用于三維組織培養(yǎng)和工程化的葡甘聚糖支架的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種中和的葡甘聚糖支架，所述葡甘聚糖支架能夠促進(jìn)細(xì)胞生長并且適用于三維組織培養(yǎng)和工程化。本發(fā)明還提供用于制備和降解所述中和的葡甘聚糖支架的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在中和的葡甘聚糖支架上培養(yǎng)細(xì)胞的方法。
【專利說明】用于三維組織培養(yǎng)和工程化的葡甘聚糖支架
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年11月29日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/564，553的優(yōu)先權(quán)，所述申請出于所有目的整體并入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]用以修復(fù)受損或病變組織(如心臟、骨骼、肝臟、角膜和皮膚)的工程生物材料是再生醫(yī)學(xué)中的活躍研究分支。正在研究的一種方法是使用與促進(jìn)細(xì)胞生長和分化的生物材料構(gòu)建體或支架結(jié)合的細(xì)胞，以在體外產(chǎn)生可以移植的功能性組織。仿真細(xì)胞外微環(huán)境的關(guān)鍵物理特征和分子特征的三維(3D)組織培養(yǎng)系統(tǒng)為組織工程提供了巨大優(yōu)勢。
[0005]生物材料可以是天然來源的，如基于蛋白質(zhì)和多糖的生物材料；或可以是合成的，例如基于聚合物、肽和陶瓷的生物材料。針對用于臨床組織工程的這些生物材料的設(shè)計(jì)和開發(fā)，需要對如免疫原性、生物降解性、生物相容性、易于修飾和通透性的特性進(jìn)行嚴(yán)格的探索。高孔隙率和足夠的孔徑對于細(xì)胞接種以及細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散尤其重要。[0006]天然生物材料(如膠原蛋白、藻酸鹽和殼聚糖)的易獲得性和生物相容性已經(jīng)使得這些天然生物材料成為3D組織培養(yǎng)的有吸引力的基底。然而，不一致的機(jī)械特性和所接種細(xì)胞的行為所帶來的挑戰(zhàn)限制了其臨床應(yīng)用。
[0007]對于骨工程，已經(jīng)證明支架的孔隙率和孔徑是關(guān)鍵因素。先前研究已表明較大孔隙(約200-300 μ m)產(chǎn)生可促進(jìn)離子/氣體交換、蛋白質(zhì)吸附以及骨磷灰石礦化的較大表面積(Karageorgiou 等，Biomaterials200526:5474-91 ；Yuan 等，Biomaterialsl99920:1799-806)。同時(shí)認(rèn)為較大的孔徑對于血管化植入物以及模擬天然骨骼的皮質(zhì)表面和松質(zhì)內(nèi)部是必需的(Karageorgiou等，Biomaterials200526:5474-91)。因此，存在對于可以接種骨細(xì)胞并且用于骨再生的、具有大孔隙的支架的需要。
[0008]葡甘聚糖是一種天然來源的多糖，所述多糖由1:1.6比率的β_1，4連接的D-葡萄糖與D-甘露糖組成,并且大約每11個(gè)殘基就帶有支鏈(Alonso-Sande等，Eur J PharmBiopharm.200972:453-62)。葡甘聚糖具有含大約5% -10%取代的乙?；闹麈?，所述乙酰基參與提供溶解性的氫鍵合和疏水相互作用。乙酰基在堿的存在下的水解降低葡甘聚糖的溶解性，并且導(dǎo)致聚集，隨后形成凝膠。由于葡甘聚糖的膠凝特性和生物降解特性以及其成形為膜、珠粒和水凝膠的延展性，其通常作為乳化劑或增稠劑用在食物中，并且正在針對生物制藥應(yīng)用進(jìn)行研究。已經(jīng)開發(fā)出用于DNA和藥物釋放的基于葡甘聚糖的珠粒、微粒和納米粒子(Liu 等，Drug Deliv.200714:397-402 ;Wang 等，Int J Pharm.2002244:117-26 ；Wen等，Int J Biol Macromol.200842:256-63)，其中沒有觀察到口服毒性、皮膚致敏、腸毒性、胚胎毒性或細(xì)胞衰老的明顯跡象(Konishi等，Jpn J Exp Med.198454:139-42)。
[0009]近期已經(jīng)對葡甘聚糖作為用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合支架和用于軟骨再生的可注射支架進(jìn)行了研究(Kondo等,J Tissue Eng Regen Med.20093:361-7)。此研究導(dǎo)致魔芋葡甘聚糖/透明質(zhì)酸水凝膠的產(chǎn)生，其中對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并允許其作為凝膠中的懸浮物凝集。然而，仍然有待于對開發(fā)葡甘聚糖作為用于組織工程化應(yīng)用的多孔支架進(jìn)行探索。
[0010]令人驚奇地是，本發(fā)明提供一種葡甘聚糖微孔基質(zhì)，其能夠促進(jìn)細(xì)胞生長，并且可用作用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程化、以及體內(nèi)組織再生(例如骨再生)的新型生物材料支架。
[0011]發(fā)明概述
[0012]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)中和堿性葡甘聚糖支架時(shí)，所得到的中和葡甘聚糖支架可用作用于三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程化的基質(zhì)。中和的葡甘聚糖支架具有適合有效的細(xì)胞生長的pH,以及可以允許氧、營養(yǎng)物質(zhì)、表達(dá)的產(chǎn)物和細(xì)胞廢物擴(kuò)散的多孔結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明的中和的葡甘聚糖支架可以進(jìn)行表面修飾以促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖。這種天然來源的生物材料支架是熱穩(wěn)定的、無毒的和可生物降解的，并且可模擬廣泛范圍的細(xì)胞類型(如成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和干細(xì)胞)的天然三維微環(huán)境。
[0013]在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使pH大于約8的堿性葡甘聚糖支架在大于或約等于大氣壓的壓力下與水溶液接觸，以形成PH為約7的中和的葡甘聚糖支架，由此制備中和的葡甘聚糖支架。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使PH大于約8的堿性葡甘聚糖支架在真空壓力下與水溶液接觸，以形成pH為約7的中和的葡甘聚糖支架，由此制備中和的葡甘聚糖支架。
[0015]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在中和的葡甘聚糖支架上培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法包括加熱本發(fā)明的中和的葡甘聚糖支架和細(xì)胞的反應(yīng)混合物，以使細(xì)胞繁殖，由此在中和的葡甘聚糖支架上培養(yǎng)細(xì)胞。
[0016]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種中和的葡甘聚糖支架，所述中和的葡甘聚糖支架通過使pH大于約8 的堿性葡甘聚糖支架與水溶液接觸，以形成pH為約7的中和的葡甘聚糖支架來制備。
