用于甘藍枯萎病抗性篩選的pcr引物、試劑盒及其應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術(shù)領域，具體設及一種輔助鑒定甘藍枯萎病抗性的PCR專用引 物、試劑盒及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘藍（Brass i Ca 01 eracea L .)類蔬菜是十字花科（Cruc if erae )蕓臺屬 (Brassica)甘藍種中的一二年生蔬菜的統(tǒng)稱，甘藍適應性和抗逆性均較強，是世界上許多 國家的主要蔬菜作物，在中國各地也廣泛栽培。我國甘藍的主要巷口有春甘藍、夏甘藍、秋 甘藍和高寒地區(qū)的一年一季栽培方式，到21世紀初，我國甘藍種植面積已達到90萬公頃。
[0003] 甘藍枯萎病最早發(fā)現(xiàn)于美國，目前在全世界大多數(shù)夏秋甘藍栽培地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)。 在中國，甘藍枯萎病首先發(fā)現(xiàn)于2001年的北京延慶地區(qū)，現(xiàn)已擴展到甘藍產(chǎn)區(qū)的多數(shù)省份。 甘藍枯萎病的致病菌是尖抱鑲刀菌黏團轉(zhuǎn)化型。甘藍枯萎病多是在定植或者松±過程中， 從幼嫩的支根或是老根產(chǎn)生的傷口侵入植物、擴展到木質(zhì)部，然后通過莖干向上到達葉片， 病菌在侵染的組織內(nèi)部和外部產(chǎn)生抱子，直到部分或整株死亡。被甘藍枯萎病危害的病株 其癥狀表現(xiàn)為:首先，病株下部葉片變黃，除葉脈外的葉片仍然保持綠色;隨后，上部葉片逐 漸變黃，同樣是先呈網(wǎng)狀黃化后全部葉片變黃;最后全部葉片變黃萎黨、生長點和莖壞死、 整個植株萎黨并逐漸死亡，將病株的短縮莖、葉柄等切開，可發(fā)現(xiàn)維管束部分變褐。甘藍枯 萎病的發(fā)生和發(fā)展受±壤溫度、濕度等多種因素的影響，但溫度是首要因素，高溫、干燥的 ±壤環(huán)境更容易發(fā)病。
[0004] 甘藍枯萎病是一種典型的±傳病害，在連續(xù)種植蕓臺屬作物的±壤中能夠逐年積 累，使得危害逐漸加重。而在發(fā)生過枯萎病的田地中，即使不再種植蕓臺屬作物，病原菌也 能存活10年W上，因此傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)防治手段如種子處理、輪作、藥劑防治等手段對該病的防控 效果不明顯，利用抗性品種是消除運種毀滅性病害潛在威脅的最有效途徑。
[0005] 常規(guī)的抗病育種方法雖然發(fā)揮了重大作用，但也存在很多缺點。常規(guī)抗病育種主 要通過雜交和多代自交，抗病材料的選擇和田間鑒定等復雜過程進行，周期相對較長，而且 易受環(huán)境條件影響，可靠性較差。
[0006] 因此，本領域亟需開發(fā)出一種PCR引物及相關試劑盒用于輔助篩選含甘藍枯萎病 抗性基因的甘藍材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 根據(jù)本領域的上述需求，本發(fā)明提供一種用于甘藍枯萎病抗性篩選的PCR引物，其 特異性強，穩(wěn)定性好，能夠快速、有效、靈活地利用任一階段的甘藍植株篩選出含枯萎病抗 性基因的甘藍材料，用于育種。
[000引本發(fā)明請求保護的技術(shù)方案如下：
[0009]用于篩選甘藍(Brassica oleracea L.)枯萎病抗性材料的PCR引物，其核巧酸序 列為：
[0010]上游引物扣 gl 3-F: 5 - -ACCAGAGGCAGTTTTGGTTG-3 '
[00川下游引物扣gl3-R:5 --TCTTGCAACCCATGTCAAAA-3' ；
[0012] 所述PCR引物擴增的甘藍枯萎病抗性材料特征條帶大小為263bp，其核巧酸序列如 Seq ID No.3所示。
[0013] 用于篩選甘藍枯萎病抗性材料的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的PCR 引物。
[0014] 所述試劑盒，還包括用于進行PCR和/或電泳所需的試劑。
[0015] 用于篩選甘藍枯萎病抗性材料的方法，其特征在于，包括采用所述的PCR引物和/ 或所述的試劑盒進行如下步驟：
[0016] (1)采用所述PCR引物對待測甘藍材料的基因組DNA進行PCR;
[0017] (2)凝膠電泳檢測所述PCR產(chǎn)物；
[0018] (3)從所述電泳檢測結(jié)果中篩選出與所述甘藍枯萎病抗性材料特征條帶大小一致 的材料；
[0019] 所述甘藍枯萎病抗性材料特征條帶為263bp，其核巧酸序列如Seq ID No.3所示。
[0020] 所述PCR反應體系為：模板基因組DNA 0.化L/化，包含Mg2+的10XPCR buffer緩沖 液0.化L/化，dNTPs 0.2mM，Taq DNA聚合酶0.抓/化，正向引物和反向引物0.4測，其余為雙 蒸水。
[0021] 所述PCR的反應條件為：94°C預變性5min;94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸 45s，35個循環(huán)；72 °C延伸7min; 4°C保存。
[0022] 所述凝膠電泳檢測指采用8%的聚丙締酷胺凝膠，于160V恒功率電泳分離70分鐘， 最后銀染顯色。
[0023] 所述試劑盒的制備方法，其特征在于，在標有甘藍枯萎病抗性篩選用途的包裝盒 內(nèi)裝有所述的PCR引物。
