專利名稱：密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的一種分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，特別涉及一種采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs),又稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，是存在于骨髓中非造血干細(xì)胞的另一種干細(xì)胞。自1968年Friendenstein利用BMSCs的粘附性特點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行分離、培養(yǎng)，及多分化潛能研究以來，BMSCs已成為現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)普遍認(rèn)為BMSCs是中胚層發(fā)育的旱期細(xì)胞，具有多向分化潛能，不僅能分化為造血實(shí)質(zhì)，支持造血，還可分化為多種造血以外的組織細(xì)胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)條件控制下能分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺細(xì)胞等。在多種疾病的細(xì)胞治療 和基因治療中有很好的應(yīng)用前景。由于骨髓中BMSCs的含量極低，僅占骨髓有核細(xì)胞的O. 001% -O. 01%，并隨年齡的增加逐漸減少，無法滿足作為細(xì)胞治療或組織工程種子細(xì)胞所需的細(xì)胞量，因此有必要建立一種在體外分離、純化并大量擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化BMSCs的方法。目前BMSCs分離的方法主要有貼壁分離篩選法、流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠分離法。貼壁分離篩選法是根據(jù)BMSCs貼壁生長(zhǎng)而造血系細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的特性對(duì)二者進(jìn)行分離，但所得細(xì)胞成分復(fù)雜，BMSCs獲取率較低；流式細(xì)胞儀分離和免疫磁珠分離法法實(shí)驗(yàn)條件要求較高，且需要的骨髓量大，然而在實(shí)際操作中每一部位每次抽取的骨髓量一般不應(yīng)超過2ml，因此不能滿足流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)需要的骨髓量。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述問題，本發(fā)明的目的在于建立一種在體外分離、純化并大量擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化BMSCs的方法。為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用一種密度梯度離心法，用密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液來分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs，經(jīng)過梯度離心后，將大部分紅細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血小板等去除，獲得相對(duì)較高純度的BMSCs細(xì)胞。再根據(jù)BMSCs貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)，培養(yǎng)2_3d后可見BMSCs基本貼壁，因此在原代培養(yǎng)末期即可以獲得均一性較好的BMSCs。具體的，本發(fā)明的密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs的方法包括如下步驟=BMSCs的分離，BMSCs的原代培養(yǎng)，BMSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，培養(yǎng)細(xì)胞表面抗原檢測(cè)以及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。其中，所述BMSCs的分離步驟包括骨髓收集并在無菌條件下進(jìn)行肝素抗凝收集的骨髓懸液，D-Hanks液稀釋，在離心管加入Ficoll分離液，稀釋后的骨髓懸液緩慢加在Ficoll分離液上，1800轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集富含有核細(xì)胞的界面層細(xì)胞，D-Hanks液清洗，調(diào)整細(xì)胞濃度為^^/!^，接種于的培養(yǎng)瓶’在〗？！^1^ CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)。
所述BMSCs的原代培養(yǎng)步驟包括培養(yǎng)72小時(shí)后全量換液，之后每2天換一次液；細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%融合后，吸出培養(yǎng)基，D-Hanks液洗一遍培養(yǎng)瓶；然后用O. 25%的胰蛋白酶消化3-5分鐘，待細(xì)胞回縮折光性增強(qiáng)以致有細(xì)胞浮起時(shí)加入含血清培養(yǎng)基終止，移液管反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底，吸出懸液后離心收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞在換液時(shí)被去除。所述BMSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增步驟包括調(diào)整細(xì)胞濃度，以1: 3的比例傳代培養(yǎng)，之后每2天換液一次，直至再次傳代。所述培養(yǎng)細(xì)胞表面抗原檢測(cè)步驟包括取培養(yǎng)第2或第3代細(xì)胞，首先用O. 25%的胰蛋白酶消化后，然后用含I %小牛血清白蛋白的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至I X 10Vml，然后加入鼠抗人單克隆抗體，置4°C孵育半小時(shí)，PBS清洗后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。