[0017]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種中和的葡甘聚糖支架，所述中和的葡甘聚糖支架通過使PH大于約8的堿性葡甘聚糖支架在大于或約等于大氣壓的壓力下與水溶液接觸，以形成PH為約7的中和的葡甘聚糖支架來制備，其中堿性葡甘聚糖支架包含細(xì)胞粘附促進(jìn)劑。
[0018]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種降解本發(fā)明的中和的葡甘聚糖支架的方法，其通過使中和的葡甘聚糖支架與降解劑接觸來實(shí)現(xiàn)。
[0019]附圖簡述
[0020]圖1示出葡甘聚糖支架和人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的掃描電子顯微照片(表面拓?fù)?，其示出水升華后葡甘聚糖凝膠的表面(A)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)(B)，以及接種在葡甘聚糖支架上的 hMSC (C、D)。
[0021]圖2示出聚-L-賴氨酸(PLL)對hMSC的粘附的影響。在膠凝之前將PLL添加至葡甘聚糖混合物中。與對照相比，hMSC對所得到的支架顯示出顯著較大的附著(p〈0.05)。
[0022]圖3a和圖3b示出在葡甘聚糖支架中培養(yǎng)的hMSC的生物發(fā)光。將表達(dá)螢火蟲熒光素酶的hMSC接種到對照或PLL處理的葡甘聚糖支架上并且每周成像。經(jīng)過一段時(shí)間，在對照支架中培養(yǎng)的細(xì)胞顯示出生物發(fā)光水平的增加。然而，在葡甘聚糖支架中培養(yǎng)的hMSC局限于接種部位，并且沒有顯示出生物發(fā)光的增加。
[0023]圖4示出葡甘聚糖支架中的hMSC的組織學(xué)。在葡甘聚糖支架中培養(yǎng)的hMSC用蘇木精和曙紅染色。在細(xì)胞接種之前的葡甘聚糖支架顯示出遍布的多孔結(jié)構(gòu)[200-300 μ m](A)0接種后，細(xì)胞顯示出不同的形態(tài)并且形成為結(jié)構(gòu)(B-D) (IOx放大倍數(shù))。
[0024]圖5示出波形蛋白和細(xì)胞角蛋白的表達(dá)。在培養(yǎng)板上培養(yǎng)的所有hMSC均顯示出強(qiáng)烈的波形蛋白(B)表達(dá)而無細(xì)胞角蛋白(A)表達(dá)。接種在葡甘聚糖支架上的細(xì)胞顯示出波形蛋白表達(dá)(D，C=同種型對照)。不規(guī)則形狀的內(nèi)腔周圍的細(xì)胞顯示出強(qiáng)烈的細(xì)胞角蛋白表達(dá)，并且襯在這些內(nèi)腔上的扁平細(xì)胞表達(dá)波形蛋白和細(xì)胞角蛋白(E、F)。
[0025]圖6示出葡甘聚糖支架的酶消化。用0.5單位/ml、5.0單位/ml和50單位/ml的纖維素酶或β -甘露聚糖酶消化接種了 rhMSC的葡甘聚糖支架，并且使從支架釋放的細(xì)胞胰蛋白酶化并計(jì)數(shù)。與纖維素酶一起孵育的支架在所有濃度下均顯示出有效的細(xì)胞釋放。然而，較高的甘露聚糖酶濃度導(dǎo)致次優(yōu)的細(xì)胞計(jì)數(shù)，而0.5單位/ml顯示出與纖維素類似的結(jié)果(C)。對所釋放的細(xì)胞聚集物進(jìn)行洗滌和過夜培養(yǎng)(A)。觀察到細(xì)胞的生長暈(outgrowth) (B) ο 放大倍數(shù)=IOx,插入圖=20x。
[0026]圖7示出接種在葡甘聚糖支架上的hMSC的成骨分化。用針對人骨橋蛋白和骨唾液蛋白IUBSP II)的抗體對接種在葡甘聚糖支架上并且用或不用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的rhMSC進(jìn)行染色。誘導(dǎo)的hMSC顯示出骨橋蛋白和BSP II表達(dá)。未誘導(dǎo)的細(xì)胞開始BSP II表達(dá)。在未誘導(dǎo)的支架和誘導(dǎo)的支架中，馮庫薩(Von Kossa)染色均顯示出礦物質(zhì)沉積。放大倍數(shù)IOx。
[0027]圖8示出在葡甘聚糖支架中與⑶34+造血細(xì)胞共培養(yǎng)的hMSC的掃描電子顯微照片。hMSC接種在葡甘聚糖支架上并且與⑶34+造血細(xì)胞共培養(yǎng)。SEM圖像顯示出⑶34+細(xì)胞對hMSC的粘附(A-D) 。hMSC顯示出給孔隙“搭橋”的能力⑶。
[0028]圖9示出制作前后的葡甘聚糖支架。此圖像可以是實(shí)施例1的一部分。使用刀或活檢穿孔器將葡甘聚糖支架制作成脊椎形(右上)和各種形狀以適合裝入細(xì)胞培養(yǎng)容器。這張圖提供了概念證明實(shí)例，其示出本發(fā)明的支架可以制作成類似于不同器官系統(tǒng)的各種形狀。
[0029]圖10示出使用中和的葡甘聚糖支架和人干細(xì)胞產(chǎn)生的三維骨構(gòu)建體的總體圖像。
[0030]發(fā)明詳述
[0031]1.定義
[0032]如本文所使用，術(shù)語“葡甘聚糖”指的是天然來源的寡糖及其衍生物，所述寡糖由大約1:1.6比率的β -1, 4連接的D-葡萄糖與D-甘露糖組成，并且大約每11個(gè)殘基就帶有支鏈(Alonso-Sande 等，Eur J Pharm Biopharm.200972:453-462)。葡甘聚糖具有含大約5% -10%取代的乙?；闹麈?，所述乙?；鶇⑴c提供溶解性的氫鍵合和疏水相互作用。示例性葡甘聚糖衍生物包括但不限于:水溶性衍生物(如O-烷基衍生物和O-羧基烷基衍生物)、具有不同取代程度的衍生物(例如，大于或小于5% -10%取代的乙酰基)、具有不同氧化程度的衍生物、接枝共聚物(例如，丙烯酸酯和丙烯酰胺共聚物)及以上的鹽(例如，以上的季銨鹽)。
[0033]如本文所使用，術(shù)語“葡甘聚糖凝膠”指的是交聯(lián)葡甘聚糖的熱穩(wěn)定的均勻懸浮液。葡甘聚糖凝膠可以以多種方式形成，所述方式包括但不限于:通過在堿的存在下水解葡甘聚糖的乙?；?。本發(fā)明的葡甘聚糖凝膠可以進(jìn)行修飾以促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖。示例性修飾包括但不限于:摻入細(xì)胞粘附促進(jìn)劑、化學(xué)交聯(lián)、表面涂層以及引入官能團(tuán)。[0034]如本文所使用，術(shù)語“堿性葡甘聚糖支架”指的是三維多孔基質(zhì)，其通過葡甘聚糖凝膠脫水形成并且具有大于約8的pH。本發(fā)明的堿性葡甘聚糖支架可進(jìn)行修飾以促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖。示例性修飾包括但不限于:摻入細(xì)胞粘附促進(jìn)劑、表面涂層，以及引入官能團(tuán)。
[0035]如本文所使用，術(shù)語“中和的葡甘聚糖支架”指的是多孔基質(zhì)，其提供適合細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程化(包括組織再生)的三維環(huán)境，并且具有約7的pH。本發(fā)明的中和的葡甘聚糖支架通過用水溶液中和堿性葡甘聚糖支架形成。本發(fā)明的中和的葡甘聚糖支架可進(jìn)行修飾以促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖。
[0036]如本文所使用，術(shù)語“接觸”指的是使至少兩種不同物質(zhì)進(jìn)行接觸以使其可以反應(yīng)的過程。然而應(yīng)認(rèn)識到，所得到的反應(yīng)產(chǎn)物可以由所添加的試劑之間的反應(yīng)直接產(chǎn)生，或由來自一種或多種所添加的試劑的中間體產(chǎn)生，所述中間體可以在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生。
