專利名稱：一種真菌菌種lp-19-3及其在含銅廢水處理中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種能夠去除水中銅離子的真菌菌種LP-19-3及其在含銅廢水處理中的用途。
背景技術(shù)：
我國銅礦分布廣泛，銅礦開采活動極為頻繁，由此造成的水和土壤的污染也非常嚴重。除了銅礦開采以外，銅金屬的冶煉和加工、電鍍、印染、電子材料漂洗廢水、化工、染料 生產(chǎn)等多種工業(yè)活動也都會產(chǎn)生含銅廢水。目前我國相關(guān)地區(qū)對此類污染缺乏有效先進的治理措施，現(xiàn)有的治理措施技術(shù)落后、治理效果差強人意、成本昂貴、無法負荷全國大面積的污染以及快速出現(xiàn)的污染新區(qū)域。這一系列復雜多變的銅礦污染問題使得銅礦區(qū)含銅廢水污染問題成為了環(huán)境污染治理領(lǐng)域一大亟待解決的難題。傳統(tǒng)的治理含銅廢水的方法大都屬于物理化學范疇，包括化學沉淀法、電解法、物理化學吸附、離子螯合、離子交換等。但這些方法存在著產(chǎn)生污泥的二次污染、能耗高、成本昂貴、處理量受限等的缺點，大多應(yīng)用并不廣泛。近年來，生物方法尤其是微生物的方法在治理重金屬污染領(lǐng)域逐步被人們所認識和接受。微生物方法具有成本低廉、操作運行簡便、處理效率高、無二次污染、易于回收重金屬等傳統(tǒng)方法不具備的優(yōu)勢。目前，微生物處理技術(shù)已經(jīng)成為世界各國重金屬污染治理研究和應(yīng)用領(lǐng)域的一大熱點。但是到目前為止，國內(nèi)外利用微生物菌種來吸附處理水中銅離子污染的專利技術(shù)還非常少見。美國US5578547 (A)-1996-11-26 (Summers, Jr. et al)公開了一種利用泥炭蘇和其他一些植物體制成小珠，將大量的小珠放入污染水體中進行對重金屬離子的吸附。該發(fā)明并沒有利用微生物菌種，而是一些苔蘚植物；同時該發(fā)明并未針對銅離子，其處理銅離子的效果未知；而且該發(fā)明技術(shù)僅限于含重金屬離子濃度較低的水體。中國200910027229. 3 (陳雁等)公開了一種利用鴨拓草及微生物菌劑混合的形式治理含銅污水。鴨拓草是目前發(fā)現(xiàn)的一種銅超積累植物，對銅具有耐受和積累的能力。雖然該發(fā)明涉及了微生物菌株的使用，但其中添加的菌劑(包括細菌類和真菌類)是起益生菌作用，即促進鴨拓草的生長以及鴨拓草對于銅離子的修復作用，但菌劑本身并不具有吸附處理銅離子的能力。因此，該發(fā)明實質(zhì)上是利用植物修復的方法來治理含銅污水，并沒有使用微生物修復技術(shù)。因此，本領(lǐng)域中存在對于處理含銅污水效果良好并且能夠進行大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的菌種的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種真菌菌種(Peyronellaea pomorum)。本發(fā)明的第二個目的在于提供了一種包含真菌的菌劑。本發(fā)明的第三個目的在于提供了菌劑的制備方法。
本發(fā)明的第四個目的在于提供了一種銅離子處理劑。本發(fā)明的第五個目的在于提供了一種處理含銅廢水的方法。為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案在第一個方面，本發(fā)明提供了一種真菌LP-19-3 (Peyronellaea pomorum),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，100101，保藏日期為2012年07月04日，其保藏號為CGMCC No. 6338。本發(fā)明的真菌可耐受水溶液中濃度為50mg/L以下的銅離子，優(yōu)選地耐受濃度為10mg/L以下的銅離子，更優(yōu)選地耐受濃度為5mg/L以下的銅離子。在第二個方面，本發(fā)明提供了一種菌劑，所述菌劑包含第一方面中所述的真菌。在第三個方面，本發(fā)明提供了如第二方面所述的菌劑的制備方法，所述方法包括a)培養(yǎng)皿培養(yǎng)將如第一方面所述的真菌的菌種在無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，20-30°C，優(yōu)選22-28°C，進一步優(yōu)選25°C下培養(yǎng)4_6天，優(yōu)選4. 4-5. 