所述生長(zhǎng)曲線的測(cè)定步驟包括分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代、第3代、第15代培養(yǎng)細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，按I X 104/ml接種于24孔板，每孔加入Iml培養(yǎng)基，以后每天隨機(jī) 取3個(gè)孔，消化后計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，持續(xù)計(jì)數(shù)8天，繪制出各代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。優(yōu)選的，所述BMSCs的分離步驟中培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基為DMEM-LG+1 %Penicillin-Streptomycin+5ng/ml bFGF+10% FBS0再優(yōu)選的，所述DMEM-LG的pH值調(diào)為7. 2 ;所述FBS胎牛血清終濃度為IOOmL/L-150mL/L。再優(yōu)選的，所述BMSCs的原代培養(yǎng)步驟中在用胰蛋白酶消化傳代時(shí)，先用PBS洗滌除去殘留的血清；胰蛋白酶的濃度為2. 5mL/L，消化時(shí)間為3-5分鐘。本發(fā)明把密度梯度離心、貼壁培養(yǎng)和消化時(shí)間控制相結(jié)合，具有操作簡(jiǎn)單，快速，實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，不失為一種較為有效的分離純化方法。


通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法步驟流程圖。
具體實(shí)施例方式具體的，如圖1所示的本發(fā)明的一實(shí)施例的密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法步驟流程圖，所述方法具體包括以下步驟SUBMSCs 的分離骨髓來源于人髖關(guān)節(jié)手術(shù)時(shí)的松質(zhì)骨碎片或髂骨游離移植術(shù)時(shí)收集。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行，肝素抗凝收集的骨髓懸液，D-Hanks液稀釋(體積比1: 1)，取15ml離心管加入5ml Ficoll分離液(淋巴細(xì)胞分離液)，IOml稀釋后骨髓懸液緩慢加在Ficoll分離液上，1800轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集富含有核細(xì)胞的界面層細(xì)胞，D-Hanks液清洗I遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為lX105/ml，接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基為DMEM-LG+1 %Penicillin-Streptomycin(青鏈霉素雙抗溶液)+5ng/ml bFGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)+10% FBS(胎牛血清)，在37°C、5% CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)。S2、BMSCs的原代培養(yǎng)
培養(yǎng)72小時(shí)后全量換液，之后每2天換一次液。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70 %融合后，吸出培養(yǎng)基，D-Hanks液洗一遍培養(yǎng)瓶；然后用O. 25%的胰蛋白酶消化3_5分鐘，待細(xì)胞回縮折光性增強(qiáng)以致有細(xì)胞浮起時(shí)加入含血清培養(yǎng)基終止，移液管反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底，吸出懸液后離心收集細(xì)胞。骨髓分離的細(xì)胞接種24小時(shí)后便有少量的細(xì)胞貼壁，原代接種的BMSCs呈圓形，體積較大，胞體透亮，折光性強(qiáng)，細(xì)胞核成卵圓形，與周圍一些血細(xì)胞相互混雜。接種24小時(shí)后開始出現(xiàn)少部分細(xì)胞開始伸展開貼壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞呈梭形、三角形和多角形，48小時(shí)后貼壁細(xì)胞增多，72小時(shí)后貼壁細(xì)胞呈克隆性生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)大多數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形；經(jīng)I周后逐漸形成扁平單層細(xì)胞，呈漩渦狀生長(zhǎng)或成簇生長(zhǎng)，隨著細(xì)胞密度的增加，胞體變得細(xì)長(zhǎng)，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞；2周時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)可達(dá)90%融合，細(xì)胞為大梭形，排列緊密并有一定的方向性，呈成纖維細(xì)胞樣分布。懸浮細(xì)胞在換液時(shí)被去除。S3、BMSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增 調(diào)整細(xì)胞濃度，以1: 3的比例傳代培養(yǎng)，之后每2天換液一次，直至再次傳代。剛開始傳代細(xì)胞為圓形，胞體大而透亮，折光性好；接種3 4小時(shí)后迅速貼壁、伸展、展開成梭形；12小時(shí)活細(xì)胞基本完全貼壁，細(xì)胞均勻生長(zhǎng)，不再形成克隆樣生長(zhǎng)；第2 3天迅速增殖，細(xì)胞形態(tài)更加單一呈長(zhǎng)梭形；第3 4天即可生長(zhǎng)融合，長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞排列仍有規(guī)則的方向性；第一代至第十五代貼壁和生長(zhǎng)速度以及細(xì)胞形態(tài)均未見明顯區(qū)別。培養(yǎng)過程中需要注意到以下幾環(huán)節(jié)l)BMSCs體外培養(yǎng)一般選用低糖DMEM，其pH值調(diào)定在7. 2為宜，過高或過低的pH值均影響細(xì)胞的生長(zhǎng)；2)FBS (胎牛血清)終濃度為100mL/L-150mL/L為宜。10%的胎牛血清最有利于BMSCs的培養(yǎng)，濃度過高時(shí)，血清中含有大量促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的因子，容易使細(xì)胞過早出現(xiàn)老化，血清濃度過低，由于缺乏生長(zhǎng)因子的刺激，細(xì)胞的增殖減慢。