[0037]如本文所使用，術(shù)語“細(xì)胞粘附促進(jìn)劑”指的是天然或合成試劑，其通過例如修飾基底表面和/或通過改變表面電荷來增強(qiáng)細(xì)胞對培養(yǎng)基底的粘附或附著。細(xì)胞粘附促進(jìn)劑還可增強(qiáng)血清或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白對培養(yǎng)基底的吸附。示例性細(xì)胞粘附促進(jìn)劑包括:聚-L-賴氨酸(PLL)、聚-D-賴氨酸(PDL)、RGD 肽(RGD)、KQAGDV, VAPG, FGL、胺基，以及如纖連蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。細(xì)胞粘附促進(jìn)劑還可以促進(jìn)細(xì)胞生長和細(xì)胞分化。
[0038]如本文所使用，術(shù)語“緩沖溶液”指的是緩沖劑或離子化合物在水中的均勻混合物，并且抵抗pH的改變，所述離子化合物是弱酸及其共軛堿或弱堿及其共軛酸的混合物。示例性緩沖劑包括但不限于:如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的磷酸鹽緩沖液、3-{[三(羥甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、1，3-二(三(羥甲基)甲氨基)丙烷(BIS-TRIS)、三(羥甲基)甲胺(TRIS)、4-2_羥乙 基-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、2-{[三(羥甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N, N，- 二 (2-乙磺酸)(PIPES)以及2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)。
[0039]如本文所使用，術(shù)語“酸性溶液”指的是酸或充當(dāng)質(zhì)子供體的物質(zhì)在水中的均勻混合物。酸性溶液具有小于7的pH。示例性酸性溶液包括但不限于:鹽酸，醋酸、酒石酸、蘋果酸和檸檬酸。
[0040]如本文所使用，術(shù)語“堿性溶液”指的是含有堿金屬或堿土金屬的鹽、pH大于7的堿性溶液。代表性的堿金屬和堿土金屬的鹽包括但不限于:氫氧化鈉、碳酸鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、氫氧化鎂、碳酸鎂、氫氧化鈣和碳酸鈣。
[0041]如本文所使用，術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)基”指的是支持細(xì)胞生長的物質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)基通常含有溶解在緩沖溶液中的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物，并且不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)不同類型的細(xì)胞。示例性細(xì)胞培養(yǎng)基包括但不限于:洛斯維帕克紀(jì)念研究所(RoswellPark Memorial Institute)培養(yǎng)基(RPMI)、達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’sModified Eagle Medium) (DMEM)、最低必需培養(yǎng)基(MEM)，達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物F-12培養(yǎng)基(DMEM/F12)、伊斯科夫氏改良的達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基(Iscove’ sModified Dulbecco’s Medium) (MDM)、國家典型培養(yǎng)物保藏中心培養(yǎng)基(NCTC)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0頂)。
[0042]如本文所使用，術(shù)語“降解”指的是將支架保持在一起的交聯(lián)鍵的斷裂。降解使用水解糖苷鍵的降解劑完成。支架降解劑可以是不消化附著到或嵌入中和的葡甘聚糖支架中的細(xì)胞的任何化學(xué)物質(zhì)或酶，如內(nèi)切-1，4-β -甘露聚糖酶、甘露聚糖內(nèi)切-1，4-β -甘露糖苷酶、糖基水解酶或纖維素酶。其它酶可用于本發(fā)明。
[0043]I1.中和的葡甘聚糖支架
[0044]本發(fā)明提供一種中和的葡甘聚糖支架，其作為用于三維細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程化的新型支架。中和的葡甘聚糖支架提供適合培養(yǎng)細(xì)胞的中性環(huán)境以及高度多孔結(jié)構(gòu)和孔徑。中和的葡甘聚糖支架可以摻入細(xì)胞粘附促進(jìn)劑。此外，支架是均勻的、熱穩(wěn)定的、彈性的、生物相容的以及可生物降解的，并且可以通過例如模制或切割制成適合3D組織培養(yǎng)和工程化的任何形狀和大小。中和的葡甘聚糖支架還可以通過高壓滅菌進(jìn)行滅菌，使其可用于移植和其它體內(nèi)應(yīng)用。
[0045]與基于藻酸鹽的支架(例如AlgiMatrix)不同，中和的葡甘聚糖支架的大小不受限制。另外，與需要多個(gè)、復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)來修飾基于藻酸鹽的支架相比，中和的葡甘聚糖支架可以在單一步驟中針對細(xì)胞粘附進(jìn)行修飾。
[0046]中和的葡甘聚糖支架可以通過適于中和堿性葡甘聚糖支架的任何條件來制備。合適的條件是(例如)可以將葡甘聚糖支架的PH在適量時(shí)間內(nèi)從約8或更高降低至約7的那些條件。例如，堿性葡 甘聚糖支架可以在加熱環(huán)境中(如在高壓釜中)暴露于水溶液。或者，合適的條件涉及使用水溶液持續(xù)沖洗堿性葡甘聚糖支架適量時(shí)間。
[0047]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于制備中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使PH大于約8的堿性葡甘聚糖支架在大于或約等于大氣壓的壓力下與水溶液接觸，以形成PH為約7的中和的葡甘聚糖支架，由此制備中和的葡甘聚糖支架。
[0048]堿性葡甘聚糖支架可以具有等于或大于約8.0的任何合適的pH。合適的pH的實(shí)例包括約 8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5,11.0 以及更高。
[0049]中和的葡甘聚糖支架可以具有約7的任何合適的pH。合適的pH的實(shí)例包括約6.0至約8.0，如約6.1至約7.9、約6.2至約7.8、約6.3至約7.7、約6.4至約7.6，以及約6.5至約7.5。
[0050]接觸可以在任何合適的溫度下進(jìn)行。例如，溫度可以是室溫、高于室溫或低于室溫。在一些實(shí)施方案中，溫度適于形成蒸汽。在一些實(shí)施方案中，溫度可以是約o°c至約200 V，或約20 V至約200 V，或約20 °C至約150 V，或約O V至約130 V，或約20 V至約130°C，或約20°C至約100 V，或約20°C至約50 V，或約30 V至約50 V，或約50 V至約200°C，或約75°C至約150°C，或約100°C至約150°C。溫度還可以是約(TC、5°C、10°C、15°C、20 °C >25 °C >30 °C >35 °C >40 °C >45 °C >50 °C >60 °C >70 °C >80 °C >90 °C >100 °C >110 °C >120 °C、130°c、140°c、15(rc、16(rc、17(rc、18(rc、19(rc或約 200°C。溫度還可以是約 30°C、31°C、32°C、33°C、34t:、35t:、36t:、37t:、38t:、39t:、4(rC、4rC、42t:、43t:、44t:*45t:。在一些實(shí)施方案中，接觸可以在約0°C至約130°C的溫度下進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，接觸可以在約20°C至約50°C的溫度下進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，接觸可以在約37°C的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，溫度約為室溫。
