一種半定量競(jìng)爭(zhēng)pcr檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因拷貝數(shù)是指某一種基因或某一段特定的DNA序列在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目。隨 著轉(zhuǎn)基因以及基因敲除技術(shù)的快速發(fā)展，許多轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物以及基因敲除鼠等應(yīng)運(yùn)而生， 就基因敲除鼠而言，實(shí)驗(yàn)人員需要通過(guò)拷貝數(shù)的鑒定來(lái)判斷該基因敲除鼠為純合子或雜合 子，以便于進(jìn)一步的科學(xué)研究。而對(duì)轉(zhuǎn)基因植物而言，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植物的安全性與有效性與 外源基因拷貝數(shù)密切相關(guān)，所以鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)對(duì)保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)以及人類 的健康很必要。拷貝數(shù)變異（copy number variations, CNVs)廣泛存于基因組中，與一些 遺傳性疾病的發(fā)生相關(guān)，對(duì)人類抗病性和易感性表型等變異有重要影響。此外，對(duì)某些病毒 感染性疾病的早期診斷可以通過(guò)鑒定病毒某段基因的拷貝數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而診斷出受測(cè)者是 否有病毒感染以及病毒感染的嚴(yán)重程度。
[0003] 因此，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確和低成本的基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法，該 方法通過(guò)觀察或計(jì)算待測(cè)基因條帶強(qiáng)度與內(nèi)對(duì)照基因瓊脂糖凝膠電泳條帶強(qiáng)度的比值，得 到待測(cè)基因的相對(duì)拷貝數(shù)。該方法不需要構(gòu)建同源或異源的競(jìng)爭(zhēng)子；也不需要專門的實(shí)時(shí) 定量PCR儀來(lái)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，本發(fā)明提供的半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法更 加快速、簡(jiǎn)便、低成本。此外，本發(fā)明還提供了一種半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法 的應(yīng)用。
[0005] 第一方面，本發(fā)明提供了一種半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法，包括以下 步驟：
[0006] (1)提供待測(cè)樣品
[0007] 所述待測(cè)樣品中含有待測(cè)基因和內(nèi)對(duì)照基因，所述內(nèi)對(duì)照基因在所述待測(cè)樣品所 屬種的基因組中具有相同的拷貝數(shù)；
[0008] (2)提供多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物
[0009] 所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由分別針對(duì)待測(cè)基因和內(nèi)對(duì)照基因的設(shè)計(jì)的至少一對(duì) 待測(cè)基因引物和至少一對(duì)內(nèi)對(duì)照基因引物組成，
[0010] 所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物所產(chǎn)生的不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段間的長(zhǎng)度差異能被瓊脂糖 凝膠電泳分辨；
[0011] (3)多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)
[0012] 配置多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)；
[0013] (4)結(jié)果分析
[0014] 對(duì)多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察或計(jì)算 待測(cè)基因條帶強(qiáng)度與內(nèi)對(duì)照基因條帶強(qiáng)度的比值，得到待測(cè)基因的相對(duì)拷貝數(shù)。
[0015] 本發(fā)明提供了一種半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法，該方法直接從基因組 DNA中任意挑選出所有待測(cè)樣本都含有的相同拷貝數(shù)的DNA片段作為內(nèi)對(duì)照基因，并設(shè)計(jì) 針對(duì)內(nèi)對(duì)照基因與待測(cè)基因的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物，使得該內(nèi)對(duì)照基因與待測(cè)基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物之間的長(zhǎng)度差異能采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行區(qū)分，通過(guò)觀察或計(jì)算待測(cè)基因條帶 強(qiáng)度與內(nèi)對(duì)照基因條帶強(qiáng)度的比值，得到待測(cè)基因的相對(duì)拷貝數(shù)。相對(duì)現(xiàn)有的競(jìng)爭(zhēng)性PCR 技術(shù)，該方法不需要構(gòu)建同源或異源的競(jìng)爭(zhēng)子；相對(duì)于現(xiàn)有的定量PCR技術(shù)，該方法不需要 專門的實(shí)時(shí)定量PCR儀來(lái)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，本發(fā)明提供的半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝 數(shù)的方法更加快速、簡(jiǎn)便、低成本。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物的長(zhǎng)度范圍為18~23bp，所述 多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物之間的TM值相差不超過(guò)3°C。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由1~3對(duì)待測(cè)基因引物和1 對(duì)內(nèi)對(duì)照基因引物組成。
[0018] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由1對(duì)待測(cè)基因引物和 1對(duì)內(nèi)對(duì)照基因引物組成。
