專利名稱：孤雌激活源性胚胎干細(xì)胞系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種孤雌激活源性胚胎干細(xì)胞系的建立方法，屬于胚胎干細(xì)胞系技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell)也稱ES細(xì)胞，是由發(fā)育5-7天囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞 在體外進(jìn)行傳代擴(kuò)增而得到的，具有無(wú)限增殖和多向分化潛能的特征。人類ES細(xì)胞可以在體 外誘導(dǎo)分化成為人體的各種細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床和科學(xué)研究。但由于ES細(xì)胞來(lái)源于胚 胎，在某些M家和地區(qū)受到宗教、道德和倫理的制約，大大限制了ES細(xì)胞的研究發(fā)展。
胚胎千細(xì)胞目前按來(lái)源分有三種正常胚胎來(lái)源(絕大多數(shù))、核移植來(lái)源和孤雌來(lái)源(只 要卵子激活，不需精子受精形成胚胎)。孤雌生殖是在無(wú)需精子的條件下，自發(fā)或經(jīng)物理、化 學(xué)刺激，使卵母細(xì)胞有絲分裂激活，而形成胚胎，并可繼續(xù)發(fā)育至成熟而產(chǎn)生后代，即無(wú)雄 性配子的任何作用，由雌性配子產(chǎn)生胚胎。最近有文獻(xiàn)報(bào)道,孤雌生殖的胚胎干細(xì)胞同樣具有 無(wú)限增殖和多向分化潛能，它與胚胎來(lái)源的ES細(xì)胞一樣，可在體外誘導(dǎo)分化成機(jī)體的各種細(xì) 胞。這樣一來(lái)，若能建立孤雌生殖胚胎干細(xì)胞系，就可避免胚胎來(lái)源的ES細(xì)胞導(dǎo)致的宗教、 道德、倫理上的爭(zhēng)議，為ES細(xì)胞的來(lái)源提供了一個(gè)新的途徑?，F(xiàn)有的孤雌激活源性胚胎干細(xì) 胞系的建立技術(shù)流程--般是促排卵——取卵——化學(xué)激活——胚胎培養(yǎng)一一分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì) 胞^~擴(kuò)增——傳代。記載孤雌激活源性胚胎干細(xì)胞系的建立情況的現(xiàn)有文獻(xiàn)有-
1. 1983年2月《胚胎實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)(J Embryol Exp Morphol)》雜志發(fā)表的《來(lái)自鼠單 倍體胚胎多能干細(xì)胞系的建立》(Establishment of pluripotential cell lines fromh即loid mouse e油ryos.),采用小鼠卵，用7%的酒精激活。
2. 2002年2月《科學(xué)(Science)》雜志發(fā)表的《非人靈長(zhǎng)類單性生殖干細(xì)胞系》 (Parthenogenetic stem cells in nonhuman primates.)雜志，采用猴子卵，激活是應(yīng)用
鈣離子載體A23187處理8分鐘和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)處理4小時(shí)。
3. 2007年2月《干細(xì)胞》(Stem Cells)雜志發(fā)表的《兔胚胎干細(xì)胞系的建立和鑒定》 (Generation and characterization of rabbit embryonic stem cells), 采用兔子卵。
4. 2003年21 (2)丄52-61《干細(xì)胞(Stem Cells)》雜志發(fā)表的《來(lái)源于二級(jí)卵母細(xì)胞 中期純合子的多能干細(xì)胞系》(Multilineage potential of homozygous stem cells derived from raetaphase II oocytes),采用小鼠卵，激活是應(yīng)用鈣離子載體A23187處理5分鐘和 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)處理3小時(shí)。
5. 2007年9(3):432-49《來(lái)源于人單性生殖囊胚的患者特異性干細(xì)胞系》 (Patient-specific stem cell lines derived from human parthenogenetic blastocysts). 《克隆干細(xì)胞(C]oning Stem Gelis)》雜志，采用人卵。
以上文獻(xiàn)均采用免疫外科法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，免疫反應(yīng)容易損傷內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，使其活力 下降，耗時(shí)長(zhǎng)，不利于保護(hù)細(xì)胞，囊胚率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有孤雌激活源性胚胎干細(xì)胞系建立技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種孤雌激活源 性胚胎干細(xì)胞系的建立方法。本發(fā)明的孤雌激活源性胚胎干細(xì)胞系的建立方法包括以下步驟
(1) 以孕馬血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性動(dòng)物體，進(jìn)行超促排卵；