[0051]接觸可以在任何合適的壓力下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸可以在減壓或加壓下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸在高于大氣壓時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸可以在高于大氣壓約0.1psi至約50psi的壓力下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸可以在高于大氣壓約Ipsi至約50psi的壓力下進(jìn)行。其它有用的壓力包括:高于大氣壓約5ps1、10ps1、15ps1、20ps1、25ps1、30ps1、35ps1、40psi或約45psi。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接觸在高于大氣壓約Ipsi至約30psi的壓力下進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，接觸在高于大氣壓約IOpsi至約20psi的壓力下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸在高于大氣壓約15psi的壓力下進(jìn)行。
[0052]可以使用溫度和壓力的任何組合來中和堿性葡甘聚糖支架。例如，溫度可以足以產(chǎn)生蒸汽(如大于100°c )，并且壓力可以高于大氣壓(如高于大氣壓約0.1psi至約50psi)。在本發(fā)明中可使用溫度和壓力的其它組合，如在大氣溫度和壓力下。
[0053]接觸可以進(jìn)行任何合適的時(shí)間段在一些實(shí)施方案中，時(shí)間段可以是約I分鐘至約I個(gè)月。在其它實(shí)施方案中，接觸可以進(jìn)行約I小時(shí)至約I周。在其它實(shí)施方案中，接觸可以進(jìn)行約I小時(shí)至約I天。在其它實(shí)施方案中，接觸可以進(jìn)行約8小時(shí)至約20小時(shí)。
[0054]堿性葡甘聚糖支架可以包括多種其它組分。例如，在堿性葡甘聚糖支架中可以摻入細(xì)胞粘附促進(jìn)劑、趨化分子和細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子。
[0055]在一些實(shí)施方案中，堿性葡甘聚糖支架包括合適的細(xì)胞粘附促進(jìn)劑。在本發(fā)明中有用的細(xì)胞粘附促進(jìn)劑能夠?qū)⒓?xì)胞粘附至葡甘聚糖支架。細(xì)胞粘附促進(jìn)劑還可以促進(jìn)細(xì)胞生長和/或促進(jìn)細(xì)胞分化。示例性細(xì)胞粘附促進(jìn)劑包括但不限于--聚-L-賴氨酸(PLL)、聚-D-賴氨酸(I3DL)、RGD肽(RGD)、KQAGDV, VAPG, FGL、胺基，以及如纖連蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞粘附促進(jìn)劑可以是聚-L-賴氨酸(PLL)、聚-D-賴氨酸(TOL)、RGD 肽(RGD)、KQAGDV, VAPG, FGL、胺基、纖連蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可以來自任何合適的來源，所述來源包括但不限于哺乳動物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞粘附促進(jìn)劑是PLL或RGD。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞粘附促進(jìn)劑是PLL。
[0056]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于制備中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使PH大于約8的堿性葡甘聚糖支架與水溶液接觸，以形成pH為約7的中和的葡甘聚糖支架，其中堿性葡甘聚糖支架包含細(xì)胞粘附促進(jìn)劑，由此制備中和的葡甘聚糖支架。
[0057]在另一個(gè)實(shí)施方案中，堿性葡甘聚糖支架包括合適的趨化分子。示例性趨化分子包括但不限于:血清、趨化因子、形態(tài)發(fā)生蛋白、生長因子、透明質(zhì)酸。
[0058]在另一個(gè)實(shí)施方案中，堿性葡甘聚糖支架包括合適的細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子。示例性細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子包括但不限于:細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、肽基序和生長因子。
[0059]水溶液可以具有任何合適的組成。水溶液可以是水,或水和不降解或消化中和的葡甘聚糖支架的一種或多種非堿性試劑的混合物。合適的水溶液的實(shí)例包括但不限于:水、緩沖溶液、酸性溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，水溶液是水、緩沖溶液、酸性溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0060]在一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液是緩沖溶液。合適的緩沖溶液的實(shí)例包括但不限于:PBS、TAPS、BIS-TRIS 丙烷、TRIS、HEPES、TES、MOPS、PIPES 以及 MES。在一些實(shí)施方案中，緩沖溶液是PBS、HEPES, MES、MOPS、TRIS或BIS-TRIS丙烷。在某些實(shí)施方案中，緩沖溶液是PBS。
[0061]在另一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液是酸性溶液。合適的酸性溶液的實(shí)例包括但不限于:如但不限于鹽酸、醋酸、酒石酸、蘋果酸和檸檬酸。
[0062] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，水溶液是細(xì)胞培養(yǎng)基。合適的細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于:絡(luò)斯維帕克紀(jì)念研究所培養(yǎng)基(RPMI)、達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、最低必需培養(yǎng)基(MEM)，達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物F-12培養(yǎng)基(DMEM/F12)、伊斯科夫氏改良的達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基(IMDM)、國家典型培養(yǎng)物保藏中心培養(yǎng)基(NCTC)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(OIM)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基是洛斯維帕克紀(jì)念研究所培養(yǎng)基(RPMI)、達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、最低必需培養(yǎng)基(MEM)，達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物F-12培養(yǎng)基(DMEM/F12)、伊斯科夫氏改良的達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基(MDM)或國家典型培養(yǎng)物保藏中心培養(yǎng)基(NCTC)。