5天，進一步優(yōu)選5天；固體培養(yǎng)基具有以下組成馬鈴薯浸粉4-6g/L，優(yōu)選4. 5-5. 5g/L，進一步優(yōu)選5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，優(yōu)選17-23g/L，進一步優(yōu)選20g/L ;瓊脂13_18g/L，優(yōu)選14-17g/L，進一步優(yōu)選 16g/L ;氯霉素 0. lg/L ；b) 一級種子培養(yǎng)將步驟a)培養(yǎng)的菌種在無菌條件下接種于液體培養(yǎng)基，20-30°C，優(yōu)選22-28°C，進一步優(yōu)選25°C下培養(yǎng)5_7天，優(yōu)選地5. 5-6. 5天，更優(yōu)選地6天，制得一級種子；液體培養(yǎng)基具有以下組成馬鈴薯浸粉4-6g/L，優(yōu)選4. 5-5. 5g/L，進一步優(yōu)選5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，優(yōu)選17-23g/L，進一步優(yōu)選20g/L ;氯霉素0. lg/L ；c)二級種子培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5-15%，優(yōu)選8-12%，更優(yōu)選10%的接種量，將所述一級種子接種到發(fā)酵罐中，曝氣，培養(yǎng)5-7天，優(yōu)選5. 5-6. 5天，進一步優(yōu)選6天，制得二級種子；d)混合發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為10-20%，優(yōu)選12-18%，更優(yōu)選15%的接種量，將二級種子接種到發(fā)酵罐中，進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌劑。培養(yǎng)皿培養(yǎng)中，培養(yǎng)溫度可以為20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25 V、26°C、27 V、28 V、29°C或30 V ；培養(yǎng)時間可以為4天、4. 5天、110小時、5天、130小時、5. 5天或6天；所用的固體培養(yǎng)基中馬鈴薯浸粉可以為4g/L、4. 2g/L、4. 5g/L、4. 7g/L、4. 9g/L、5g/L、5. lg/L、5. 3g/L、5. 5g/L、5. 8g/L 或 6g/L,葡萄糖或者鹿糖可以為 15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L 或 25g/L，瓊脂可以為 13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L 或 18g/L。一級種子培養(yǎng)中，培養(yǎng)溫度可以為 20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C或30°C;培養(yǎng)時間可以為5天、5. 5天、140小時、6天、150小時、6. 5天或7天；所用的液體培養(yǎng)基中馬鈴薯浸粉可以為4g/L、4. 2g/L、4. 5g/L、4. 7g/L、4. 9g/L、5g/L、5. lg/L、
5.3g/L、5. 5g/L、5. 8g/L 或 6g/L,葡萄糖或者鹿糖可以為 15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L 或 25g/L。二級種子培養(yǎng)中，接種量按液體培養(yǎng)基的體積比可以為5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14% 或 15% ;發(fā)酵罐容積可以為 1L、1. 5L、2L、2. 5L、3L、3. 5L、4L、4. 5L 或 5L ;培養(yǎng)時間可以為5天、5. 5天、140小時、6天、150小時、6. 5天或7天。
混合發(fā)酵培養(yǎng)中，接種量按液體培養(yǎng)基的體積比可以為10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19% 或 20%o在第四個方面，本發(fā)明提供了一種銅離子處理劑，所述銅離子處理劑包含如第一方面所述的真菌，優(yōu)選地，所述處理為去除或回收。在第五個方面，本發(fā)明提供了一種處理含銅廢水的方法，所述方法包括將如第一方面所述的真菌、如第二方面所述的菌劑或如第四方面所述的銅離子處理劑與所述含銅廢水接觸。