(2) 取卵后應(yīng)用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對(duì)其進(jìn)行化學(xué)激活 以80u/ml透明質(zhì)酸酶消化半分鐘，先用人類輸卵管液(human tubalfluidmedium， HTF) 洗3遍，再置于含5umol/L鈣離子載體A23187的人類輸卵管液中，37。C避光放置5分鐘， 再以人類輸卵管液(HTF)洗滌3次后，置于含10wg/ral嘌呤霉素的HTF中，在37'C、 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)進(jìn)行激活處理，將激活發(fā)育的胚胎體外培養(yǎng)至囊胚；
(3)機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，在37'C溫臺(tái)、避光及保持濕潤(rùn)的條件下，以細(xì)針直接刺 破胚胎囊胚，將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)剝離出來(lái)，在鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)，建立穩(wěn) 定的動(dòng)物孤雌激活ES細(xì)胞系。
上述方法適用于各種動(dòng)物體的孤雌激活源性胚胎干細(xì)胞系的建立。
本發(fā)明的孤雌激活ES細(xì)胞與胚胎來(lái)源的ES細(xì)胞一樣，能夠在體外可被誘導(dǎo)分化為全身 各種組織細(xì)胞，激活處理的效果好，囊胚率可高達(dá)96.5%,高于現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，以針刺的 機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，避免了免疫反應(yīng)對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的損傷，而且耗時(shí)短，減少細(xì)胞 在培養(yǎng)箱外的暴露時(shí)間，最大程度的保護(hù)了細(xì)胞。本發(fā)明不但避免因破壞胚胎所帶來(lái)的各種 倫理問(wèn)題，還能解決胚胎來(lái)源ES細(xì)胞應(yīng)用中的免疫原性問(wèn)題，拓展了 ES細(xì)胞的來(lái)源和研究 范疇。


圖丄是雌性昆明小鼠的卵母細(xì)胞圖。 圖2是激活發(fā)育的昆明小鼠2細(xì)胞胚胎圖。 圖3是激活發(fā)育的昆明小鼠4細(xì)胞胚胎圖。 圖4是胚胎體外培養(yǎng)的囊胚圖。 圖5是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞圖。
圖6是雌性昆明小鼠第37代孤雌胚胎干細(xì)胞(PGES)圖。 圖7是PGES表達(dá)特異性指標(biāo)SSEA-4圖。 圖8是P(;ES表達(dá)特異性指標(biāo)oct-4圖。 圖9是PGES細(xì)胞的純和性鑒定圖。 圖IO是PGES細(xì)胞的染色體鑒定(40， XX)圖。 圖11是PGES細(xì)胞的體外分化擬胚體圖。 圖12是PGES細(xì)胞的體外分化血管樣結(jié)構(gòu)圖。 圖13是PGES細(xì)胞的體內(nèi)分化肌肉組織圖。 圖14是PGES細(xì)胞的體內(nèi)分化原始神經(jīng)細(xì)胞圖。 圖15是PGES細(xì)胞的體內(nèi)分化腺上皮細(xì)胞圖。
具體實(shí)施例方式
以昆明小鼠為例，本發(fā)明的孤雌激活源性胚胎干細(xì)胞系的建立技術(shù)流程是雌性昆明小 鼠超促排卵~"^取卵——應(yīng)用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對(duì)其進(jìn)行 化學(xué)激活——機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞一一將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞置于事先鋪好飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)
皿中——擴(kuò)增_一-傳代——鑒定。具體步驟如下。1. 以孕馬血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性昆明小鼠，進(jìn)行超促排卵，雌性昆明小鼠 的卵母細(xì)胞如圖1.所示。
2. 取卵后應(yīng)用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對(duì)其進(jìn)行化學(xué)激活 以80u/ml透明質(zhì)酸酶消化半分鐘，先用人類輸卵管液(human tubalfluidmedium， HTF) 洗3遍，再置于含5"mo1/L鈣離子載體A23187的人類輸卵管液中，37'C避光放置5分鐘。 再以HTF洗滌3次后，置于含lOu g/ml嘌呤霉素的HTF中，在37。C、 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4小時(shí)進(jìn)行激活處理。激活發(fā)育的2細(xì)胞昆明小鼠胚胎如圖2所示，激活發(fā)育的昆明小鼠的4 細(xì)胞胚胎如圖3所示。
再以胚胎培養(yǎng)液G1(瑞典的vitrolife公司)進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，胚胎分裂為8細(xì)胞后換液， 以G2(同前)繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段。激活發(fā)育的胚胎體外培養(yǎng)的囊胚如圖4所示，上述方法培 養(yǎng)的囊胚率為96.5%,高于現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道。
