專利名稱：多重基因拷貝數檢測試劑盒和方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，應用于生物科學研究和臨床分子診斷，具體地，是涉及 到一種多重基因拷貝數檢測試劑盒和方法。
背景技術：
基因拷貝數是指單個細胞或單個基因組內所含目標基因片段的數目?；蚩截?數的變化如缺失或重復可能會改變目標基因的正常功能從而導致相關疾病發(fā)生或相關表 型的變化，因此基因拷貝數的快速而準確的檢測將有助于相關基因的科學研究。具體檢測 方法可以分為兩大類，一類是全基因組水平上的基因拷貝數變化區(qū)域篩選，另一類是對目 標區(qū)域進行拷貝數測定。前者包括細胞核型分析、比較基因組雜交以及全基因組SNP芯片 雜交技術等(Jacobs et al. , 1978; Solinas-Toldo et al. , 1997; Barrett et al., 2004; Zhao et al. , 2004)，這些技術主要用于發(fā)現新變異區(qū)域，但普遍存在檢測分辨率、 準確性偏低、檢測周期長以及檢測成本高等缺點，而后者主要針對有限目標區(qū)段的檢測，包 括實時定量PCR技術(Bieche et al.，1998)、多重可擴增探針雜交(MAPH) (Armour et al, 2000)、短熒光片斷定量多重PCR (QMPSF) (Charbonnier et al.，2000)、多重連接依賴探 針擴增(MLPA) (Schouten et al.，2002)以及 MassArray 絕對拷貝數檢測技術(Sequenom Inc., San Diego, CA)。實時定量PCR技術主要是基于在PCR指數擴增期，其擴增產物的量與原始模板量 成指數關系的原理發(fā)展而來的。如果固定PCR指數擴增期產物的量，那么原始模板量(NO) 對數值與PCR循環(huán)數(Ct)成線性關系。利用該技術進行目標基因拷貝數檢測時，需要選取 至少一個在所有待檢樣品中拷貝數保持穩(wěn)定的參照基因(通常每個基因組僅含一個拷貝) 以及目標基因/參照基因分子數量已知的標準樣品。對標準樣品進行梯度稀釋后與待檢 樣品一起進行目標基因/參照基因的實時定量PCR反應，收集與PCR產物量成正相關的熒 光信號，分析每個反應在指數擴增期某一固定熒光值對應的Ct值，利用標準樣品基因分子 數對數值與Ct值的線性關系曲線獲取待檢樣品的目標基因以及參照基因的絕對分子數， 在參照基因拷貝數已知情況下，將目標基因絕對分子數除以參照基因的絕對分子數即可估 計出目標基因的拷貝數。這種技術由于其操作簡單以及反應體系易優(yōu)化而獲得廣泛應用， 但由于目標基因與參照基因在不同體系中進行反應，最后結果的方差較大，不適合高拷貝 數的區(qū)分如5個與6個拷貝之間，而且通常情況下每個反應只能檢測一個基因，因此檢測通 量較小。短熒光片斷定量多重PCR (QMPSF)是一個多重基因拷貝數檢測技術。通過一個多 重熒光PCR反應同時擴增不同長度的多個目標基因和參照基因片斷，然后利用毛細管電泳 分析各個片斷的擴增量。每個目標基因的擴增量先用參照基因擴增量進行校正，然后通過 比較待檢樣品與已知各個基因拷貝數的對照樣品在這些校正值上的差異即可估計出待檢樣品每個目標基因的拷貝數。該方法操作簡單快速而且能夠實現多重基因檢測從而大大提 高檢測通量并有效降低檢測成本，但是由于不同基因片斷擴增采用的是不同擴增引物而且 不同PCR片斷的堿基組成和分子結構不盡相同，因此不同基因片斷的擴增效率會隨著模板 量、模板質量以及PCR擴增微環(huán)境的不同發(fā)生非同步變化，而且PCR平臺效應可能會減弱不 同拷貝數的基因片斷間差異，這樣最后的檢測值的準確性會大大下降，同樣該方法由于方 差偏大不利于高拷貝數的準確確定。