一種培養(yǎng)基質(zhì)及其應用與培養(yǎng)牙髓干細胞的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明設及干細胞培養(yǎng)領域，尤其設及一種培養(yǎng)基質(zhì)及其應用與培養(yǎng)牙髓干細胞 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙髓干細胞（dentalpulpstemcells,DPSCs)是存在于牙齒牙髓組織中的一類 具有自我更新、增殖能力強，及多向分化能力的間充質(zhì)干細胞。對牙髓干細胞的研究顯示， 牙髓干細胞可應用于牙髓再生、牙本質(zhì)再生、骨骼再生、神經(jīng)細胞再生、屯、肌和血管再生等。 牙髓干細胞的應用于牙科診療，可W促進牙本質(zhì)再生，從單一牙齒分離獲取大量的牙髓干 細胞可W應用牙科進行大量的牙齒修復。有數(shù)據(jù)顯示，體外培養(yǎng)的牙髓干細胞，無論是細胞 增殖能力還是克隆形成率都要強于骨髓來源的間充質(zhì)干細胞。
[0003] 在牙髓干細胞臨床應用過程中，目前突出的問題是一次成功的治療需要一定數(shù)量 的細胞，運意味著如何在短時間內(nèi)獲得大量有效高活性的細胞W提供給病人使用是一個很 關鍵的問題。因此，體外大量擴增牙髓干細胞的研究越來越受到研究人員和臨床醫(yī)生的重 視。
[0004] 現(xiàn)有的對DPSCs擴增培養(yǎng)方法大多添加胎牛血清，但臨床使用含動物源的培養(yǎng)基 不僅會引起免疫排斥反應，異源病毒感染，而且采用運種培養(yǎng)基培養(yǎng)的牙髓干細胞，生長比 較緩慢，在傳代超5次之后其干細胞特性會大大降低。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種培養(yǎng)基質(zhì)及其應用與培養(yǎng)牙髓 干細胞的方法。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基質(zhì)能夠維持DPSCs在傳代過程中的穩(wěn)定性。
[0006] 本發(fā)明提供的Ξ維培養(yǎng)基質(zhì)，包括I型膠原水凝膠和培養(yǎng)液；培養(yǎng)液中包括基礎 培養(yǎng)液、bFGF和BMP-2。
[0007] 在本發(fā)明的實施例中，培養(yǎng)液中bFGF和BMP-2的質(zhì)量比為（8~12) : (8~12)。
[0008] 在一些實施例中，培養(yǎng)液中bFGF和BMP-2的質(zhì)量比為1 :1。
[0009] 在本發(fā)明的實施例中，培養(yǎng)液中bFGF的濃度為lOng/mL;BMP-2的濃度為long/ mL；
[0010] 本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中添加bFGF和BMP-2因子，其中，堿性成纖維細胞生長因子 化FGF)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2度MP-2)是促進骨形成和誘導成骨細胞分化的的信號因子，研 究表明，BMP-2在牙髓Ξ維培養(yǎng)中發(fā)揮著重要的作用。 W11] 在本發(fā)明的實施例中，I型膠原水凝膠中I型膠原的濃度為5mg/mL~15mg/mL。
[0012] 在一些實施例中，I型膠原水凝膠中I型膠原的濃度為5mg/血。
[0013] 在本發(fā)明的實施例中，I型膠原水凝膠的網(wǎng)孔直徑為40μπι~70μπι。
[0014] I型膠原是支持細胞核組織生長的重要外基質(zhì)蛋白，本發(fā)明WI型膠原水凝膠作 為載體，使細胞能夠在I型膠原水凝膠提供的的Ξ維立體空間結(jié)構(gòu)中與膠原蛋白的充分接 觸，保證了細胞間信息信號的傳遞，使得牙髓干細胞更容易在膠原凝膠內(nèi)的分裂增殖。由于 載體創(chuàng)建的細胞生長環(huán)境能夠最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境，因此細胞的生長更加健康。本發(fā) 明所采用的I型膠原可為市場購得，也可自行提取獲得，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。
[0015] 本發(fā)明所采用的I型膠原水凝膠的制備方法為：將I型膠原溶解后-80°c靜置化 后，冷凍干燥制得I型膠原水凝膠。
[0016] 在一些實施例中，冷凍干燥的時間為16h。
[0017] I型膠原溶解具體為：將I型膠原W乙酸溶液溶解后，于4°C下調(diào)節(jié)抑值為7. 2。 陽01引在一些實施例中，乙酸溶液中乙酸的濃度為lOmmol/L。
[0019] 在一些實施例中，調(diào)節(jié)抑采用1M的化OH溶液。
[0020] W本發(fā)明提供的方法制備的I型膠原載體的網(wǎng)孔直徑為40μm~70μm，孔隙均勻 呈絲狀交織，保持良好的Ξ維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。
[0021] 在本發(fā)明的實施例中，基礎培養(yǎng)液包括DMEM/F12無血清培養(yǎng)液和血清替代物。 陽022] 基礎培養(yǎng)液中，血清替代物的體積分數(shù)為5 %。
[0023]本發(fā)明提供的Ξ維培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)液，避免了異源病毒感染 或免疫排斥反應。且DMEM/F12培養(yǎng)液營養(yǎng)全面，適宜牙髓干細胞的培養(yǎng)。