本發(fā)明的處理含銅廢水的方法可包括(a)將含銅廢水的pH值調(diào)節(jié)至5. 0-8. 0，優(yōu)選5. 5-7. 0，進一步優(yōu)選6. 0 ；(b)向水體中加入第一方面所述的真菌、如第二方面所述的菌劑或如第四方面所述的鉛離子處理劑，于10-35°C，優(yōu)選15-30°C，進一步優(yōu)選20°C，震蕩4_8小時，優(yōu)選5_7小時，進一步優(yōu)選6小時，震蕩速度150-220rpm，優(yōu)選地160_200rpm，最優(yōu)選地180rpm ；(c)靜置8-16小時，優(yōu)選地10-14小時，最優(yōu)選地12小時。在本發(fā)明的處理含銅廢水的方法中，含銅廢水的pH值可以為5. 0,5. 5,5. 8,5. 9、
6.0,6. 1,6. 2,6. 5,7. 0,7. 5 或 8. 0 ;處理溫度可以為 10 °C、11 °C、12 °C、13 °C、14 °C、15 °C、16 °C、17 °C、18 °C >19 °C >20 °C >21 °C >22 °C >23 °C >24 °C >25 °C >26 °C >27 °C >28 °C >29 °C >30 °C、31°C、32°C、33°C、34°C*35°C ;震蕩時間可以為4小時、4. 5小時、5小時、5. 5小時、6小時、6. 5小時、7小時、7. 5小時或8小時；震蕩速度可以為150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190卬111、200印111、210卬111或220卬111;靜置時間可以為8小時、8. 5小時、9小時、9. 5小時、10小時、10. 5小時、11小時、11. 5小時、12小時、12. 5小時、13小時、13. 5小時或14小時。在本發(fā)明的處理含銅廢水的方法中，所述含銅廢水中銅離子的濃度可為50mg/L以下、優(yōu)選地為5_30mg/L,最優(yōu)選地濃度為10_20mg/L,包括5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L 和 50mg/Lo在本發(fā)明的處理含銅廢水的方法中，所述處理可為去除或回收所述含銅廢水中的銅離子。在本發(fā)明的處理含銅廢水的方法中，所述含銅廢水可來源于電鍍、冶煉、鑄造、農(nóng)藥、采礦、染料、石油、電池、機械、化工、印染、電子材料、染料行業(yè)排放的工業(yè)廢水。在本文中，“高密度培養(yǎng)”又稱高密度發(fā)酵，一般指微生物在液體培養(yǎng)中細胞群體密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時的生長。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明利用真菌菌種處理含銅廢水，因為真菌具有比苔蘚等植物大得多的比表面積，因此處理效率明顯提高；同時，本發(fā)明中的菌種是專門耐受高濃度銅離子的，對于銅具有專門性。


圖1是真菌菌株LP-19-3在不同Cu(II)濃度下的生長速率。
具體實施例方式
下面具體實施方式
來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
實施例1真菌菌種的分離。本發(fā)明中的真菌菌種的分離包含以下步驟(I)將取自云南省曲靖市羅平縣受銅礦污染的含有大量的二價銅金屬離子的10克土壤樣品裝入含有90毫升無菌水的三角瓶中；(2)用玻璃珠打散，攪勻，制成土壤懸液；(3)用涂布法將土壤懸液涂布在分離培養(yǎng)基平板上，所述分離培養(yǎng)基的組成為■ 無水醋酸鈉0. 2406g/L，酵母抽提物0. 15g/L，瓊脂15g/L，氯霉素0. lg/L, Cu2+50mg/L，其余為去離子水，且pH=7. 0,120°C高溫高壓滅菌30分鐘；(4)將所涂布的分離培養(yǎng)基在30°C的條件下培養(yǎng)2 4天，獲得單個菌株；(5)將所述單個菌株接入新鮮的所述分離培養(yǎng)基中繼續(xù)進行分離培養(yǎng)，獲得純化 的菌株；(6)對步驟(5)中得到的純化菌株重復步驟(5)的操作3 5次，以確保所得到的菌株為完全純化的單個菌株，獲得本發(fā)明的真菌菌株并且于4°C保存。實施例2菌劑的制備。本發(fā)明中的菌劑的制備包含以下步驟DPetri Dishes培養(yǎng)將已經(jīng)純化的原始菌種(Lecanicillium sp.)