多重可擴增探針雜交(MAPH)也是一種能同時實現多基因拷貝數檢測的技術，其主 要原理是將一批含共同擴增引物序列但長度不同的對應不同基因片段的過量探針與固定 在尼龍膜上的樣本DNA進行雜交，雜交后將未結合上的探針洗脫，然后分離出結合探針，以 這些結合探針為模板用通用引物進行PCR擴增，擴增產物用毛細管電泳進行片段分離和熒 光信號收集，比較參照樣本以及檢測樣本的擴增譜形可以確定缺失或重復的基因位點。這 種方法由于采用了通用引物，不同片段間的擴增一致性較QMPSF大為提高，但該操作過程 時間長，體系復雜不利于高通量運行，而且不同探針的結合效率會因為雜交條件的改變發(fā) 生非同步改變或者不同基因片斷的擴增效率也會隨PCR擴增微環(huán)境的不同發(fā)生非同步變 化，PCR平臺效應也可能會減弱不同拷貝數的基因片斷間差異，從而導致檢測方差偏大，準 確度下降，而且也不利于高拷貝數的準確確定。多重連接依賴探針擴增(MLPA)是目前使用較為廣泛的一種多重基因拷貝數檢測 技術，是MRC-Holland公司產品的主要技術基礎。該技術的操作過程如下針對每個位點設 計兩個探針，一個是上游探針，另一個是下游探針(其5’端須磷酸化)，這對探針可雜交到目 標序列緊鄰位置上，所有位點的上游探針5’端和下游探針3’端分別含一段共同序列，這對 共同序列使得隨后連接產物可以用通用引物擴增；對應多個目標基因的探針對與變性后的 樣本DNA的目標序列進行雜交；緊鄰配對的上下游探針對被連接酶連接；連接產物被作為 模板用通用引物進行PCR擴增；擴增產物用毛細管電泳進行片段分離和熒光信號收集，比 較參照樣本以及檢測樣本的擴增譜形可以確定缺失或重復的基因位點。MLPA與MAPH都能 實現同時分析幾十位點的能力，而且都采用了通用引物擴增，不同片段間的擴增一致性較 QMPSF大為提高，但操作上MLPA較MAPH簡單。雖然MLPA技術是目前較為穩(wěn)定而且被廣泛 使用的商業(yè)化技術，但其整個過程完成仍然需要2個工作日，而且不同探針的雜交連接效 率會因為雜交連接條件以及樣本DNA質量差異發(fā)生非同步改變或者不同基因片斷的擴增 效率也會隨PCR擴增微環(huán)境的不同發(fā)生波動，PCR平臺效應也可能會減弱不同拷貝數的基 因片斷間差異，從而導致檢測方差偏大，準確度下降，而且也不利于高拷貝數的準確確定。MassArray絕對拷貝數檢測技術是美國kquenom公司基于Massarray SNP分型平 臺，綜合多重競爭性PCR，單堿基延伸SNP分型以及端片段質譜分離技術開發(fā)而成的。競爭 性PCR最早是由Wang等人于1989發(fā)明用于目標基因表達量的確定，其基本原理是人工合 成一段RNA序列，其兩側序列分別與目標基因序列相同，但中間序列與目標基因存在長度 上的差異，然后將梯度稀釋的該RNA序列作為內對照分別與等量樣本mRNA混合用共同引物 反轉錄后用共同引物同時擴增目標基因mRNA和內對照RNA反轉錄產物；兩種擴增產物由于 在長度上存在差異所以可以用瓊脂糖電泳分開，由于PCR引物相同，目標基因片段以及對 照基因片段的擴增效率類似，因此兩種擴增產物對應電泳條帶的亮度比可以真實反映摻入 內對照RNA與目標基因mRNA的量比，這樣根據電泳條帶的亮度比以及內對照RNA的摻入量可以很好的估計目標基因mRNA的量。隨后，該技術經改進后被廣泛應用于檢測樣本中目標 病原微生物的定量(Hobson et al. , 1997; Li and Drake, 2001)。MassArray 絕對拷貝數 檢測基本流程如下合成一段與參照/目標基因僅有一個堿基差異的內對照DNA，然后將各 個內對照DNA —起與樣本DNA混合在一起；通過多重PCR反應將多個參照/目標基因片段 以及對應的內對照DNA片段一起擴增；將PCR擴增產物進行純化；利用緊挨樣本參照/目 標基因DNA與內對照DNA差異位點處的延伸引物以多重PCR擴增產物為模板在僅含ddNTP 體系中進行單堿基延伸；延伸產物純化后用質譜分離；分析每個位點樣本峰與內對照峰的 比例，目標基因比值除以參照基因比值進行校正，其校正值通過除以參照樣本的校正值后 乘以參照樣本目標基因拷貝數后即得檢測樣本目標基因的拷貝數。