專利名稱：一種腐霉屬菌種及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)及其在滅蚊方面的用途。
背景技術：
農(nóng)業(yè)害蟲每年給人類的農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)帶來嚴重的損失。衛(wèi)生害蟲不但騷擾人群，而且可以傳播疾病，威脅人類健康。由于化學農(nóng)藥的發(fā)明，人們從蟲口里奪回了糧食，也控制了媒介昆蟲的數(shù)量，減少了蟲媒傳染病的流行。
然而長期大量使用化學殺蟲劑帶來了嚴重問題。1)環(huán)境污染由于化學農(nóng)藥多數(shù)不溶于水，進入動、植物體內不易排除，越是高等的動物，農(nóng)藥成分越容易在體內富集(積累到很高的濃度)，對身體造成危害。農(nóng)藥中的重金屬殘留在土壤中，造成土地變質，農(nóng)業(yè)減產(chǎn)；農(nóng)產(chǎn)品殘毒含量高，出口受阻；2)生態(tài)平衡被破壞經(jīng)過長期進化和相互適應，自然界各種生物的相對數(shù)量達到動態(tài)平衡。使用化學農(nóng)藥，把害蟲和益蟲全殺死，使自然界控制害蟲的天敵大大減少，害蟲數(shù)量反彈，造成更大的危害；3)害蟲產(chǎn)生抗藥性昆蟲基因有很強的突變能力。在化學農(nóng)藥的誘導下，昆蟲很快就產(chǎn)生抵抗農(nóng)藥毒性的能力，使農(nóng)藥施用的劑量越來越大，甚至農(nóng)藥完全失效。一般來說，一種新農(nóng)藥使用2年，害蟲就產(chǎn)生明顯抗藥性。而開發(fā)新的化學殺蟲劑要花大量資金和時間(把統(tǒng)計，約1億美元和10年時間開發(fā)一種新農(nóng)藥)。
生物防治是采用害蟲天敵或可對害蟲致病的微生物來控制或殺滅害蟲。它有對害蟲高度特異性，對非靶生物無毒無害，不污染環(huán)境，不破壞生態(tài)平衡，不易誘導害蟲的抗藥性的優(yōu)點，所以，是很理想的害蟲防治方法。無論國際國內，農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治較之醫(yī)學昆蟲的生物防治要發(fā)達很多。醫(yī)學昆蟲的生物防治是薄弱環(huán)節(jié)。到目前為止，市場上尚沒有滅蚊真菌的商品。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點而提供的一種新的腐霉屬菌種-貴陽腐霉(Pythium guiyangense Su)。
本發(fā)明的另一目的在于提供該腐霉屬菌種在滅蚊方面的用途。
一種腐霉屬菌種，其形態(tài)特征菌落在KPYG培養(yǎng)基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型，有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細，孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產(chǎn)生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現(xiàn)象，孢子囊有時直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產(chǎn)兩個卵孢子的現(xiàn)象，這兩個卵孢子的發(fā)育可以不同步。該菌種已于2005年3月7日提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址武漢大學)保藏。
(一)貴陽腐霉(Pythium guiyangense Su)的分離步驟(1)取貴醫(yī)花園土壤1000克，加自來水10升，置塑料水桶中浸泡，加1000只白紋伊蚊卵于水中；(2)約一周以后，卵孵化成幼蟲，并發(fā)育至三齡，幼蟲大量死亡懸浮于水面下，取死幼蟲，用75％酒精體表消毒，無菌蒸餾水清洗3次，然后置于KPYG2(成分見后)瓊脂培養(yǎng)基上，每平板中央放1只死幼蟲，將接種后的平板置25℃培養(yǎng)；(3)2～3天后有大量菌絲從幼蟲體內長出，菌落在KPYG培養(yǎng)基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型。有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細；孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，卵形和梨形的孢子囊，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產(chǎn)生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現(xiàn)象，孢子囊有時直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產(chǎn)兩個卵孢子的現(xiàn)象，這兩個卵孢子的發(fā)育可以不同步；(4)無菌條件下，切取帶菌絲的瓊脂塊轉種至新KPYG2或SFE瓊脂培養(yǎng)基上；(5)反復從平板上切取純的菌絲轉種，最后就得到純化的貴陽腐霉。
(二)培養(yǎng)貴陽腐霉采用的瓊脂培養(yǎng)基KPYG2瓊脂培養(yǎng)基將1.5克蛋白胨、1.5克酵母粉、3.0克葡萄糖、0.025克膽固醇、0.11克無水氯化鈣、1.0克玉米油加入水中，加水至1000毫升。
SFE(葵花籽培養(yǎng)基)生葵花籽100克加水1000毫升，粉碎，6層紗布過濾，濾液再加水至2000毫升；分裝冷凍于-20℃。用時，取出解凍，加水一倍即可以上為液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基需按1.5％加瓊脂。高溫高壓消毒后倒在培養(yǎng)皿中，冷卻即可。
(三)菌種的保種和傳代保種用的培養(yǎng)基為KPYG2或SFE兩種培養(yǎng)基中的一種。
保存方法有3種(1)每周一次，從已長滿的平板上切取一塊帶菌絲的瓊脂培養(yǎng)基塊轉種到新的平板上。
(2)用15×200mm的試管，盛瓊脂培養(yǎng)基5ml，做成斜面，接種真菌，25℃培養(yǎng)2～3天，倒10ml左右滅菌石蠟油覆蓋其上，置25℃保存。3個月轉種一次。
(3)水保存法。用10×100mm帶蓋試管，加蒸餾水3ml，亞麻籽3粒，高溫消毒，冷卻，無菌條件下取2帶菌絲的瓊脂塊(約50mm2)加于其中，加蓋，置25℃，半年轉種一次。
(四)菌種的生態(tài)特征菌落在KPYG培養(yǎng)基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型。有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細；孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，卵形和梨形的孢子囊，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產(chǎn)生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現(xiàn)象，孢子囊有時直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產(chǎn)兩個卵孢子的現(xiàn)象，這兩個卵孢子的發(fā)育可以不同步。
(五)菌種的培養(yǎng)特性(1)培養(yǎng)溫度5℃～35℃，最適溫度25℃～27℃；(2)培養(yǎng)pH5～12；最佳范圍為9～11。
對照腐霉屬的特征(《中國真菌志)》第55頁)，本真菌按形態(tài)結構應該屬于腐霉屬。由于其綜合特征與已經(jīng)描述的腐霉屬真菌有明顯的不同，因此應該是尚未認識的新種，特根據(jù)首先發(fā)現(xiàn)的地名命名為貴陽腐霉(Pythiumguiyangense Su)。
本發(fā)明的貴陽腐霉對對溫度、pH等自然環(huán)境條件的適應范圍廣，對不良環(huán)境的耐受力強，容易培養(yǎng)和保存及工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低，滅蚊效果好，經(jīng)多種動、植物測試證實其無毒無害，對非靶生物是安全的。不污染環(huán)境，不破壞生態(tài)平衡。
具體實施例方式
本發(fā)明的腐霉屬菌種貴陽腐霉(Pythium guiyangense Su)的分離方法(1)取貴醫(yī)花園土壤1000克，加自來水10升，置塑料水桶中浸泡，加1000只白紋伊蚊卵于水中；(2)約一周以后，卵孵化成幼蟲，并發(fā)育至三齡，幼蟲大量死亡懸浮于水面下，取死幼蟲，用75％酒精體表消毒，無菌蒸餾水清洗3次，然后置于KPYG2瓊脂培養(yǎng)基上，每平板中央放1只死幼蟲，將接種后的平板置25℃培養(yǎng)；(3)2～3天后有大量菌絲從幼蟲體內長出，菌落在KPYG培養(yǎng)基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型。有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細；孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，卵形和梨形的孢子囊，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產(chǎn)生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現(xiàn)象，孢子囊有時直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產(chǎn)兩個卵孢子的現(xiàn)象，這兩個卵孢子的發(fā)育可以不同步；(4)無菌條件下，切取帶菌絲的瓊脂塊轉種至新SFE瓊脂培養(yǎng)基上；(5)反復從平板上切取純的菌絲轉種，最后就得到純化的貴陽腐霉。
取在SFE瓊脂培養(yǎng)基上生長6天的貴陽腐霉，用打孔器(為了保證瓊脂塊的面積規(guī)范)取帶菌絲瓊脂塊，每塊面積約200mm2，取容積為200ml的白色塑料杯，每杯盛自來水100ml，加瓊脂塊2塊，2～3齡蚊幼蟲25只，4％兔肝粉懸液3滴。每一實驗組設3～4杯，并設對照組(3～4杯)。對照組的杯中所加之物，除沒有真菌外，其余與實驗組同。
實驗溫度16～25℃。每天觀察2次，取出死亡蚊幼蟲，顯微鏡下觀察有無菌絲從體內長出。有菌絲者為被感染。記錄死亡數(shù)及感染數(shù)，計算死亡率和感染率。相關數(shù)據(jù)見表1-6。
表1 不同培養(yǎng)基上的貴陽腐霉培養(yǎng)物對致倦庫蚊幼蟲的感染率(％)