3. 將激活發(fā)育的胚胎體外培養(yǎng)至囊胚后，以機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞如 圖5所示)，就是在37"C溫臺(tái)、避光及保持濕潤(rùn)的條件下，以中醫(yī)所用針灸的細(xì)針直接刺破 胚胎，將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)剝離出來(lái)。
4. 在鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞(昆明小鼠胚胎的成纖維細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素處理后停止增殖，即不 消耗培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分，只分泌利于干細(xì)胞生長(zhǎng)的各種因子)的培養(yǎng)皿中傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)， 建立穩(wěn)定的小鼠孤雌激活ES細(xì)胞系。
圖6給出了昆明小鼠第37代孤雌胚胎干細(xì)胞(PGES)。圖7給出了昆明小鼠第37代PGES 的表達(dá)特異性指標(biāo)SSEA-4，圖8給出了 PGES表達(dá)特異性指標(biāo)oct-4，圖7和圖8的胚胎干細(xì) 胞特異性指標(biāo)的表達(dá)，證明該細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。圖9給出了PGES細(xì)胞的純和性鑒定，證明 是孤雌激活來(lái)源的。圖IO給出了 PGES細(xì)胞的染色體鑒定(40， XX)。圖11給出了PGES細(xì) 胞體外分化的擬胚體，圖12給出了 PGES細(xì)胞體外分化的血管樣結(jié)構(gòu)圖。
PGES細(xì)胞體內(nèi)分化，即將細(xì)胞打到裸鼠皮下，形成畸胎瘤，病理切片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)包含3個(gè) 胚層的組織，證明PGES細(xì)胞的多向分化潛能。圖13給出了 PGES細(xì)胞體內(nèi)分化的肌肉組織， 圖14給出了 PGES細(xì)胞體內(nèi)分化的原始神經(jīng)細(xì)胞圖，圖15給出了 PGES細(xì)胞體內(nèi)分化的腺上 皮細(xì)胞。
權(quán)利要求
1. 一種孤雌激活源性胚胎干細(xì)胞系的建立方法，其特征是包括以下步驟(1)以孕馬血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性動(dòng)物體，進(jìn)行超促排卵；(2)取卵后應(yīng)用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對(duì)其進(jìn)行化學(xué)激活以80μ/ml透明質(zhì)酸酶消化半分鐘，先用人類輸卵管液(human tubalfluidmedium，HTF)洗3遍，再置于含5μmol/L鈣離子載體A23187的人類輸卵管液中，37℃避光放置5分鐘，再以人類輸卵管液(HTF)洗滌3次后，置于含10μg/ml嘌呤霉素的HTF中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)進(jìn)行激活處理，將激活發(fā)育的胚胎體外培養(yǎng)至囊胚；(3)機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，在37℃溫臺(tái)、避光及保持濕潤(rùn)的條件下，以細(xì)針直接刺破胚胎囊胚，將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)剝離出來(lái)，在鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的動(dòng)物孤雌激活ES細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種孤雌激活源性胚胎干細(xì)胞系的建立方法，包括以下步驟以孕馬血清促性腺激素(PMSG)作用于雌性動(dòng)物體，進(jìn)行超促排卵；取卵后應(yīng)用鈣離子載體A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)對(duì)其進(jìn)行化學(xué)激活，將激活發(fā)育的胚胎體外培養(yǎng)至囊胚；機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，以細(xì)針直接刺破胚胎囊胚，將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)剝離出來(lái)，在鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的動(dòng)物孤雌激活ES細(xì)胞系。本發(fā)明激活處理的效果好，囊胚率可高達(dá)96.5％，以針刺的機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，避免了免疫反應(yīng)對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的損傷，而且耗時(shí)短，減少細(xì)胞在培養(yǎng)箱外的暴露時(shí)間，最大程度的保護(hù)了細(xì)胞，解決了胚胎來(lái)源ES細(xì)胞應(yīng)用中的免疫原性問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101429493SQ20081023833
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者晴 宦, 凱 徐, 彥 王, 錢德儉, 陳子江, 多 韋, 選 高 申請(qǐng)人:彥 王