該技術由于采用了內對 照競爭性PCR技術，降低了片段擴增效率差異以及實驗操作和檢測環(huán)境/儀器等外界環(huán)境 的影響，從而降低了檢測結果方差，提高了檢測結果的準確性，對高拷貝數多態(tài)也會有很好 的區(qū)分。但該技術由于采用質譜平臺，延伸產物質譜峰普遍比較低，如果不能很好控制背 景噪音以及樣本/內對照DNA量比，結果的準確性會大大下降，而且整個過程設計多次PCR 以及純化過程，實驗操作有待進一步簡化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于克服現有技術的缺陷，提供一種多重基因拷貝數檢測試劑 盒，該試劑盒可以對多個目標基因同時進行拷貝數檢測。
實現上述目的的技術方案如下
一種多重基因拷貝數檢測試劑盒，主要包括有
(A)針對待測的目標基因設計的多重PCR引物，每對引物中的一條具有熒光標記；
(B)定量的針對不同待測的目標基因的內對照DNA片段，該內對照DNA片段與(A)中對 應的多重PCR引物的擴增產物高度一致，為對應擴增產物的序列缺失或插入少數1-50個堿 基的序列；
(C)至少一對參照基因的多重PCR引物，每對引物中的一條具有熒光標記；
(D)定量的參照基因的內對照DNA片段，該內對照DNA片段與(C)中對應的參照基因高 度一致，為參照基因的序列缺失或插入少數1-50個堿基的序列；
上述同種熒光標記的多重PCR引物對應擴增產物的長度有差異，以至于擴增產物在毛 細管電泳分析中任意兩個產物條帶不重疊。本發(fā)明的另一目的是提供一種多重基因拷貝數檢測方法，該方法是基于競爭性 PCR原理并結合多重熒光PCR擴增以及毛細管電泳長度差異片段分離技術對參照基因和多 個目標基因同時進行定量，并利用參照基因對檢測結果進行校正后獲取多個目標基因的正 確拷貝數，
一種多重基因拷貝數檢測方法，主要包括以下步驟
(1)針對待測的目標基因，設計對應的多重PCR引物，每對引物中的一條具有熒光標 記；設計至少一對參照基因的多重PCR引物；每對引物中的一條具有熒光標記；上述同種熒 光標記的多重PCR引物對應擴增產物的長度有差異；
(2)設計針對不同待測的目標基因和參照基因的內對照DNA片段，所述內對照DNA片段 與(1)中對應的多重PCR引物的擴增產物高度一致，為對應擴增產物的序列缺失或插入少數1-50個堿基的序列；
(3)對所有內對照DNA片段嚴格定量；
(4)將每種內對照DNA片段等量混合，與所述多重PCR引物對待測樣品進行多重熒光 PCR擴增；
(5)擴增產物通過變性毛細管電泳將不同長度的片段分開，得到每個條帶的位置信息 以及熒光強度。優(yōu)選的，步驟(5)之后還包括以下步驟計算每個基因位點的樣本條帶/內對照 DNA條帶的熒光峰高或面積比，然后將目標基因的該比值除以參照基因的該比值再乘以參 照基因的拷貝數即得目標基因的相對拷貝數。如果存在目標基因拷貝數已知的參照樣本，可以將待測樣本目標基因的相對拷貝 數除以參照樣本對應目標基因的相對拷貝數再乘以參照樣本該目標基因拷貝數即得待測 樣本該目標基因的精確拷貝數。本技術發(fā)明是在認真總結現有技術中各種多重檢測方法的優(yōu)缺點的基礎上再經 過自主創(chuàng)新后開發(fā)成功的，它綜合了 QMPSF —步PCR —步檢測的簡單快速以及MassArray 絕對拷貝數檢測技術中多重競爭性PCR的高精度，是一種簡單快速、高通量、高精確的先進 基因拷貝數檢測技術，在對疾病致病基因研究等領域將會有廣泛的應用前景。本發(fā)明所述的多重基因拷貝數檢測試劑盒和檢測方法，主要具有以下優(yōu)點
1、快速檢測在獲得內對照DNA后，只要將樣本DNA與內對照DNA混勻后進行多重 PCR，然后將PCR產物直接上毛細管熒光電泳儀(如ABI測序儀)即可，整個實驗過程僅需要 一步PCR循環(huán)和一步毛細管電泳，耗時不到4個小時；
2、多個基因位點同時檢測由于采用了多重PCR體系，一個反應通常可以同時擴增12 個位點以上，也就意味著如果選用2個參照基因，那么一個反應可以同時檢測10個以上目 標基因位點；