[0063]本發(fā)明的方法可以包括多種附加步驟。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括:形成包括葡甘聚糖粉末、堿性溶液和水的反應(yīng)混合物；將反應(yīng)混合物在約50°C至約130°C的溫度下加熱以形成葡甘聚糖凝膠；將葡甘聚糖凝膠的壓力增加到高于大氣壓約0.1psi至約50psi ;將葡甘聚糖凝膠冷卻至低于約50°C的溫度；以及將水從葡甘聚糖凝膠中移除以形成堿性葡甘聚糖支架。堿性葡甘聚糖支架可以用上文所描述的細(xì)胞粘附促進(jìn)劑進(jìn)行進(jìn)一步改良。[0064]本發(fā)明的方法可以包括多種附加步驟。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括:形成包括葡甘聚糖粉末、細(xì)胞粘附促進(jìn)劑、堿性溶液和水的反應(yīng)混合物；將反應(yīng)混合物在約50°C至約130°C的溫度下加熱以形成葡甘聚糖凝膠；將葡甘聚糖凝膠的壓力增加到高于大氣壓約0.1psi至約50psi ;將葡甘聚糖凝膠冷卻至低于約50°C的溫度；以及將水從葡甘聚糖凝膠中移除以形成堿性葡甘聚糖支架。
[0065]堿性溶液可以是含有堿金屬或堿土金屬的鹽的任何溶液。堿性溶液是堿性的，具有大于7的pH。代表性的堿金屬和堿土金屬的鹽包括但不限于:氫氧化鈉、碳酸鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、氫氧化鎂、碳酸鎂、氫氧化鈣和碳酸鈣。在一些實(shí)施方案中，堿性溶液包含氫氧化鈣。
[0066]葡甘聚糖粉末、細(xì)胞粘附促進(jìn)劑和氫氧化鈣各自可以以任何合適的量存在于反應(yīng)混合物中。在一些實(shí)施方案中，將葡甘聚糖粉末溶解于水中以提供在水中含有約1% w/v至約5% w/v葡甘聚糖的葡甘聚糖溶液。
[0067]在其它實(shí)施方案中，將細(xì)胞粘附促進(jìn)劑添加至葡甘聚糖溶液中，作為含有約
0.0001% w/v至約20 % w/v細(xì)胞粘附促進(jìn)劑的水溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞粘附促進(jìn)劑添加至葡甘聚糖溶液中，作為含有約0.0001% w/v至約10% w/v細(xì)胞粘附促進(jìn)劑的水溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞粘附促進(jìn)劑添加至葡甘聚糖溶液中，作為含有約0.0001%w/v至約1% w/v細(xì)胞粘附促進(jìn)劑的水溶液。
[0068]在其它實(shí)施方案中，將氫氧化鈣以提供氫氧化鈣與葡甘聚糖溶液的任何合適比率的量添加至葡甘聚糖溶液中。例如，氫氧化鈣與葡甘聚糖溶液的比率可以是約1:1000至約I: I (w/w) O在一個(gè)實(shí)施方案中，比率為1:10 (w/w)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將氫氧化鈣添加至葡甘聚糖溶液中，作為含有約1% w/v至約2% w/v氫氧化鈣的水溶液。
[0069]可以在如上文針對接觸步驟所描述的那些任何合適的溫度下，形成反應(yīng)混合物。
[0070]可以將反應(yīng)混合物加熱至任何合適的溫度。在一些實(shí)施方案中，溫度可以高于約 2(TC、25°C、3(TC、35t:、4(rC、45t:、5(rC、55t:、6(rC、65t:、7(rC、75t:、8(rC、85t:、9(rC、95°C、100°C、105°C、110°C、115°C、12(rC、125°C、13(rC或更高。在一些實(shí)施方案中，可以在高于約130°C的溫度下加熱反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方案中，可以將反應(yīng)混合物加熱至高于約80°C的溫度。[0071]可以將葡甘聚糖凝膠的壓力增加至任何合適的壓力。在一些實(shí)施方案中，可以將壓力增加至高于大氣壓約0.1psi至約200psi。在其它實(shí)施方案中，將壓力增加至高于大氣壓約0.1psi至約50psi。在某些實(shí)施方案中，將壓力增加至約30psi。
[0072]可以將葡甘聚糖凝膠的溫度 冷卻至任何合適的溫度。在一些實(shí)施方案中，將溫度冷卻至約低于80°C。在某些實(shí)施方案中，將溫度冷卻至低于約50°C。
[0073]可以通過任何合適的方法將水從葡甘聚糖凝膠中移除。在一些實(shí)施方案中，通過冷凍干燥、升華或熱誘導(dǎo)的相分離操作進(jìn)行移除步驟。在某些實(shí)施方案中，通過升華進(jìn)行移除步驟。
[0074]中和的葡甘聚糖支架可以具有任何合適的孔徑。在一些實(shí)施方案中，中和的葡甘聚糖支架具有約100 μ m至約400 μ m的孔徑。在其它實(shí)施方案中，中和的葡甘聚糖支架可以具有約150 μ m至約350 μ m的孔徑。在其它實(shí)施方案中，中和的葡甘聚糖支架可以具有約200 μ m至約300 μ m的孔徑。
[0075]在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使pH大于約8的堿性葡甘聚糖支架在大于或約等于大氣壓的壓力下與水溶液接觸，以形成PH為約7的中和的葡甘聚糖支架，由此制備中和的葡甘聚糖支架。
[0076]接觸還可以在任何合適的真空壓力下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸可以在約
0.1mmHg至約760mmHg的真空壓力下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸可以在約IOmmHg至約500mmHg的真空壓力下進(jìn)行。其它有用的真空壓力包括約20mmHg、50mmHg、IOOmmHg、200mmHg、300mmHg、400mmHg或500mmHg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接觸在約IOpsi至約300mmHg的真空壓力下進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，接觸在約400mmHg的真空壓力下進(jìn)行。
[0077]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種中和的葡甘聚糖支架，所述中和的葡甘聚糖支架通過使pH大于約8的堿性葡甘聚糖支架與水溶液接觸，以形成pH為約7的中和的葡甘聚糖支架來制備。
[0078]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種中和的葡甘聚糖支架，所述葡甘聚糖支架通過使PH大于約8的堿性葡甘聚糖支架與水溶液接觸，以形成pH為約7的中和的葡甘聚糖支架來制備，其中堿性葡甘聚糖支架包含細(xì)胞粘附促進(jìn)劑。
[0079]本發(fā)明還提供一種降解本發(fā)明的中和的葡甘聚糖支架的方法，其通過使中和的葡甘聚糖支架與降解劑接觸來實(shí)現(xiàn)。降解劑可以是能夠水解糖苷鍵的任何合適的試劑。降解劑可以是任何化學(xué)物質(zhì)或酶?？捎米鹘到鈩┑拿赴ǖ幌抻?內(nèi)切-1，4-β-甘露聚糖酶、甘露聚糖內(nèi)切-1，4-β-甘露糖苷酶、糖基水解酶和纖維素酶。其它降解劑包括但不限于:如甘露聚糖酶，果膠酶，木聚糖酶，葡聚糖酶，半乳聚糖酶，或其它的酶。
[0080]本發(fā)明還提供一種復(fù)合支架，其包含本發(fā)明的中和的葡甘聚糖支架和合適的生物材料。合適的生物材料包括:基于蛋白質(zhì)和多糖的生物材料以及基于聚合物、肽和陶瓷的生物材料。示例性生物材料包括但不限于:細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(例如，纖連蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白)、藻酸鹽、殼聚糖、透明質(zhì)酸、基質(zhì)膠、明膠、羥基磷灰石、磷酸鈣和生物活性玻璃。