氧濃度對(duì)BMSCs的培養(yǎng)也有一定影響，我們?cè)?5%空氣、5%CO2為對(duì)照組和5% O2,5% CO2,90% N2為實(shí)驗(yàn)組兩種條件下進(jìn)行BMSCs培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的BMSCs貼壁率及存活力提高，克隆數(shù)明顯高于對(duì)照組，因此認(rèn)為氧濃度低于20%更有利于細(xì)胞功能的存留；3)用胰蛋白酶消化傳代時(shí)，可先用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌2次，以除去殘留的血清，提高消化效能，還應(yīng)嚴(yán)格掌握胰蛋白酶的濃度和消化時(shí)間，以2. 5mL/L胰蛋白酶消化3-5min為宜；4)BMSCs生長(zhǎng)時(shí)群體依賴性強(qiáng)，所以傳代時(shí)應(yīng)注意細(xì)胞種植密度，一般當(dāng)細(xì)胞匯合后以1: 3的比例傳代，才能保證傳代后的細(xì)胞增殖較快。BMSCs在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)與其它細(xì)胞一樣，經(jīng)歷生長(zhǎng)潛伏期、對(duì)數(shù)增殖期和生長(zhǎng)平臺(tái)期。對(duì)細(xì)胞周期的研究顯示只有10%的BMSCs復(fù)制活躍，而大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期，高比例的G0/G1期細(xì)胞提示BMSCs具有高度的分化潛能。本發(fā)明對(duì)常規(guī)培養(yǎng)條件下不同MSCs的生長(zhǎng)增殖進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)成人BMSCs可以在體外分裂38次±4次，并且保持紡錘形態(tài)和成骨潛能直至細(xì)胞衰竭。細(xì)胞進(jìn)行冷凍復(fù)蘇后培養(yǎng)可傳代達(dá)15次，細(xì)胞的增殖分化潛能未受影響。BMSCs具有異質(zhì)性，是由未定型BMSCs和定型BMSCs組成。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著BMSCs的逐漸被純化，各代細(xì)胞倍增速度基本穩(wěn)定，如15代的生長(zhǎng)曲線，未見細(xì)胞有明顯衰老征象。BMSCs的體外擴(kuò)增與種植密度關(guān)系密切，由于細(xì)胞極低密度接種培養(yǎng)時(shí)獲取大量細(xì)胞的時(shí)間會(huì)很長(zhǎng)，所以調(diào)整細(xì)胞接種濃度，在盡可能短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的細(xì)胞尤為重要。本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)時(shí)采用的細(xì)胞濃度為I X 105/ml，經(jīng)驗(yàn)證是一種較為合適的接種濃度。由于取材以及分離方法的不同，此濃度隨情況的改變應(yīng)作出調(diào)整。
S4、培養(yǎng)細(xì)胞表面抗原檢測(cè)取培養(yǎng)第2或第3代細(xì)胞，首先用0. 25%的胰蛋白酶消化后，然后用含1%小牛血清白蛋白的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml。分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、HLA-DR-FITC，置 4°C孵育半小時(shí)，PBS洗I次，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，BMSCs表達(dá)CD29、CD44 和 CD105，不表達(dá) CD34、CD45、CD19、HLA-DR 和 CD106。S5、生長(zhǎng)曲線的測(cè)定分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代、第3代、第15代培養(yǎng)細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，按1× 104/ml接種于24孔板，每孔加入1ml培養(yǎng)基，以后每天隨機(jī)取3個(gè)孔，消化后計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，持續(xù)計(jì)數(shù)8天(原代連續(xù)計(jì)數(shù)16天)，繪制出各代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。BMSCs的原代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線顯示，細(xì)胞在接種后的2 8天為生長(zhǎng)的潛伏期，細(xì)胞逐漸開始出現(xiàn)貼壁，無明顯擴(kuò)增；8天以后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞增殖活躍，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞突起向周圍伸展，出現(xiàn)兩個(gè)核細(xì)胞分裂相的BMSCs多見，細(xì)胞密度增大，彼此相連；11 14天，生長(zhǎng)曲線逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，BMSCs鋪滿瓶底，細(xì)胞擴(kuò)增趨緩，原代培養(yǎng)結(jié)束。BMSCs傳代后3代和15代的生長(zhǎng)曲線顯示，傳代后6 12小時(shí)，相差顯微鏡下即可觀察到細(xì)胞貼壁，2 4天后，細(xì)胞進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，擴(kuò)增速度明顯快于原代培養(yǎng)；6 7天，即可鋪滿培養(yǎng)板底。在3代以前，細(xì)胞擴(kuò)增速度略慢于4代以后，隨著BMSCs的逐漸被純化，各代細(xì)胞倍增速度基本穩(wěn)定，如15代的生長(zhǎng)曲線，未見細(xì)胞有明顯衰老征象。本發(fā)明提供了一種密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，在實(shí)驗(yàn)的同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，盡管使用了密度梯度分離法，在原代培養(yǎng)體系中仍然存在一些造血系細(xì)胞，但是這些細(xì)胞由于大部分不能貼壁，所以隨換液而被去除。