3、高精確性由于目標基因片段與其內對照DNA之間僅有少數幾個堿基差別，這兩個 模板的擴增效率將體現高度一致性，因此最后的擴增產物真實的反應了擴增前兩個模板濃 度比例，根據我們預測試結果，一個競爭性PCR反應重復3次的標準方差在5%之內，而且如 果將目標基因片段與內對照DNA按不同稀釋梯度混合進行競爭性PCR，我們發(fā)現樣本峰與 內對照峰面積之比與兩個模板的原始濃度比的相關性達到99. 9%以上。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明所述檢測方法的原理示意圖； 圖2是本發(fā)明實施例1中樣品1檢測結果示意圖； 圖3是本發(fā)明實施例1中樣品2檢測結果示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明所述的多重基因拷貝數檢測方法，參見圖1，主要包括以下步驟
1)針對多個目標基因以及參照基因進行多重PCR引物設計，每對引物中一條將標上熒 光引物，同種熒光引物對應擴增產物長度必須有差別；2)針對每個基因的擴增片段，合成或克隆獲得與對應引物擴增產物序列對比缺失或插 入1-50個堿基的DNA片段作為內對照DNA，并進行精確定量；在圖1中，內對照DNA相對于 樣本DNA片段缺2個堿基；
3)將適量樣本DNA與適量內對照DNA混勻，混入的每種內對照DNA的分子數量相等并 估計與樣本DNA中參照基因的分子數量一致；
4)對樣本/內對照DNA混合物進行多重熒光PCR擴增；
5)擴增產物通過變性毛細管電泳將不同長度的片段分開，收集每個條帶的位置信息 以及熒光強度；這一步通常在測序儀上完成如美國應用生物公司的測序儀ABI3130以及 ABI3730 等；
6)由于不同基因的擴增產物在長度以及熒光標記上不同，而且同一基因位點上樣本 DNA以及內對照DNA擴增產物長度也不同(附圖中為2bp差異)，因此根據毛細管電泳峰形圖 可以明確每個基因位點上樣本DNA以及對照DNA各自擴增產物量。由于樣本DNA以及對照 DNA在每個基因位點上擴增引物一致而且序列上僅有微量差異，因此樣本與內對照DNA的 擴增量比可以估計為反應前樣本DNA與內對照DNA的分子數量比。計算每個基因位點的樣 本DNA峰(S峰)與內對照DNA峰(I峰)的峰高或面積比(S/I)。7)將每個目標基因位點的S/I比值分別除以參照基因的S/I比值然后乘以參照基 因的拷貝數即可獲得目標基因的相對拷貝數(附圖中參照基因拷貝數為2)。8)如果存在目標基因拷貝數已知的參照樣本，7)中的結果可以用參照樣本對應基 因的檢測結果進行進一步的校正，獲取目標基因的精確拷貝數。
實施例1
利用本發(fā)明所述多重基因拷貝數檢測方法對兩個21三體患者進行21號染色體、X染 色體以及Y染色體的拷貝數檢測。一 構建多重基因拷貝數檢測試劑盒 目標基因序列及內對照DNA序列信息
選取了 3個目標基因和1個參照基因做檢測，參照基因為核糖核酸酶P亞基(P0P1)， 3個目標基因為唐氏綜合癥關鍵區(qū)鈣調磷酸1調控子(RCANl)、Y染色體上性別決定區(qū) (SRY)以及X染色體上高多樣同源框(HDX)。這些基因對應擴增序列的原序列與內對照 DNA序列信息見下面描述(黃色背景藍色字體處為人參照序列與內對照序列差別處)。內對 照DNA由上海生工進行克隆合成。POPl基因(參照基因)
人標準序列，253bp (SEQ ID NO 1)
tgaaatgatgateteatggttgaaatatgtttttcttttattgttttcttttcccttaaatgttctctgtct ttaattttactaTGACtggggaccttccagggccagacattgtgtaagatgctgggatagatgacttagatgtggtc aaagaagtacagggcactcaggaaacctctagaaggggtactgagctcagatgagaaaaatgaggccagcctcctga tggaagagcaggcatttgaactgactc