[0081]本發(fā)明的方法可以用于制備多種葡甘聚糖支架。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種中性葡甘聚糖支架。中性葡甘聚糖支架可以具有約7的pH。
[0082]在一些實(shí)施方案中，葡甘聚糖支架可以是pH等于或大于約8的堿性葡甘聚糖支架。
[0083]在一些實(shí)施方案中，葡甘聚糖支架包括細(xì)胞粘附促進(jìn)劑。在本發(fā)明中可以使用任何合適的細(xì)胞粘附促進(jìn)劑，如上文所描述的那些。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞粘附促進(jìn)劑可以是聚-L-賴氨酸(PLL)、聚-D-賴氨酸(PDL)、RGD 肽(RGD)、KQAGDV, VAPG, FGL、胺基、纖連蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞粘附促進(jìn)劑可以是聚-L-賴氨酸(PLL)。
[0084]如上所述，可以通過多種方法(如上文所描述的那些)制備本發(fā)明的葡甘聚糖支架。在一些實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法制備本發(fā)明的葡甘聚糖支架。
[0085]II1.培養(yǎng)細(xì)胞
[0086]本發(fā)明的中和的葡甘聚糖支架可用于培養(yǎng)細(xì)胞。在中和的葡甘聚糖支架上培養(yǎng)的細(xì)胞可以與其它細(xì)胞和細(xì)胞類型相互作用并形成聚集物?？梢酝ㄟ^摻入細(xì)胞粘附促進(jìn)劑來促進(jìn)細(xì)胞對中和的葡甘聚糖支架的粘附以及在其上的增殖。中和的葡甘聚糖支架支持長期培養(yǎng)。當(dāng)在中和的葡甘聚糖支架上培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞可以經(jīng)歷增殖和分化。例如，干細(xì)胞可以分化成如骨細(xì)胞、軟骨、皮膚細(xì)胞和血液細(xì)胞的功能譜系(functional lineages)。因此，在中和的葡甘聚糖支架上可以支持如骨生成、軟骨生成和血細(xì)胞生成的細(xì)胞過程。
[0087]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在中和的葡甘聚糖支架上培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法包括將本發(fā)明的中和的葡甘聚糖支架和細(xì)胞的反應(yīng)混合物加熱，以使細(xì)胞繁殖，由此在中和的葡甘聚糖支架上培養(yǎng)細(xì)胞?？梢栽隗w內(nèi)或體外培養(yǎng)細(xì)胞。
[0088]合適的細(xì)胞類型包括但不限于:體細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元和軟骨細(xì)胞；以及干細(xì)胞和祖細(xì)胞，如內(nèi)皮祖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞，誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和肌肉干細(xì)胞，以及其衍生物。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是體細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞是干細(xì)胞或祖細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是干細(xì)胞。在某些其它實(shí)施方案中，細(xì)胞是干細(xì)胞的衍生物。
[0089]可以通過使用任何合適的試劑溶解葡甘聚糖支架來回收在葡甘聚糖支架上培養(yǎng)的細(xì)胞。例如，可以使用如甘露聚糖酶、纖維素酶、果膠霉、木聚糖酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶等的一種或多種酶溶解葡甘聚糖支架。用于溶解葡甘聚糖支架的其它試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0090]IV.實(shí)施例
[0091]實(shí)施例1:葡甘聚糖支架的制備
[0092]將葡甘聚糖粉末(l_5g)溶解于100mL的蒸餾水中并緩慢攪拌5分鐘，接著將溶液在室溫下孵育60分鐘。將氫氧化1丐溶液(1.5%, IOml ；Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)添加至葡甘聚糖溶液中并劇烈混合I分鐘。將聚-L-賴氨酸(Sigma-Aldrich) (0.001% w/v至I % w/v水溶液)添加至混合物中，并在去封閉室(decloaking chamber)中加熱至125°C持續(xù)30分鐘。冷卻至室溫后，將葡甘聚糖凝膠浸泡在蒸餾水中過夜。將葡甘聚糖凝膠放置在培養(yǎng)皿中并接著在氣流冷凍機(jī)中在低于或等于_50°C下冷凍30分鐘。使用Vitris型50-SRC-5升華器使水升華。擱板溫度為12°C，并且冷凝器溫度低于或等于_58°C，并且真空維持在80-100毫托。接著將所得到的葡甘聚糖產(chǎn)物包裝在聚乙烯袋中、真空密封并且在低于或等于-20°C下貯存直到使用。
[0093]中和葡甘聚糖支架[0094]升華之前的水沖洗。在水升華之前，在大量的水(大約5升)中過夜(16-24小時(shí))洗滌葡甘聚糖凝膠若干次。水升華之后，將葡甘聚糖支架浸泡在水中，并且將支架壓靠在PH指示器上。支架顯示出大于10的pH。這表明在水升華之前洗滌葡甘聚糖凝膠和水升華后將葡甘聚糖支架簡短浸泡在水中不足以中和所述支架。
[0095]常規(guī)PBS洗滌。將葡甘聚糖支架在PBS中洗滌一次或三次。這導(dǎo)致支架的表層(僅表面)中和，其中內(nèi)部PH大于9或10。還將葡甘聚糖支架在PBS中洗滌10分鐘、30分鐘和60分鐘。在所有情況下，這些方法導(dǎo)致如上文所描述的支架的表層中和。這些發(fā)現(xiàn)表明在緩沖溶液中對支架的常規(guī)洗滌對于對培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞至關(guān)重要的支架的中和來說是不夠的。
[0096]加熱的PBS洗滌。接著將葡甘聚糖支架在95°C _100°C的PBS中孵育30分鐘。注意到支架的可見收縮。在沸騰的PBS中30分鐘后，將支架切割并壓靠到pH指示器上。支架的外部區(qū)域顯示出中性pH。然而，支架的中心顯示出支架材料的凝縮，并且此中心區(qū)域仍保持在中性范圍外。在如上文所描述的所有情況中，支架保持漂浮，表明存在內(nèi)部氣穴(airpockets)。即使在用沸騰的PBS處理30分鐘后，支架仍保持漂浮，并有明顯的不希望的形狀改變。這些發(fā)現(xiàn)表明PBS并未將滯留在支架內(nèi)部的空氣完全排出，這導(dǎo)致中和不充分。
[0097]加壓的PBS洗滌。將葡甘聚糖支架轉(zhuǎn)移到含有PBS的燒杯，并且在120°C下在高于大氣壓15psi的加壓室中孵育30分鐘。未觀察到支架的收縮。支架浸沒在PBS中，表明用PBS完全排出了氣穴。將葡甘聚糖產(chǎn)物冷卻并在無菌PBS中在4°C下貯存直到使用。使用PH指示器以確認(rèn)支架的pH為中性。整個(gè)支架顯示出中性pH而沒有任何形狀改變。
[0098]真空下PBS洗滌。將 葡甘聚糖支架放置在過濾器上，并且將400mmHg真空壓力施加到支架底部。將Iml PBS施加到支架頂部10次。在此過程后，使用pH指示器來確認(rèn)支架的PH為中性。整個(gè)支架顯示出中性pH而沒有任何形狀改變。
[0099]實(shí)施例2:中和的葡甘聚糖支架上的細(xì)胞生長