在無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基II上，室溫(25°C)條件下培養(yǎng)5天；固體培養(yǎng)基II具有以下組成馬鈴薯浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L，氯霉素0. lg/L ；2)—級種子培養(yǎng)將步驟I)培養(yǎng)的菌種在無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基II，室溫(25°C)條件下培養(yǎng)6天，制得一級種子懸液；液體培養(yǎng)基II具有以下組成馬鈴薯浸粉5g/L,葡萄糖20g/L,氯霉素0. lg/L ；3)二級種子培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基II的體積比為10%的接種量，將一級種子分別接種到2. 5L的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液的總體積為1. 5L，適當曝氣，培養(yǎng)6天，制得二級種子;4)混合發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基II的體積比為15%的接種量，將二級種子接種到IOL的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基總體積為7L，進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌劑。實施例3真菌菌種對銅離子的耐受力測定。在AY固體培養(yǎng)基中分別添加 0、5、10、15、25、50、100mg/L Cu (II)，將 LP-19-3 分別接種于以上不同濃度Cu(II)的培養(yǎng)基上，室溫條件下培養(yǎng)12天后生長情況如圖1。從圖1中可以看出，菌株的菌體生長基本呈現(xiàn)線性的趨勢。Cu2+濃度對于菌株的生長具有非常明顯的影響。當培養(yǎng)基中Cu2+濃度在0-5mg/L的范圍內(nèi)時，菌體生長正常，并未受到Cu2+的影響。但當Cu2+濃度在5-50mg/L時，菌體的生長受到了明顯的抑制，速率明顯降低，一直保持比較緩慢的生長趨勢。但菌株仍能夠耐受該濃度范圍，仍能生長，在生長周期結(jié)束時有2-3cm的菌體直徑。當Cu2+濃度大于100mg/L時，菌株停止生長，即對該濃度范圍不耐受。從上述分析可以得出，總的來說，LP-19-3的生長趨勢與生長時間呈線性的關(guān)系，即菌株菌絲直徑隨時間的增長而增加。培養(yǎng)基中Cu(II)的濃度在10mg/L以下時對菌體的生長幾乎沒有影響，而在10-50mg/L時，菌體的生長受到一定程度的抑制，生長速率有一定趨緩。但總體上菌株LP-19-3對于銅離子具有很高的耐受能力。
實施例4pH對菌株吸附Cu (II)能力的影響配制含有50mg/L Cu(II)的pH值分別為5. 0,6. 0,7. 0,8. 0的溶液，溶液體積為150mL,裝入250mL三角瓶中。分別在這4瓶溶液中添加等量2g的真菌菌體，搖床震蕩時間為5h，震蕩速度180rpm，震蕩后靜置12h。將含菌體的溶液離心(llOOOrpm，5min)，之后取上清液，測定上清液中Cu(II)的濃度。結(jié)果見表I。表I pH對菌 株吸附Cu (II)能力的影響
權(quán)利要求
1.一種真菌LP-19-3 (Peyronellaea pomorum),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年07月04日，保藏號為CGMCC No. 6338。
2.如權(quán)利要求1所述的真菌，其特征在于，所述真菌耐受水溶液中濃度為50mg/L以下的銅離子，優(yōu)選地耐受濃度為10mg/L以下的銅離子，更優(yōu)選地耐受濃度為5mg/L以下的銅離子。
3.一種菌劑，其特征在于，所述菌劑包含如權(quán)利要求1或2所述的真菌。