內對照 DNA 序列，25Ibp (SEQ ID NO 2)
tgaaatgatgatctcatggttgaaatatgtttttcttttattgttttcttttcccttaaatgttctctgtct ttaattttactaTCtggggaccttccagggccagacattgtgtaagatgctgggatagatgacttagatgtggtcaaagaagtacagggcactcaggaaacctctagaaggggtactgagetcagatgagaaaaatgaggccagcctcctgatg gaagagcaggcatttgaactgactc HDX基因(目標基因) 人標準序列，(SEQ ID NO 3)
gtaaaaattgctttcagctcatattacagtgtgcacaggagactaagctggacttcagtgtagtcagggtaa gtattgaggtcttacactcaaatttaaagcttcttattacaagtgatatttgcttaatatgagaaaaaatattcagg gtatgaAGTCactaattttataaacagcttcacttccctggtataacaatactattttaaaaataaatagggctaat catttagtatgtatttgtttctataaataccttgaacacacagaaacccttg 內對照 DNA 序列，276bp (SEQ ID NO :4)
gtaaaaattgctttcagctcatattacagtgtgcacaggagactaagctggacttcagtgtagtcagggtaa gtattgaggtcttacactcaaatttaaagcttcttattacaagtgatatttgcttaatatgagaaaaaatattcagg gtatgaACactaattttataaacagcttcacttccctggtataacaatactattttaaaaataaatagggctaatca tttagtatgtatttgtttctataaataccttgaacacacagaaacccttg SRY基因(目標基因) 人標準序列，350bp (SEQ ID NO :5)
gcaagtagtcaacgttactgaattaccatgttttgcttgagaatgaatacattgtcagggtactagggggta ggctggttgggcggggttgagggggtgttgagggcggagaaatgcaagtttcattacaaaagttaacgtaacaaaga atctggtagaagtgagttttggatagtaaaataagtttcgaactctggcacctttcaattttgtcgcactctccttg ttttTGACaatgcaatcatatgcttctgctatgttaagcgtattcaacagcgatgattacagtccagctgtgcaaga gaatattcccgctctccggagaagctcttccttcctttgcactgaaa 內對照 DNA 序列，348bp (SEQ ID NO :6)
gcaagtagtcaacgttactgaattaccatgttttgcttgagaatgaatacattgtcagggtactagggggta ggctggttgggcggggttgagggggtgttgagggcggagaaatgcaagtttcattacaaaagttaacgtaacaaaga atctggtagaagtgagttttggatagtaaaataagtttcgaactctggcacctttcaattttgtcgcactctccttg ttttTCaatgcaatcatatgcttctgctatgttaagcgtattcaacagcgatgattacagtccagctgtgcaagaga atattcccgctctccggagaagctcttccttcctttgcactgaaa RCANl基因(目標基因) 人標準序列，354bp (SEQ ID NO :7)