[0024] 所述標有甘藍枯萎病抗性篩選用途的包裝盒內(nèi)還裝有用于進行PCR和/或電泳所 需的試劑。
[0025] 本發(fā)明根據(jù)抗病甘藍材料96-100與感病甘藍材料01-20重測序結(jié)果設計得到。首 先使用SSRHunterl.3捜索重測序序列中的簡單重復序列信息位點，然后選取信息位點核巧 酸重復基因序列為2-6個的序列為祀標序列，利用軟件Primer 6.0設計SSR引物，從中篩選 得到特異性引物。
[0026] 專業(yè)術(shù)語：
[0027] 重測序:對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，并在此基礎上對 個體或群體進行差異性分析。
[0028] 簡單重復序列信息位點：是指基因組中W少數(shù)幾個核巧酸（多數(shù)為2-4個)為單位 多次串聯(lián)重復組成的長達幾十個核巧酸的序列，又稱簡單序列重復（Simple Sequence Repeats,SSR)。
[0029] 本發(fā)明采用上述篩選到的特異性引物作為分子標記對甘藍枯萎病抗性材料進行 輔助選擇，為育種和品種抗性鑒定提供了新的途徑。分子標記可W直接WDNA的形式表現(xiàn)， 在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)和環(huán)境限制，準確性和可靠性 局。
[0030] 本發(fā)明所提供的PCR引物特異性強，穩(wěn)定性好，在53-62°C之間的任何一個退火溫 度下均不產(chǎn)生非特異擴增，能夠十分準確地檢測出待測甘藍植株中是否具有枯萎病抗性。 在一般情況下，不同品種甘藍材料的抗性需要通過接種鑒定的方法才能確定，而采用本發(fā) 明的引物Frgl3-F/化gl3-R進行甘藍枯萎病抗性的輔助篩選，在幼苗期就能夠快速篩選出 目標株系，而要觀察接種鑒定結(jié)果，需經(jīng)過繁瑣的接種鑒定過程，會受到環(huán)境條件等條件的 影響，可重復性差，結(jié)果不可靠。因此，采用本發(fā)明的PC財示記進行甘藍的育種輔助選擇，大 大縮短了育種周期、提高了育種效率。
[0031] 本發(fā)明還提供一種用于甘藍枯萎病抗性輔助篩選的方法，該方法操作簡單易行， 只需提取待測甘藍的基因組DNA，采用引物Frgl3-F/扣gl3-R進行PCR反應，通過聚丙締酷氨 凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物特征條帶的長短，即可判斷出待測植株中是否具有枯萎病抗性。
[0032] 綜上所述，利用本發(fā)明提供的PC財示記和引物進行甘藍枯萎病抗性的篩選，操作簡 單易行，特異性強，穩(wěn)定性好，能大大縮短育種周期，提高育種效率。
【附圖說明】
[0033] 圖1.引物在抗病甘藍材料中的擴增情況，其中，M:DNA ladder; 1-16:甘藍抗枯萎 病自交系材料"ZLRr、"ZLR2"、"珍資V夏邸V'96-10(y V'ZLRy V'ZLR車V'ZLR5"、"化R護、 "ZLRr、"ZLR8"、"ZLR滬、"ZLRIO"、"ZLRir、"ZLR12"、"ZLR13" ; 17-32:甘藍感枯萎病自交系 材料。金早生"、''21-3"、?；疭r、"ZLS2"、?；疭3"、"ZLSr、"01-20"、"87-534"、"ZLS5"、 "ZLS護、"ZLSr、"ZLS穿'、"ZLS滬、"化SlO"、"化Sir、"化S12"。
[0034] 圖2.引物在不同退火溫度下的擴增情況，其中A: 53 r ; B: 56 r ; C: 59 r ; D: 62 r。
【具體實施方式】
[0035] W下結(jié)合具體實施實例進一步闡述本發(fā)明，需要說明的是，實例僅用于解釋本發(fā) 明而不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明未特別說明的實驗試劑均為本領域常規(guī)試劑，或采用本 領域常規(guī)方法配制而得，可商購獲得，規(guī)格為實驗室純級即可。
[0036] 生物材料
[0037] 實施例3和實施例4中用到的甘藍材料中，?；疪T、"ZLR2"、。化R3"、"ZLR4"、 "ZLR5"、"ZLR護、"ZLRr、"ZLR滬、''ZLR9"、"ZLRIO"、"ZLR1 r、?；疪12"、?；疪13"與 "ZLSr、 "化S2"、"ZLS3"、"化S4"、"ZLS5"、"化S6"、"ZLS7"、"ZLS8"、"ZLS9"、"化S1(T、"化SIr "ZLS12"共計25個材料為本實驗室所用的高代自交系育種材料，申請人實驗室均有保存，可 自申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗證本發(fā)明。其余生物材料均為現(xiàn)有已知材料，可商 購獲得。
[003引實施例1、本發(fā)明所述PCR引物
[0039]引物開發(fā)過程:本發(fā)明所述引物是根據(jù)抗病甘藍材料96-100與感病甘藍材料Ol-20重測序結(jié)果設計得到。首先使用SSRHunterl.3捜索重測序序列中的簡單重復序列信息位 點，然后選取信息位點核巧酸重復基因序列為2-6個的序列為祀標序列，利用軟件Primer 6.0設計SSR引物。引物的主要參數(shù)是，引物長度20-26bp;退火溫度Tm值48°C-65°C ; (G+C)含 量30%-70% ;PCR擴增產(chǎn)物長度大于15化P。