專利名稱：一種β-D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及β-D-呋喃果糖苷酶(β-D-fructofuranosidase, EC 3.1.2. 26,簡(jiǎn)寫為FFase)的制備方法，尤其是一種β -D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
低聚果糖(fructooligosaccharides)是一種新型的保健食品，是功能性低聚糖中頗具代表性的一種。低聚果糖是通過(guò)β _(2，I)糖苷鍵在蔗糖的果糖基上連接f 3個(gè)果糖基而形成的一系列果糖寡聚體，主要包括蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)。日常食用的蔬菜與水果中含有此類寡糖，尤其是洋蔥、牛蒡、芒筍和麥類中含量較高。低聚果糖具有低熱值、預(yù)防齲齒、增殖腸道內(nèi)的雙歧桿菌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等生理功能，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)藥工業(yè)，是一種重要的保健型添加劑。目前工業(yè)上生產(chǎn)低聚果糖方法主要有兩種一是以菊芋為原料提取菊粉，再經(jīng)酶水解而得。第二種方法是以蔗糖為原料，采用β-D-呋喃果糖苷酶作為生物催化劑通過(guò)酶促催化一系列轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)而獲得低聚果糖。后一種方法中可以通過(guò)將β-D-呋喃果糖苷酶固定化而實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)，具有自動(dòng)化程度高、操作穩(wěn)定性好、酶能反復(fù)使用、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)而受到青睞，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上的大多數(shù)低聚果糖產(chǎn)品都是采用這種方法生產(chǎn)出來(lái)的。β-D-呋喃果糖苷酶(β-D-fructofuranosidase, EC 3.1. 2· 26,簡(jiǎn)寫為 FFase)又稱蔗糖酶或轉(zhuǎn)化酶，可以催化水解β-D-果糖苷鍵，也可以催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。它廣泛地存在于生物界，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，植物中的FFase催化活性很弱，產(chǎn)率低，且受到季節(jié)限制，而來(lái)自微生物的FFase比植物的催化活性高，且耐高溫，反應(yīng)過(guò)程中受雜菌的污染機(jī)會(huì)少，使用方便。能產(chǎn)生FFase的微生物主要有黑曲霉、米曲霉、酵母以及節(jié)桿菌等。微生物產(chǎn)FFase轉(zhuǎn)糖基活力的高低和發(fā)酵 制備的難易程度是決定酶轉(zhuǎn)化法制備低聚果糖工藝是否經(jīng)濟(jì)的關(guān)鍵因素。但是，目前對(duì)微生物源特別是曲霉來(lái)源的FFase發(fā)酵制備主要采用液體深層發(fā)酵法，存在發(fā)酵周期長(zhǎng)(一般要7天左右)、發(fā)酵產(chǎn)酶水平低、廢水排放量大、生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)給實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)很多困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種單位基質(zhì)酶活力高、發(fā)酵周期短、工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低的β-D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法?！Nβ -D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特別之處在于，包括如下步驟(I)孢子液的準(zhǔn)備首先制備試管斜面培養(yǎng)基，將黑曲霉接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，在25-32 °C培養(yǎng)3 5天至長(zhǎng)出孢子，然后向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液；(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)制備液體種子培養(yǎng)基，按照體積比2% 5%的接種量將步驟
(I)得到的孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于25 32°C、轉(zhuǎn)速180 220rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)2 4天，獲得種子液；(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β -D-呋喃果糖苷酶制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌?，然后在料層厚度I 3厘米、濕度45% 80%、發(fā)酵溫度25-35°C下靜置發(fā)酵3 5天；(4)后處理獲得β -D-呋喃果糖苷酶取步驟(3)得到的固體培養(yǎng)物，加入其6-10倍重量的50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提至少4小時(shí)，經(jīng)過(guò)離心或過(guò)濾使固液分離，得到的上清液或?yàn)V液即為粗β -D-呋喃果糖苷酶酶液。步驟(3)中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法是將1. 5 3倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，然后在121°C滅菌20分鐘即可，其中營(yíng)養(yǎng)液的組成以g/L計(jì)為，甘蔗糖蜜10 30，玉米漿5 15，脫脂奶粉3 10，硝酸鈉I 3，磷酸氫二鉀2 5，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升即可；固體混合物是由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其組成按照重量比為甘蔗渣稻殼大豆餅為3 6 I 3 :0· 5 1. 5。步驟(I)中試管斜面培養(yǎng)基的組成以g/L計(jì)為，蔗糖30，硝酸鈉3，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，硫酸亞鐵O. 01，瓊脂15，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升即可。步驟(I)中黑曲霉為黑曲霉AS 3.877。步驟(2)中液體種子培養(yǎng)基的組成以g/L計(jì)為，甘蔗糖蜜20，蛋白胨10，酵母膏5，硝酸鈉2，磷酸氫二鉀3， 硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升即可。步驟(3)中種子液接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，種子液的接種比例為5 15暈升/100克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明方法克服了 FFase液態(tài)發(fā)酵的缺點(diǎn)，提供一種FFase的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，用固態(tài)發(fā)酵的方法為低聚果糖的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)酶源。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是(O固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基以甘蔗渣、稻殼、大豆餅等為原料，原料價(jià)格低廉；(2)發(fā)酵周期短，工藝設(shè)備簡(jiǎn)單，降低成本，益于工業(yè)化生產(chǎn)；(3)液體廢水較液體發(fā)酵大大減少，從根本上有效解決污水排放問(wèn)題，非常有利于環(huán)境保護(hù)。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中采用的檢測(cè)方法是FFase轉(zhuǎn)果糖基活力的測(cè)定，用50mM、pH 5. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配制25% (w/w)的蔗糖溶液作為底物，加入粗FFase酶液適量(使反應(yīng)I小時(shí)后，體系中蔗果三糖的含量不超過(guò)總糖含量的10% (w/w)為宜)，置于55°C水浴中振蕩反應(yīng)I小時(shí)，然后于沸水浴中加熱10分鐘，終止酶反應(yīng)。用高效液相色譜法測(cè)定反應(yīng)體系中的蔗果三糖，由蔗果三糖的量來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)果糖基活力。一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘在上述條件下產(chǎn)生IumoL鹿果三糖所需的酶量。色譜條件色譜柱，Hypersi1-NH2 (4. 6X250X5,大連依利特公司)；示差檢測(cè)器的靈敏度，1/8 ;流動(dòng)相，乙腈水=68:32;流速，lmL/min;柱溫，30°C。本發(fā)明及下列實(shí)施例中所采用的黑曲霉是黑曲霉AS 3. 877，其為中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)公開(kāi)供索取、購(gòu)買的菌株，菌種編號(hào)為3. 877，中文菌名為黑曲霉，拉丁學(xué)名為 Aspergillus niger。實(shí)施例1 :固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備將30g蔗糖、3g硝酸鈉、Ig磷酸氫二鉀、O. 5g硫酸鎂、O. 5g氯化鉀、O. Olg硫酸亞鐵、15g瓊脂溶于800毫升去離子水中，再定容至1000毫升，pH自然，121°C滅菌20分鐘，冷卻凝固之前傾斜30度制成試管斜面培養(yǎng)基。將黑曲霉AS 3. 877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)5天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入O. 9%的生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)將20g甘蔗糖蜜、IOg蛋白胨、5g酵母膏、2g硝酸鈉、3g磷酸氫二鉀、O. 5g硫酸鎂、O. 5g氯化鉀溶于800毫升去離子水中，再定容至1000毫升，pH自然，121°C滅菌20分鐘，制備液體種子培養(yǎng)基。按照體積比2%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于25°C、轉(zhuǎn)速180rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)2天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase :將1. 5倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜10，玉米漿5，脫脂奶粉3，硝酸鈉I，磷酸氫二鉀2，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為3:1:0.5。將種子液按照5毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌希缓笤诹蠈雍穸菼厘米(即種子液先加入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后充分?jǐn)嚢杌旌?，混合后將此混合物放在發(fā)酵容器內(nèi)，使其高度I厘米，下同)、濕度45%、發(fā)酵溫度25°C下靜置發(fā)酵3天。(4)后處理獲得FFase `:取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提4小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為236. 48U/mL。實(shí)施例2 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS 3.877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)5天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比2. 25%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于26°C、轉(zhuǎn)速185rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)2天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將1. 75倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜12. 5，玉米漿7. 5，脫脂奶粉4，硝酸鈉1. 25，磷酸氫二鉀2. 25，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為3. 25:1. 25:0. 75。將種子液按照7. 5毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌?，然后在料層厚?. 25厘米、濕度50%、發(fā)酵溫度26°C下靜置發(fā)酵3天。
(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提4. 5小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為274. 32U/mL。實(shí)施例3 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS 3.877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，27°C培養(yǎng)5天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比2. 5%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于27°C、轉(zhuǎn)速190rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)2天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將2倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜15，玉米漿10，脫脂奶粉5，硝酸鈉1. 5，磷酸氫二鉀2. 5，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為3. 5:1. 5:1. O。將種子液按照10毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌?，然后在料層厚?. 5厘米、濕度55%、發(fā)酵溫度27°C下靜置發(fā)酵3天。(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提5小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為355. 25U/mL。實(shí)施例4

固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS 3.877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比2. 75%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于28°C、轉(zhuǎn)速195rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)3天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將2. 25倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜17. 5，玉米漿10，脫脂奶粉6，硝酸鈉1. 75，磷酸氫二鉀2. 75，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為3. 75:1. 75:1. O。將種子液按照10毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌?，然后在料層厚?. 75厘米、濕度60%、發(fā)酵溫度28°C下靜置發(fā)酵4天。(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提5小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為420. 45U/mL。
