線粒體dna拷貝數(shù)變異性的檢測裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可檢測線粒體DNA拷貝數(shù)變異性、 進(jìn)而應(yīng)用于癌癥早期診斷篩查的裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是惡性腫瘤的統(tǒng)稱，癌細(xì)胞的特點是無限制、無止境地增生，使患者體內(nèi)的營 養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗；癌細(xì)胞釋放出多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀；癌細(xì)胞還可轉(zhuǎn)移到 全身各處生長繁殖，導(dǎo)致人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱，最終還可破壞組織、器官的 結(jié)構(gòu)和功能，引起壞死出血合并感染，患者最終由于器官功能衰竭而死亡。
[0003]目前雖然已出現(xiàn)了通過檢測基因的突變位點，用來指導(dǎo)用藥以及作為癌癥早篩的 標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法主要的應(yīng)用是發(fā)現(xiàn)癌癥病人中腫瘤組織的突變情況，以便進(jìn)行個性化治 療；但不同癌癥病人基因突變位點不一樣，突變的頻率也有差異，很難確定癌癥的判別標(biāo) 準(zhǔn)，所以使用這個技術(shù)用于癌癥的篩查特異性和準(zhǔn)確率不高。
[0004] 人體血液中存在大量游離的DNA(cfDNA，cellfreeDNA)，它們主要來自體細(xì)胞 的凋亡、壞死或主動釋放。目前已知癌癥病人的cfDNA含量顯著高于正常人，平均約為正 常人的三倍以上。癌癥病人的cfDNA中有一部分來自于腫瘤組織，這部分DNA也被成為 ctDNA(circulatingtumorDNA)，在癌癥發(fā)展的早期就能檢測到。線粒體DNA(chrM)在頭頸 部腫瘤、結(jié)直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌以及食管鱗癌中表現(xiàn)為升高，而在胃癌、 乳腺癌、Ewing's肉瘤、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌中則表現(xiàn)為拷貝數(shù)降低。更為 重要的是，線粒體DNA含量的變化還與某些腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切 相關(guān)。目前已報道的對于線粒體DNA的定量PCR技術(shù)存在以下不足之處：（1)只截取chrM 的一段作為chrM整體的指標(biāo)，隨機(jī)誤差大；（2)只能作為獨立指標(biāo)，無法和樣品內(nèi)其他DNA 含量進(jìn)行對照分析；（3)采用模型擬合的方法進(jìn)行定量，影響因素很多，不同模型，不同實 驗流程產(chǎn)生的結(jié)果不一致；(4)對chrM的測量單位的定義不確定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于分子生物學(xué)測序技術(shù)，對血液中的游離DNA進(jìn)行 全基因組測序，通過識別線粒體DNA拷貝數(shù)的異常情況來判斷受檢者罹患癌癥的風(fēng)險的檢 測裝置。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實施方式所提供的線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢 測裝置包括：測序單元，其對待檢者血漿樣本中的游離DNA進(jìn)行全基因組測序，得到待檢樣 本的測序結(jié)果；計算單元，其將待檢樣本的測序結(jié)果比對到人類參考基因組上，計算待檢樣 本的線粒體DNA拷貝指數(shù)；比較判斷單元，其將待檢樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù)與預(yù)先設(shè)定 的診斷界限值進(jìn)行比較，判斷待檢樣本是否存在線粒體DNA拷貝數(shù)變異性。
[0007] 進(jìn)一步地，由于線粒體DNA含量的變化與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù) 后密切相關(guān)，因而比較判斷單元還可進(jìn)一步根據(jù)待檢樣本是否存在線粒體DNA拷貝數(shù)變異 性，判斷待檢者罹患癌癥的風(fēng)險。
[0008] 上述線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測裝置將分子生物學(xué)測序技術(shù)與生物信息分 析技術(shù)相結(jié)合，可實現(xiàn)對癌癥的早期診斷。使用該裝置進(jìn)行癌癥篩查時，只需抽取檢測對 象的血液樣本，從血漿中抽提游離的DNA作為待檢樣本；通過裝置中的測序單元對游離DNA 進(jìn)行全基因組測序、然后通過裝置中的計算單元將測序結(jié)果比對到人類參考基因組上，計 算得到待檢樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù)；通過比較判斷單元將待檢樣本的線粒體DNA拷貝 指數(shù)與預(yù)先設(shè)定的診斷界限值進(jìn)行比較，來判斷待檢樣本是否存在線粒體DNA拷貝數(shù)變異 性，進(jìn)而判別待檢者是否處于癌癥高危狀態(tài)，從而實現(xiàn)癌癥的早期無創(chuàng)篩查或治療效果評 估。由于幾乎所有的惡性實體瘤都存在線粒體DNA拷貝數(shù)變異，通過將分子生物學(xué)測序結(jié) 果序列比對到人類參考基因組的線粒體DNA上的測序條數(shù)情況，即可以反映線粒體DNA拷 貝數(shù)的異常情況。線粒體DNA拷貝數(shù)的異常也是判斷良性和惡性腫瘤的重要指標(biāo)，所以本 發(fā)明的實施方式所提供的線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測裝置既具備癌癥的特異性（在各 類疾病中只有惡性腫瘤存在線粒體DNA拷貝數(shù)異常），也具備對各類癌癥的通用性（幾乎所 有的癌癥都存在線粒體DNA拷貝數(shù)異常）。