4.如權(quán)利要求3所述的菌劑的制備方法，其特征在于，所述方法包括a)培養(yǎng)皿培養(yǎng)將如權(quán)利要求1或2所述的真菌的菌種在無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，20-30°C，優(yōu)選22-28°C，進一步優(yōu)選25°C下培養(yǎng)4_6天，優(yōu)選4. 4-5. 5天，進一步優(yōu)選5天；固體培養(yǎng)基具有以下組成馬鈴薯浸粉4-6g/L，優(yōu)選4. 5-5. 5g/L，進一步優(yōu)選 5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，優(yōu)選17-23g/L，進一步優(yōu)選20g/L ;瓊脂13_18g/L，優(yōu)選 14-17g/L，進一步優(yōu)選 16g/L ;氯霉素 O. lg/L ；b)—級種子培養(yǎng)將步驟a)培養(yǎng)的菌種在無菌條件下接種于液體培養(yǎng)基，20-300C，優(yōu)選22-28 °C，進一步優(yōu)選25°C下培養(yǎng)5_7天，優(yōu)選地5. 5-6. 5天，更優(yōu)選地6天，制得一級種子；液體培養(yǎng)基具有以下組成馬鈴薯浸粉4-6g/L，優(yōu)選4. 5-5. 5g/L，進一步優(yōu)選5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，優(yōu)選17-23g/L，進一步優(yōu)選20g/L ;氯霉素O. lg/L ；c)二級種子培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5-15%，優(yōu)選8-12%，更優(yōu)選10%的接種量， 將所述一級種子接種到發(fā)酵罐中，曝氣，培養(yǎng)5-7天，優(yōu)選5. 5-6. 5天，進一步優(yōu)選6天，制得二級種子；d)混合發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為10-20%，優(yōu)選12-18%，更優(yōu)選15%的接種量，將二級種子接種到發(fā)酵罐中，進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌劑。
5.一種銅離子處理劑，其特征在于，所述銅離子處理劑包含如權(quán)利要求1所述的真菌， 優(yōu)選地，所述處理為去除或回收。
6.一種處理含銅廢水的方法，其特征在于，所述方法包括將如權(quán)利要求1或2所述的真菌、如權(quán)利要求3所述的菌劑或如權(quán)利要求5所述的銅離子處理劑與所述含銅廢水接觸。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括Ca)將含銅廢水的pH值調(diào)節(jié)至5. 0-8. 0，優(yōu)選5. 5_7，進一步優(yōu)選6. O ；(b)向水體中加入權(quán)利要求1或2所述的真菌、如權(quán)利要求3所述的菌劑或如權(quán)利要求5所述的銅離子處理劑，于10-35°C，優(yōu)選15-30°C，進一步優(yōu)選20°C，震蕩4_8小時，優(yōu)選 5-7小時，進一步優(yōu)選6小時，震蕩速度150-220rpm，優(yōu)選160_200rpm，進一步優(yōu)選180rpm ；(c)靜置8-16小時，優(yōu)選10-14小時，進一步優(yōu)選12小時。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述含銅廢水中銅離子的濃度為50mg/L以下、 優(yōu)選為5-30mg/L,最優(yōu)選濃度為10-20mg/L。
9.如權(quán)利要求6至8中任一項所述的方法，其中所述處理為去除或回收所述含銅廢水中的銅離子。
10.如權(quán)利要求6至9中任一項所述的方法，其中所述含銅廢水來源于電鍍、冶煉、鑄造、農(nóng)藥、采礦、染料、石油、電池、機械、化工、印染、電子材料和/或染料行業(yè)排放的工業(yè)廢水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能夠去除或回收水中銅離子的真菌菌種LP-19-3及其菌劑，含有所述菌種或菌劑的銅離子處理劑以及處理含銅廢水的方法。本發(fā)明真菌菌種LP-19-3具有比苔蘚等植物大得多的比表面積，因此對含銅廢水的處理效率明顯提高；同時，本發(fā)明中的菌種是專門耐受高濃度銅離子的，對于銅具有專門性。
文檔編號C12R1/645GK102994393SQ201210311648
公開日2013年3月27日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者孫璐, 姚一夫, 朱彤, 宋寶華, 王倆, 張梅華, 黃惠, 李 雨, 叢海揚, 張翔宇 申請人:中節(jié)能六合天融環(huán)?？萍加邢薰?br>