gcactggaaaatccaggcagttttaggccattttcacttttcaccctagtgtgagggtgaggcatgcggttt ctcagatttaaattctgaataaaatttccccttaaatgatcttatctccaatatggtatagagtttaatttatttgg gaaggttcagaatgttgtacatttttgaaagctacatgttacatatgtgcgaagtttattttcagttttccactatt tctctaattttagggtttcTGACtctaaaatcagatgtttttcacatccagagctgctttaaatcctcctcaccact ccaccccctaacaactgcttggttcccctctcagctcaatctgctgtcacc
內對照 DNA 序列，352bp (SEQ ID NO :8) gcactggaaaatccaggcagttttaggccattttcac ttttcaccctagtgtgagggtgaggcatgcggtttctcagatttaaattctgaataaaatttccccttaaatgatct tatctccaatatggtatagagtttaatttatttgggaaggttcagaatgttgtacatttttgaaagctacatgttac atatgtgcgaagtttattttcagttttccactatttctctaattttagggtttcTCtctaaaatcagatgtttttca catccagagctgctttaaatcctcctcaccactccaccccctaacaactgcttggttcccctctcagctcaatctgc tgtcacc引物序列其中，[FAM]表示為熒光標記。POPlF [FAM]TGAAATGATGATCTCATGGTTGAAA (SEQ ID NO 9) POPlR GAGTCAGTTCAAATGCCTGCTCTT (SEQ ID NO: 10)
HDXF GTAAAAATTGCTTTCAGCTCATATTACAGTG (SEQ ID NO 11) HDXR [FAM]CAAGGGTTTCTGTGTGTTCAAGGTATTT (SEQ ID NO :12) SRYF GCAAGTAGTCAACGTTACTGAATTACCA (SEQ ID NO :13) SRYR [FAM]TTTCAGTGCAAAGGAAGGAAGAGC (SEQ ID NO :14) RCANlF: [FAM]GCACTGGAAAATCCAGGCAGTT (SEQ ID NO :15) RCANlR: GGTGACAGCAGATTGAGCTGAGA (SEQ ID NO :16)
二 檢測樣本樣本A為臨床核型分析為21三體的男性，樣本B為臨床核型分析為21 三體的女性。三檢測方法
主要包括以下步驟
(1) 將臨床上已經證明是21三體綜合癥的2個分別為男性和女性樣本的DNA用 Biophotomerter/77w5 (Eppendor)進行精確定量，然后稀釋至IOng/ μ 1作為待測DNA樣本待(2) 配置PCR引物混合液，分別含4對PCR引物P0P1F/R、HDXF/R、RCAN1F/R和 SRYF/R,每條引物濃度各2 μ M。(3) 內對照DNA用Biophotomerter/^iAs (Eppendor)進行多次定量后取平均 值，然后配置4個內對照DNA混合液，終濃度均為Ing/ μ 1，然后將此混合液再梯度稀釋 200，000 倍(標為 iDNA)。
(4) 多重PCR體系(20 μ 1)配置 IOxBuffer (Qiagen) 2μ 1 PCR引物混合液2μ1
MgCl2 (25mM)0. 8 μ 1
dNTP(IOmM)0. 4 μ 1
樣本DNA1 μ 1
iDNA1 μ 1