[0009] -方面，作為一種對線粒體DNA拷貝數(shù)的定量裝置，本發(fā)明的實施方式所提供的 該種檢測裝置在對線粒體DNA拷貝數(shù)的定量方式上具備以下特點：首先，對線粒體DNA的定 量檢測將線粒體DNA作為整體進(jìn)行計數(shù)，隨機(jī)誤差小，具有較高的穩(wěn)定性。其次，本發(fā)明的 裝置對線粒體DNA的檢測方法為全基因組測序中的一個統(tǒng)計指標(biāo)，隨著研究的加深，可以 將其與癌癥的各種相關(guān)基因進(jìn)行更深入的相關(guān)分析，使檢測結(jié)果具有橫向可比性。再次，本 發(fā)明的檢測裝置中所使用的計算方法為精確的定量方法，只需計數(shù)，讀數(shù)即可，不存在模型 擬合導(dǎo)致不同模型結(jié)論不一致的情況，其檢測結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。
[0010] 另一方面，作為一種癌癥的篩查檢測裝置，本發(fā)明的實施方式所提供的該種檢測 裝置在對癌癥的早期篩查方面還具備以下特點：（1)無創(chuàng)：通過抽血來進(jìn)行檢測，對受檢者 的身體沒有傷害，整個檢查過程幾乎沒有痛苦；（2)早期篩查：利用該裝置能比影像診斷早 幾個月發(fā)現(xiàn)腫瘤組織；（3)適用面廣：能夠發(fā)現(xiàn)幾乎所有的實體瘤；(4)準(zhǔn)確率和靈敏度高： 基于DNA序列水平進(jìn)行檢測，不易發(fā)生誤診；（5)實時監(jiān)控：游離DNA(cfDNA)在體內(nèi)的半衰 期為16分鐘至1小時，因此本裝置的檢測結(jié)果還能作為腫瘤術(shù)后或治療效果評估的實時指 標(biāo)；(6)由于不同癌癥的線粒體DNA拷貝數(shù)變異不一致，本發(fā)明的實施方式中所做的線粒體 DNA拷貝數(shù)還可能成為一種癌癥的分型指標(biāo)。
[0011] 具體地，本發(fā)明的實施方式所提供的線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測裝置中， 待檢樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù)為：待檢樣本的線粒體DNA拷貝數(shù)和核內(nèi)DNA拷貝數(shù) 的相對比值Mt或以Mt為單變量的單調(diào)函數(shù)值，且：Mt=nt (chrM)/len(chrM)/nt (chrN)/ len(chrN)，其中：nt(chrM)為待檢樣本的測序結(jié)果比對到人類參考基因組的線粒體DNA上 的測序條數(shù)，len(chrM)為人類參考基因組的線粒體DNA的長度（DNA的長度一般為取定的 染色體的bp(basepair)堿基數(shù)），nt (chrN)為待檢樣本的測序結(jié)果比對到人類參考基因 組的核內(nèi)DNA上的測序條數(shù)，len(chrN)為人類參考基因組的核內(nèi)DNA的長度。核內(nèi)DNA的 選擇可以為多種，例如可選擇常染色體DNA、或者常染色體DNA+性染色體DNA;甚至是取一 組特定的panel，分別代表線粒體和細(xì)胞核內(nèi)的DNA的拷貝數(shù)。值得補(bǔ)充說明的是，本發(fā)明 的實施方式所提出的上述指標(biāo)，即線粒體DNA拷貝數(shù)和核內(nèi)DNA拷貝數(shù)的相對比值，其單位 為1，理論上可以兼容用panel或者qPCR得到的對應(yīng)數(shù)值結(jié)果。
[0012] 此外，以Mt為單變量的單調(diào)函數(shù)值例如可以為Mt的自然對數(shù)值lnMt、Mtn(n>l)等， 取決于所采用的統(tǒng)計方法的不同。當(dāng)然，在上述對待檢樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù)的計算 過程中，還可以有各種變換或替代方案，例如線粒體DNA可以選擇線粒體上的一個或幾個 區(qū)間作為計算指標(biāo)，核內(nèi)DNA也可以選擇某一個或幾個區(qū)間作為計算指標(biāo)，均可以實現(xiàn)本 發(fā)明的目的。
[0013] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的實施方式所提供的線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測裝置中， 比較判斷單元中的診斷界限值通過下述方法得出：
[0014] (1)取一組健康人群血漿中的游離DNA作為對照樣本群，以測序單元相同的裝置 對該對照樣本群進(jìn)行全基因組測序，計算每個對照樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù)，對照樣本 的線粒體DNA拷貝指數(shù)為對照樣本的線粒體DNA拷貝數(shù)和核內(nèi)DNA拷貝數(shù)的相對比值Mh 或以 ％為單變量的單調(diào)函數(shù)值，且：MH=nH(chrM)/len(chrM)/nH(chrN)/len(chrN)，其 中：nH(chrM)為對照樣本的測序結(jié)果比對到人類參考基因組的線粒體DNA上的測序條數(shù)， len(chrM)為人類參考基因組的線粒體DNA的長度，nH(chrN)為對照樣本的測序結(jié)果比對 到人類參考基因組的核內(nèi)DNA上的測序條數(shù)，len(chrN)為人類參考基因組的核內(nèi)DNA的 長度。
[0015] (2)取一組癌癥患者血漿中的游離DNA作為癌癥樣本群，以測序單元相同的裝置 對癌癥樣本群進(jìn)行全基因組測序，