[0100]細(xì)胞的制備。對于人間質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)，將骨髓單核細(xì)胞(N = 3，I名女性和2名男性，20-40 歲；Cambrex, East Rutherford, NJ, USA)鋪在含有 20%胎牛血清(FBS)、1%L-谷胺酰胺和 I %青霉素-鏈霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的 a -MEM 的 100mm 板上，并且在37°C下5% CO2中孵育。每隔一天用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌板三次，直到細(xì)胞達(dá)到大約80%匯合。用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)在37°C下孵育細(xì)胞5分鐘。以1:1比率將培養(yǎng)基添加至胰蛋白酶-EDTA中的細(xì)胞中以滅活。將細(xì)胞以5xl03細(xì)胞/cm2重新鋪在培養(yǎng)基中。培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)3代，在每次傳代時(shí)使用受控速率方案冷藏保存，并且貯存在液氮中直到使用。對于CD34+細(xì)胞，將上文所提到的骨髓單核細(xì)胞的子集與偶聯(lián)到PE的CD34 抗體(克隆 581，BD Biosciences, San Jose, CA, USA)在選擇緩沖液(含有 0.5%牛血清白蛋白-BSA的PBS和PBS中的2mM EDTA)中在4°C下孵育30分鐘。在選擇緩沖液中洗漆細(xì)胞并與抗 _PE 微珠(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)在 4°C下孵育 20分鐘。洗漆細(xì)胞并重懸于500 μ L選擇緩沖液中，接著施加到分離柱(Miltenyi Biotec)。洗滌分離柱三次，并用Iml選擇緩沖液洗脫保留的細(xì)胞。對洗脫的細(xì)胞進(jìn)行第二輪分離。
[0101]轉(zhuǎn)導(dǎo)。將來自第二代的冷藏保存的hMSC解凍，并用在MND啟動子控制下的表達(dá)螢火蟲熒光素酶的HIV-1衍生的慢病毒載體(IxlO6感染性顆粒/ml)，在含有4mg/ml聚凝胺的培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)中進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。將細(xì)胞孵育過夜、用PBS洗滌，并用新培養(yǎng)基補(bǔ)充。培養(yǎng)細(xì)胞直到其達(dá)到大約80%匯合。將100mg/ml的D-熒光素添加至細(xì)胞子集中，并使用光度計(jì)(Sirius, Berthold, Pforzheim, Germany)測量生物發(fā)光以確認(rèn)轉(zhuǎn)導(dǎo)成功。
[0102]細(xì)胞接種和生物發(fā)光成像。將葡甘聚糖支架切割成大約Icm xlcm x0.5cm(寬度X深度X高度)、再水合，并用PBS洗滌5次，并且在培養(yǎng)基中孵育過夜。將hMSC(1x106/支架)接種到12孔板中的葡甘聚糖支架上并且培養(yǎng)5周。向每個(gè)孔中添加100mg/ml的D-熒光素之后，使用 IVIS200 成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences, Hopkinton，MA，USA)針對生物發(fā)光每3-4天對細(xì)胞成像，并且使用Living Image軟件(3.1版,Caliper Life Sciences)分析圖像。
[0103]掃描電子顯微術(shù)。將接種和未接種hMSC的葡甘聚糖支架在一系列梯度乙醇中脫水。具有hMSC的支架還與CD34+細(xì)胞(IxlO6)共培養(yǎng)并孵育3天，接著進(jìn)行乙醇脫水。將樣品用碳雙面膠帶安置在12mm招銷短樁(aluminum pin stub)上,使用PELCO Auto SputterCoater SC-7濺射鍍金，并在Philips XL30TMP掃描電子顯微鏡上進(jìn)行觀察。
[0104]實(shí)施例3:酶消化
[0105]將凍干的內(nèi)切-1, 4-β -甘露聚糖酶(Megazyme)或獲自黑曲霉(Aspergillusniger)的纖維素酶(Sigma-Aldrich)溶解于培養(yǎng)基中。將接種了 hMSC的支架在0.5單位/ml>5.0單位/ml,或50單位/ml的內(nèi)切-1，4-β -甘露聚糖酶或纖維素酶中孵育過夜。目測支架的降解。一旦支架完全溶解，就對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
_6] 實(shí)施例4:成骨分化
[0107]將接種了 hMS C的支架在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cambrex)或培養(yǎng)基(對照)中孵育，按照制造商的推薦每3-4天更換培養(yǎng)基。三周后，在10%福爾馬林中固定支架，接著進(jìn)行乙醇脫水和石蠟包埋。將支架切成6_切片，以用于免疫組織化學(xué)和馮庫薩染色。
[0108]免疫細(xì)胞化學(xué)。用二甲苯處理切片(5-6 μ m)，接著用梯度濃度乙醇處理。在檸檬酸緩沖液(pH6，Invitrogen)中進(jìn)行熱介導(dǎo)的抗原修復(fù)之前，在PBS中洗滌載玻片。冷卻后，施加濃度逐漸降低的PBS中的熱檸檬酸緩沖液，接著用添加到每個(gè)載玻片的BackgroundSniper (BioCare Medical, Concord, CA, USA)孵育 15 分鐘。用 PBS 洗漆載玻片兩次，接著用具有2%山羊血清(Sigma-Aldrich)的封閉緩沖液(I % BSA、0.1 %魚皮明膠，0.1 %Triton X，0.05%吐溫-20)孵育I小時(shí)。用PBS洗滌兩次后，將稀釋于第一抗體緩沖液(1%BSA、0.1%魚皮凝膠)中的第一抗體在加濕室中在4°C下與載玻片孵育過夜。所用的第一抗體是以1:50稀釋的廣譜兔多克隆抗人細(xì)胞角蛋白抗體(Abeam, Cambridge, MA, USA)和以1:100稀釋的小鼠單克隆抗人波形蛋白抗體(Sigma-Aldrich)。對于骨標(biāo)記物，使用在1:200稀釋度下的大鼠單克隆抗人骨橋蛋白抗體和小鼠單克隆抗人骨唾液蛋白II抗體(MiIlipore, Billerica, MA, USA) ?包括小鼠IgG、大鼠IgG和兔IgG同種型對照(Invitrogen)。將載玻片用PBS洗滌5分鐘并與第二抗體在黑暗中、室溫下孵育lh。所用的第二抗體是以1:200稀釋于突光抗體稀釋劑(BioCare Medical)中的Alexa Fluor488山羊抗小鼠、Alexa Fluor954山羊抗大鼠和Alexa Fluor594山羊抗兔抗體(Invitrogen)。用PBS洗滌兩次后，用具有DAPI的ProLong Gold?.抗褪色試劑(InvitiOgen)封固載玻片，并且放置蓋玻片。在Olympus BX61顯微鏡下觀察載玻片。
[0109]馮庫薩染色。用二甲苯處理切片(5_6μπι)，接著用梯度濃度的乙醇處理。將切片在蒸餾水中洗滌并在紫外光下用I %硝酸銀水溶液孵育I小時(shí)，接著在蒸餾水中洗滌并用5%硫代硫酸鈉孵育5分鐘。將切片在蒸懼水中洗漆并用0.1 %核固紅(nuclear fast red)溶液孵育5分鐘，接著通過梯度醇和二甲苯進(jìn)行脫水。接著將蓋玻片放置在永久封固培養(yǎng)基中的載玻片上，并在Olympus BX61顯微鏡下進(jìn)行觀察。
