(duì)照HCV群的最大百分率抑制;以及 (e)當(dāng)所述HCV群的最大百分率抑制相比于對(duì)照群的最大百分率抑制有降低時(shí),確定該HCV群包含對(duì)該HCV抑制劑具有減小的易感性的HCV顆粒。
38.權(quán)利要求37的方法,其中所述HCV群包含亞群,且其中所述方法檢測(cè)該HCV群的小部分種類(lèi)亞群中的減小的易感性。
39.權(quán)利要求38的方法,其中所述方法檢測(cè)占HCV群約20%~約60%的亞群中的減小的易感性。
40.權(quán)利要求37的方法,其中所述HCV抑制劑靶向HCV聚合酶。
41.權(quán)利要求40的方法,其中所述HCV抑制劑是核苷抑制劑(NI)。
42.權(quán)利要求40的方法,其中所述HCV抑制劑是非核苷抑制劑(NNI)。
43.權(quán)利要求40的方法,其中所述HCV抑制劑靶向HCV聚合酶的位點(diǎn)A、B、C或D。
44.權(quán)利要求37的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含HCV基因型I。
45.權(quán)利要求44的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含HCV基因型la。
46.權(quán)利要求45的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含ConlHCV。
47.權(quán)利要求44的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含HCV基因型lb。
48.權(quán)利要求47的方法,其中所述對(duì)照HCV群包含H77HCV。
49.權(quán)利要求37的方法,其中對(duì)照HCV群包含用該HCV抑制劑處理之前的患者HCV群。
50.權(quán)利要求37的方法,其中所述抗性測(cè)試載體包含患者來(lái)源的片段和指示物基因。
51.權(quán)利要求37的方法,其中所述患者來(lái)源的片段包含HCV的NS5B區(qū)。
52.權(quán)利要求37的方法,其中所述指示物基因包含螢光素酶基因。
53.權(quán)利要求37的方法,其中所述宿主細(xì)胞是Huh7細(xì)胞。
54.權(quán)利要求37的方法,其中還包括基于步驟(e)的易感性測(cè)定為患者確定適當(dāng)?shù)闹委煼桨浮?br>
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104039984SQ201280059023
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月2日
【發(fā)明者】J·D·李維斯, C·J·派特羅普羅斯, W·黃 申請(qǐng)人:美國(guó)控股實(shí)驗(yàn)室公司