[0024] 本發(fā)明提供的培養(yǎng)基質(zhì)中WI型膠原水凝膠作為載體，WbFGF和BMP-2維持牙髓 干細胞的穩(wěn)定性，實驗表明，經(jīng)6天培養(yǎng)，DPSCs細胞的增殖穩(wěn)定且保持良好的活力，細胞數(shù) 目擴大4倍。經(jīng)免疫細胞化學染色，培養(yǎng)6天后的細胞干性維持良好，且具有較強的增殖能 力。
[0025] 本發(fā)明提供的Ξ維培養(yǎng)基在牙髓干細胞傳代培養(yǎng)中的應用。
[00%] 本發(fā)明還提供了一種牙髓干細胞的培養(yǎng)方法，包括：將原代培養(yǎng)的牙髓干細胞W 本發(fā)明提供的Ξ維培養(yǎng)基質(zhì)傳代培養(yǎng)。
[0027] 在本發(fā)明的實施例中，傳代培養(yǎng)具體為將牙髓干細胞接種于I型膠原水凝膠后， 置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)；培養(yǎng)液中包括基礎培養(yǎng)液、bFGF和BMP-2。 陽02引在本發(fā)明的實施例中，接種的密度為1X1〇8個/mL。
[0029] 在本發(fā)明的實施例中，傳代培養(yǎng)的條件為5%C02、37°C、濕度95%。
[0030] 在本發(fā)明的實施例中，傳代培養(yǎng)的時間為7d。
[0031] 在本發(fā)明的實施例中，原代培養(yǎng)具體為：將牙髓組織經(jīng)I型膠原酶消化后W原代 培養(yǎng)液培養(yǎng)至細胞80 %~90 %匯合；所述原代培養(yǎng)液中包括基礎培養(yǎng)液、bFGF和EGF。
[0032] 在本發(fā)明的實施例中，I型膠原酶的質(zhì)量分數(shù)為0.1 %~0.25%。
[003引在本發(fā)明的實施例中，經(jīng)I型膠原酶消化后，細胞經(jīng)70μm細胞篩過濾。
[0034] 現(xiàn)有技術(shù)中，對牙髓干細胞的原代培養(yǎng)采用含有胎牛血清的液體培養(yǎng)基。然而，含 有胎牛血清的培養(yǎng)液不僅易引起免疫反應且提高病毒感染的風險，其培養(yǎng)原代細胞的效果 也不佳，所得細胞的數(shù)量較低。 陽03引在本發(fā)明的實施例中，原代培養(yǎng)液中bFGF和EGF的質(zhì)量比為（8~12) : (8~12)。
[0036] 在本發(fā)明的實施例中，原代培養(yǎng)液中bFGF和EGF的質(zhì)量比1:1。
[0037] 在本發(fā)明的實施例中，原代培養(yǎng)液中bFGF的濃度為lOng/mL;EGF的濃度為long/ mLo 陽03引在本發(fā)明的實施例中，原代培養(yǎng)的條件為5%C02、37°C、濕度95%。
[0039] 在本發(fā)明的實施例中，原代培養(yǎng)每3天換液一次。 W40] 在本發(fā)明的實施例中，當原代培養(yǎng)的細胞80%~90%回合后，W膜蛋白酶消化 后，傳代培養(yǎng)。
[0041]本發(fā)明提供的提供一種培養(yǎng)基質(zhì)及其應用與培養(yǎng)牙髓干細胞的方法。本發(fā)明提供 的Ξ維培養(yǎng)基質(zhì)中WI型膠原水凝膠作為載體，WbFGF和BMP-2維持牙髓干細胞的穩(wěn)定 性，經(jīng)6天培養(yǎng)，DPSCs細胞的增殖穩(wěn)定且保持良好的活力，細胞數(shù)目擴大4倍。經(jīng)免疫細 胞化學染色，培養(yǎng)6天后的細胞干性維持良好，且具有較強的增殖能力。并且，本發(fā)明采用 EGF和bFGF對牙髓干細胞進行原代培養(yǎng)，使原代細胞活性得到提高。
【附圖說明】 陽0創(chuàng)圖1示濃度為5mg/mL的I型膠原水凝膠電鏡觀察效果（100X);
[0043] 圖2示實施例3培養(yǎng)細胞的免疫細胞化學染色檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0044] 本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基質(zhì)及其應用與培養(yǎng)牙髓干細胞的方法，本領域技術(shù)人員 可W借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對 本領域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已 經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本 文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。 W45] 本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0046] 其中，I型膠原購自sigma,其為鼠尾膠原蛋白I型。
[0047] 血清替代物購自肥LI0S。
[0048] 本發(fā)明提供的I型膠原蛋白水凝膠的制備方法為： W例步驟1 : W lOmmol/L乙酸溶液溶解I型膠原蛋白（濃度為5mg/血~15mg/血）后， 于4°C下用Imol/L化0H溶液調(diào)節(jié)抑值至7. 2 ;
[0050] 步驟2:瞬時離屯、脫泡后W100μ L/孔的體積接種到預先冷卻的96孔板內(nèi)，-80°c 靜置化后凍干16h。
[0051] 制得的濃度