實(shí)施例5 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS3. 877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比3%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于28°C、轉(zhuǎn)速200rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)3天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將2. 5倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜20，玉米漿10，脫脂奶粉5，硝酸鈉2，磷酸氫二鉀3，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為4:2:1。將種子液按照10毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌希缓笤诹蠈雍穸?厘米、濕度60%、發(fā)酵溫度28°C下靜置發(fā)酵4天。(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉 碎，再攪拌浸提5小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為521. 65U/mL。實(shí)施例6 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS3. 877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比3. 5%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于28°C、轉(zhuǎn)速200rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)3天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將2. 5倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜20，玉米漿12. 5，脫脂奶粉5，硝酸鈉2，磷酸氫二鉀3. 5，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為4. 5:2. 5:1。將種子液按照10毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌?，然后在料層厚?厘米、濕度65%、發(fā)酵溫度28 °C下靜置發(fā)酵4天。(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提5. 5小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為486. 13U/mL。實(shí)施例7 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS 3.877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比3. 75%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于28°C、轉(zhuǎn)速200rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)3天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將2. 5倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜22. 5，玉米漿12. 5，脫脂奶粉7，硝酸鈉2，磷酸氫二鉀3. 5，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為4. 75:2. 5:1. 25。將種子液按照12. 5毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌希缓笤诹蠈雍穸?厘米、濕度65%、發(fā)酵溫度28°C下靜置發(fā)酵4天。(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提5. 5小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為465. 20U/mL。實(shí)施例8 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS 3.877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，29°C 培養(yǎng)4天至長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比4%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于29°C、轉(zhuǎn)速200rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)3天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將2. 5倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜25，玉米漿12. 5，脫脂奶粉7，硝酸鈉2. 5，磷酸氫二鉀4，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為5:2. 75:1. 25。將種子液按照12. 5毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌?，然后在料層厚?. 5厘米、濕度70%、發(fā)酵溫度29°C下靜置發(fā)酵4天。(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提6小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為440. 25U/mL。實(shí)施例9 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS 3.877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)4天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比4. 5%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于30°C、轉(zhuǎn)速210rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)3天，獲得種子液。
(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將2. 75倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜27. 5，玉米漿12. 5，脫脂奶粉8，硝酸鈉2. 75，磷酸氫二鉀4. 5，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為5. 5:2. 75:1. 25。將種子液按照12. 5毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌?，然后在料層厚?. 75厘米、濕度75%、發(fā)酵溫度32°C下靜置發(fā)酵4天。(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提7小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為365. 45U/mL。實(shí)施例10 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS 3.877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)5天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比5%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng) 基，于32°C、轉(zhuǎn)速220rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)3天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將3倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜27. 5，玉米漿15，脫脂奶粉9，硝酸鈉3，磷酸氫二鉀5，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為6:2. 5:1. 5。將種子液按照15毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌?，然后在料層厚?. 75厘米、濕度75%、發(fā)酵溫度32 °C下靜置發(fā)酵5天。(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提7小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為205. 85U/mL。