[0019] 本發(fā)明采用的方法在多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物優(yōu)選為1對(duì)待測(cè)基因引物和1對(duì)內(nèi)對(duì)照 基因引物的組合的情況下，可優(yōu)選采用普通的PCR體系以及普通的PCR程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 并調(diào)節(jié)PCR體系中待測(cè)基因引物和內(nèi)對(duì)照基因引物的摩爾比，所述摩爾比優(yōu)選為1~3:1， 進(jìn)一步優(yōu)選為2:1。
[0020] 本發(fā)明采用的方法在多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物優(yōu)選為多對(duì)待測(cè)基因引物和多對(duì)內(nèi)對(duì) 照基因引物的組合的情況下，可調(diào)節(jié)多重PCR體系中待測(cè)基因引物和內(nèi)對(duì)照基因引物的摩 爾比，所述摩爾比優(yōu)選為1~3:1，進(jìn)一步優(yōu)選為2:1，其中，待測(cè)基因引物之間的摩爾比優(yōu) 選為1 :1，內(nèi)對(duì)照基因引物之間的摩爾比優(yōu)選為1 :1。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述多重PCR引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度范圍為100~ 500bp，不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度差異為50~100bp。
[0022] 擴(kuò)增產(chǎn)物在100~500bp長(zhǎng)度范圍內(nèi)，且長(zhǎng)度差異為50~100bp的范圍內(nèi)，能保 證各DNA片段的能被瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分開(kāi)的前提下，使得各DNA片段具有相近的擴(kuò)增效 率。
[0023] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中，所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)體系中，所述待測(cè)基因引物和 內(nèi)對(duì)照基因引物之間的摩爾比為1 :1~3 :1。
[0024] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（3)中，所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)體系中，所述待測(cè)基因 弓丨物和內(nèi)對(duì)照基因引物之間的摩爾比為2 :1。
[0025] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，所述待測(cè)樣品為Bcl-3基因敲除鼠的基因組DNA樣品。
[0026] 優(yōu)選地，所述Bcl-3基因敲除鼠的基因組DNA樣品的制備方法是采用堿裂解法提 取基因組DNA。
[0027] 本發(fā)明提供的半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法對(duì)待測(cè)DNA樣品中的待測(cè)基 因的拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量，不需要調(diào)整各待測(cè)樣品中起始DNA的用量，因此，本發(fā)明提供的 發(fā)明對(duì)待測(cè)DNA樣品的質(zhì)量和含量要求比傳統(tǒng)的定量PCR技術(shù)要求更寬松，可以采用快捷 的堿裂解法提取DNA,而不用進(jìn)行DNA純化。
[0028] 此外，多重競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)受DNA樣品質(zhì)量的影響較大，而本發(fā)明提供的半定量競(jìng) 爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法采用的內(nèi)對(duì)照基因的來(lái)源于待測(cè)樣品本身，且其在待測(cè)樣品 的基因組中的拷貝數(shù)是已知的，因此，相對(duì)于多重競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)，本發(fā)明提供的半定量競(jìng)爭(zhēng) PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法不需要額外設(shè)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)子，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果受樣品本身質(zhì)量的影響 更小，相對(duì)定量的準(zhǔn)確性更高。
[0029] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述待測(cè)基因?yàn)锽cl-3基因敲除鼠的潮霉素基因。
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述Bcl-3基因敲除鼠潮霉素基因的上游引物序列和下 游引物序列分別如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 2所示。
[0031] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述內(nèi)對(duì)照基因Bcl-3基因敲除鼠的Bcl-3基因。
[0032] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，所述Bcl-3基因敲除鼠Bcl-3基因的上游引物序列和下 游引物序列分別如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0033] 第四方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方 法在半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)試劑盒中的應(yīng)用。
[0034] 優(yōu)選地，如第一方面所述的半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法在鑒定生物基 因型中的應(yīng)用。
[0035] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述生物基因型為基因敲除鼠的基因型。
[0036] 本發(fā)明提供了的真核重組表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng)用具有如下有益效果：
[0037] (1)本發(fā)明提供的半定量競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)的方法通過(guò)觀察或計(jì)算待測(cè) 基因條帶強(qiáng)度與內(nèi)對(duì)照基因瓊脂糖凝膠電泳條帶強(qiáng)度的比值，能得到待測(cè)基因的相對(duì)拷貝 數(shù)；
[0038