HotstarTaq (5U/ μ 1, Qiagen) ddH20
PCR程序 95 °C 15min
94 °C20s
64°C -0. 5°C /cycle 40s 72 °C2min
94 °C 20s
0. 2μ 1 12. 6μ 1
χ !!cycles取1μ IPCR產物用ddH20稀釋10倍，然后取1μ 1加入到8·8μ 1的Hi-Di (ABI) 和0.2μ1 1的LIZ500分子內標(ABI)中，95°C 5min變性后，置于3130XL測序儀上進行 毛細管電泳。(6) 結果使用GeneMapperf. 0軟件進行數據分析，讀取峰高等數據。數據分析表

權利要求
1.一種多重基因拷貝數檢測試劑盒，其特征是，主要包括有(A)針對待測的目標基因設計的多重PCR引物，每對引物中的一條具有熒光標記；(B)定量的針對不同待測的目標基因的內對照DNA片段，該內對照DNA片段與(A)中對 應的多重PCR引物的擴增產物高度一致，為對應擴增產物的序列缺失或插入少數1-50個堿 基的序列；(C)至少一對參照基因的多重PCR引物，每對引物中的一條具有熒光標記；(D)定量的參照基因的內對照DNA片段，該內對照DNA片段與(C)中對應的參照基因高 度一致，為參照基因的序列缺失或插入少數1-50個堿基的序列；上述同種熒光標記的多重PCR引物對應擴增產物的長度有差異，以至于擴增產物在毛 細管電泳分析中任意兩個產物條帶不重疊。
2.根據權利要求1所述的多重基因拷貝數檢測試劑盒，其特征是，所述缺失或插入的 堿基的個數為1一 5。
3.根據權利要求2所述的多重基因拷貝數檢測試劑盒，其特征是，所述缺失或插入的 堿基的個數為2個。
4.根據權利要求1一 3任一項所述的多重基因拷貝數檢測試劑盒，其特征是，還包含有 多重PCR反應緩沖液及熱穩(wěn)定DNA聚合酶或兩者預混和液。
5.一種多重基因拷貝數檢測方法，其特征是，主要包括以下步驟(1)針對待測的目標基因，設計對應的多重PCR引物，每對引物中的一條具有熒光標 記；設計至少一對參照基因的多重PCR引物；每對引物中的一條具有熒光標記；上述同種熒 光標記的多重PCR引物對應擴增產物的長度有差異；(2)設計針對不同待測的目標基因和參照基因的內對照DNA片段，所述內對照DNA片段 與(1)中對應的多重PCR引物的擴增產物高度一致，為對應擴增產物的序列缺失或插入少 數1-50個堿基的序列；(3)對所有內對照DNA片段嚴格定量；(4)將每種內對照DNA片段等量混合，與所述多重PCR引物對待測樣品進行多重熒光 PCR擴增；(5)擴增產物通過變性毛細管電泳將不同長度的片段分開，得到每個條帶的位置信息 以及熒光強度。
6.根據權利要求5所述的多重基因拷貝數檢測方法，其特征是，步驟(5)之后還包括以 下步驟計算每個基因位點的樣本條帶/內對照DNA條帶的熒光峰高或面積比，然后將目標 基因的該比值除以參照基因的該比值再乘以參照基因的拷貝數即得目標基因的相對拷貝數。
7.根據權利要求5所述的多重基因拷貝數檢測方法，其特征是，所述缺失或插入的堿 基的個數為1 一 5。
8.根據權利要求7所述的多重基因拷貝數檢測方法，其特征是，所述缺失或插入的堿 基的個數為2。
全文摘要
本發(fā)明公開一種多重基因拷貝數檢測試劑盒，主要包括有針對待測的目標基因設計的多重PCR引物；定量的針對不同待測的目標基因的內對照DNA片段；至少一對參照基因的多重PCR引物；定量的參照基因的內對照DNA片段；上述同種熒光標記的多重PCR引物對應擴增產物的長度有差異，以至于擴增產物在毛細管電泳分析中任意兩個產物條帶不重疊。本發(fā)明還公開了一種多重基因拷貝數檢測方法。本發(fā)明多重基因拷貝數檢測試劑盒和檢測方法，不僅能多個基因位點同時快速檢測，而且具有很高的精確性。
文檔編號C12Q1/68GK102086474SQ20101018055
公開日2011年6月8日 申請日期2010年5月24日 優(yōu)先權日2010年5月24日
發(fā)明者姜正文, 馬瑞曉 申請人:上海天昊生物科技有限公司