實(shí)施例11 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase。(I)孢子液的準(zhǔn)備試管斜面培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。將黑曲霉AS 3.877接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)5天長(zhǎng)出孢子，向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液。(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基的制備同實(shí)施例1。按照體積比5%的接種量將孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于32°C、轉(zhuǎn)速220rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)4天，獲得種子液。(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FFase將3倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，在121°C滅菌20分鐘，制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。所述的營(yíng)養(yǎng)液組成為(g/L):甘蔗糖蜜30，玉米漿15，脫脂奶粉10，硝酸鈉3，磷酸氫二鉀5，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升。所述的固體混合物由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其重量組成比例為甘蔗渣稻殼大豆餅為6:3:1. 5。將種子液按照15毫升/100克固態(tài)培養(yǎng)基的比例接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌?，然后在料層厚?厘米、濕度80%、發(fā)酵溫度35 °C下靜置發(fā)酵5天。(4)后處理獲得FFase取固體培養(yǎng)物10g，加入80毫升50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提7小時(shí)，過(guò)濾，濾液即為粗FFase酶液。按照檢測(cè)方法測(cè)得酶活為128. 36U/mL。上述參照實(shí)施例對(duì)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)FFase的方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說(shuō)明性的而不是限制性的，可根據(jù)所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體思想下的任何變化和修改，應(yīng)屬于本發(fā)明`的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種β-D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)孢子液的準(zhǔn)備首先制備試管斜面培養(yǎng)基，將黑曲霉接種到制備好的試管斜面培養(yǎng)基上，在25-32°C培養(yǎng)3 5天至長(zhǎng)出孢子，然后向斜面上加入生理鹽水洗滌菌絲體，獲得孢子液； (2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)制備液體種子培養(yǎng)基，按照體積比2% 5%的接種量將步驟(I)得到的孢子液接入液體種子培養(yǎng)基，于25 32°C、轉(zhuǎn)速180 220rpm的搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)2 4天,獲得種子液； (3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-D-呋喃果糖苷酶制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢杌旌希缓笤诹蠈雍穸菼 3厘米、濕度45% 80%、發(fā)酵溫度25-35°C下靜置發(fā)酵3 5天； (4)后處理獲得β-D-呋喃果糖苷酶取步驟(3)得到的固體培養(yǎng)物，加入其6-10倍重量的50毫摩爾pH 5. 5的檸檬酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)粉碎，再攪拌浸提至少4小時(shí)，經(jīng)過(guò)離心或過(guò)濾使固液分離，得到的上清液或?yàn)V液即為粗β -D-呋喃果糖苷酶酶液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種β-D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(3)中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法是將1. 5 3倍重量的營(yíng)養(yǎng)液均勻噴灑在固體混合物上，然后在121°C滅菌20分鐘即可，其中營(yíng)養(yǎng)液的組成以g/L計(jì)為，甘蔗糖蜜10 30，玉米漿5 15，脫脂奶粉3 10，硝酸鈉I 3，磷酸氫二鉀2 5，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升即可；固體混合物是由甘蔗渣、稻殼、大豆餅三者混合組成，其組成按照重量比為甘蔗渣稻殼大豆餅為3 6 :1 3 :0. 5 1.5。
3.如權(quán)利要求1所述的一種β-D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(I)中試管斜面培養(yǎng)基的組成以g/L計(jì)為，蔗糖30，硝酸鈉3，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂O.5，氯化鉀O. 5，硫酸亞鐵O. 01，瓊脂15，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升即可。
4.如權(quán)利要求1所述的一種β-D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(I)中黑曲霉為黑曲霉AS 3.877。
5.如權(quán)利要求1所述的一種β-D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法,其特征在于步驟(2)中液體種子培養(yǎng)基的組成以g/L計(jì)為，甘蔗糖蜜20，蛋白胨10，酵母膏5，硝酸鈉2，磷酸氫二鉀3，硫酸鎂O. 5，氯化鉀O. 5，這些物質(zhì)先溶于800毫升去離子水中，然后再定容到I升即可。
6.如權(quán)利要求1所述的一種β-D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法,其特征在于步驟(3)中種子液接入制備好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí),種子液的接種比例為5 15暈升/100克固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及β-D-呋喃果糖苷酶(β-D-fructofuranosidase,EC 3.1.2.26，簡(jiǎn)寫為FFase)的制備方法，尤其是一種β-D-呋喃果糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法。其特點(diǎn)是，包括如下步驟(1)孢子液的準(zhǔn)備；(2)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)；(3)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-D-呋喃果糖苷酶；(4)后處理獲得β-D-呋喃果糖苷酶。本發(fā)明方法克服了FFase液態(tài)發(fā)酵的缺點(diǎn)，提供一種FFase的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，用固態(tài)發(fā)酵的方法為低聚果糖的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)酶源。優(yōu)點(diǎn)是(1)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基以甘蔗渣、稻殼、大豆餅等為原料，原料價(jià)格低廉；(2)發(fā)酵周期短，工藝設(shè)備簡(jiǎn)單，降低成本，益于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/685GK103045561SQ20121054525
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者王雙平, 陳龍, 蘇二正 申請(qǐng)人:寧夏乙征生物工程有限公司