BMSCs具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，體積小，呈梭形，核漿比大，體外增殖迅速，生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，而且隨著換液次數(shù)和傳代次數(shù)的不斷增加，細(xì)胞純度不斷增加，均質(zhì)性不斷提高，細(xì)胞呈均勻有序的成纖維細(xì)胞樣，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖速度未見明顯下降，細(xì)胞的均一性經(jīng)過傳代培養(yǎng)明顯提聞。本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括如下步驟=BMSCs的分離，BMSCs的原代培養(yǎng)，BMSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，培養(yǎng)細(xì)胞表面抗原檢測(cè)以及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定；其中， 所述BMSCs的分離步驟包括骨髓收集并在無菌條件下進(jìn)行肝素抗凝收集的骨髓懸液，D-Hanks液稀釋，在離心管加入Ficoll分離液，稀釋后的骨髓懸液緩慢加在Ficoll分離液上，1800轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集富含有核細(xì)胞的界面層細(xì)胞，D-Hanks液清洗，調(diào)整細(xì)胞濃度為1父105/1111，接種于的培養(yǎng)瓶，在371、5(% CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)； 所述BMSCs的原代培養(yǎng)步驟包括培養(yǎng)72小時(shí)后全量換液，之后每2天換一次液；細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%融合后，吸出培養(yǎng)基，D-Hanks液洗一遍培養(yǎng)瓶；然后用O. 25%的胰蛋白酶消化3-5分鐘，待細(xì)胞回縮折光性增強(qiáng)以致有細(xì)胞浮起時(shí)加入含血清培養(yǎng)基終止，移液管反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底，吸出懸液后離心收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞在換液時(shí)被去除； 所述BMSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增步驟包括調(diào)整細(xì)胞濃度，以1: 3的比例傳代培養(yǎng)，之后每2天換液一次，直至再次傳代； 所述培養(yǎng)細(xì)胞表面抗原檢測(cè)步驟包括取培養(yǎng)第2或第3代細(xì)胞，首先用O. 25%的胰蛋白酶消化后，然后用含1%小牛血清白蛋白的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至lXlOVml，然后加入鼠抗人單克隆抗體，置4°C孵育半小時(shí)，PBS清洗后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析；以及 所述生長(zhǎng)曲線的測(cè)定步驟包括分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代、第3代、第15代培養(yǎng)細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，按I X 104/ml接種于24孔板，每孔加入Iml培養(yǎng)基，以后每天隨機(jī)取3個(gè)孔，消化后計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，持續(xù)計(jì)數(shù)8天，繪制出各代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
2.如權(quán)利要求1所述的密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述BMSCs的分離步驟中培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基為DMEM-LG+1 %Penicillin-Streptomycin+5ng/ml bFGF+10% FBS0
3.如權(quán)利要求2所述的密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述DMEM-LG的pH值為7. 2，所述FBS胎牛血清終濃度為100mL/L-150mL/L。
4.如權(quán)利要求1所述的密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述BMSCs的原代培養(yǎng)步驟中在用胰蛋白酶消化傳代時(shí)，先用PBS洗滌除去殘留的血清；胰蛋白酶的濃度為2. 5mL/L，消化時(shí)間為3-5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的方法，其包括如下步驟BMSCs的分離，BMSCs的原代培養(yǎng)，BMSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，培養(yǎng)細(xì)胞表面抗原檢測(cè)以及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。本發(fā)明采用的密度梯度離心法，用密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液來分離BMSCs，經(jīng)過梯度離心后，將大部分紅細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血小板等去除，獲得相對(duì)較高純度的BMSCs細(xì)胞，再根據(jù)BMSCs貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)，培養(yǎng)2-3天后可見BMSCs基本貼壁，因此在原代培養(yǎng)末期即可以獲得均一性較好的BMSCs。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單，快速實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，是一種較為有效的分離純化BMSCs的方法。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK103013912SQ20121050542
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者陸華 申請(qǐng)人:陸華