[0110]結(jié)果以平均值土平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)報(bào)道，并使用MicrosoftExcel (Microsoft, Redmond, WA)計(jì)算。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p〈0.05)由雙側(cè)學(xué)生t_檢驗(yàn)分析來確定。 [0111]盡管為了清楚理解的目的已通過說明和實(shí)例的方式對前述發(fā)明進(jìn)行了較為詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，可在隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實(shí)施某些改變和修改。另外，本文所提供的每個(gè)參考文獻(xiàn)以引用的方式整體并入，其程度如同每個(gè)參考文獻(xiàn)單獨(dú)地以引用的方式并入一樣。
【權(quán)利要求】
1.一種制備中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括:使PH大于約8的堿性葡甘聚糖支架在大于或約等于大氣壓的壓力下與水溶液接觸，以形成PH為約7的中和的葡甘聚糖支架，由此制備所述中和的葡甘聚糖支架。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在約0°C至約130°C的溫度下進(jìn)行所述接觸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在約20°C至約50°C的溫度下進(jìn)行所述接觸。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在約37°C的溫度下進(jìn)行所述接觸。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在高于大氣壓約0.1psi至約50psi的壓力下進(jìn)行所述接觸。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸進(jìn)行約I分鐘至約I個(gè)月的時(shí)間段。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸進(jìn)行約I小時(shí)至約I周的時(shí)間段。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸進(jìn)行約I小時(shí)至約I天的時(shí)間段。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸進(jìn)行約8小時(shí)至約20小時(shí)的時(shí)間段。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述堿性葡甘聚糖支架進(jìn)一步包含細(xì)胞粘附促進(jìn)劑。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞粘附促進(jìn)劑選自:聚-L-賴氨酸(PLL)、聚-D-賴氨酸(I3DL)、RGD肽(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、胺基、纖連蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述細(xì)胞粘附促進(jìn)劑是聚-L-賴氨酸(PLL)。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括: 形成包含葡甘聚糖粉末、所述細(xì)胞粘附促進(jìn)劑、堿性溶液和水的反應(yīng)混合物； 將所述反應(yīng)混合物在約50°C至約130°C的溫度下加熱以形成葡甘聚糖凝膠； 將所述葡甘聚糖凝膠的所述壓力增加至高于大氣壓約0.1psi至約200psi ； 將所述葡甘聚糖凝膠冷卻至低于約50°C的溫度；以及 將水從所述葡甘聚糖凝膠移除以形成所述堿性葡甘聚糖支架。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中將所述壓力增加約14.7psi至約50psi。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中通過升華進(jìn)行所述移除步驟。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述水溶液選自:水、緩沖溶液、酸性溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述水溶液是緩沖溶液。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述緩沖溶液選自:PBS、HEPES、MES、MOPS、TRIS和BIS-TRIS丙烷。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述緩沖溶液是PBS。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述水溶液是細(xì)胞培養(yǎng)基。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基選自:洛斯維帕克紀(jì)念研究所培養(yǎng)基(RPMI)、達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、最低必需培養(yǎng)基(MEM)，達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物F-12培養(yǎng)基(DMEM/F12)、伊斯科夫氏改良的達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基(IMDM)、國家典型培養(yǎng)物保藏中心培養(yǎng)基(NCTC)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(OIM)。
22.—種制備中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括:使pH大于約8的堿性葡甘聚糖支架在真空壓力下與水溶液接觸，以形成PH為約7的中和的葡甘聚糖支架，由此制備所述中和的葡甘聚糖支架。
23.一種在中和的葡甘聚糖支架上培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法包括:將如權(quán)利要求1所述的中和的葡甘聚糖支架和細(xì)胞的反應(yīng)混合物加熱，以使所述細(xì)胞繁殖，由此在所述中和的葡甘聚糖支架上培養(yǎng)細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述細(xì)胞選自:體細(xì)胞、干細(xì)胞或祖細(xì)胞及以上的衍生物。
25.一種葡甘聚糖支架，其具有約7的pH。
26.如權(quán)利要求25所述的葡甘聚糖支架，其包含細(xì)胞粘附促進(jìn)劑。
27.如權(quán)利要求26所述的葡甘聚糖支架，其中所述細(xì)胞粘附促進(jìn)劑選自:聚-L-賴氨酸(PLL)、聚-D-賴氨酸(PDL)、R⑶肽(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、胺基、纖連蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白。
28.如權(quán)利要求25所述的葡甘聚糖支架，其中所述細(xì)胞粘附促進(jìn)劑是聚-L-賴氨酸(PLL)。
29.如權(quán)利要求25所述的葡甘聚糖支架，其通過權(quán)利要求1所述的方法制備。
【文檔編號】C12N5/00GK103958666SQ201280058878
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月29日
【發(fā)明者】C·暢·I·李 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會