注帶有相同字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異，檢驗水準α＝0.05。
表2 含不同碳源的培養(yǎng)基上的貴陽腐霉培養(yǎng)物對致倦庫蚊幼蟲的感染率(％)

注帶有相同字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異，檢驗水準α＝0.05。
表3 不同pH值培養(yǎng)基上的貴陽腐霉培養(yǎng)物對致倦庫蚊幼蟲的感染率(％)


注帶有相同字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異，檢驗水準α＝0.05。
表4 不同光照條件下貴陽腐霉培養(yǎng)物對致倦庫蚊幼蟲的感染(％)

注帶有相同字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異，檢驗水準α＝0.05。
表5 所采集的蚊幼蟲分類鑒定情況及被貴陽腐霉感染情況(已鑒定到種的部分蚊蟲)

表6 所采集的蚊幼蟲分類鑒定情況及被貴陽腐霉感染情況(未能鑒定到種的部分)

結論已觀察的七種天然或人工培養(yǎng)基(KPYG2、PYG、SFE、SDAY、CMA、CAP、PDA)都可以培養(yǎng)。其中按菌絲生長率和真菌對蚊蟲的毒力綜合考慮，SFE是最佳培養(yǎng)基；光照周期對真菌的生長和滅蚊能力沒有明顯影響，但紫外光對菌絲生長和游動孢子有抑制作用。菌絲生長對碳源要求不嚴格，在葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇及可溶性淀粉分別作為碳源的情況下，菌絲生長速度，產(chǎn)孢量和滅蚊能力沒有顯著差異；在七種氮源中即蛋白胨、酵母浸膏、硝酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫銨及尿素，用有機氮做氮源時，菌絲生長速度，產(chǎn)孢量和滅蚊能力明顯優(yōu)于無機氮做氮源的培養(yǎng)基。
用SFE培養(yǎng)基取得了較好的滅蚊效果，并且是針對庫蚊，特別是對三帶喙庫蚊(流行性乙型腦炎的傳播媒介)的殺滅效果好。用KPYG2培養(yǎng)基的滅蚊率比較低。
權利要求
1.一種腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)，其特征在于菌落在KPYG培養(yǎng)基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型。有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細，孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產(chǎn)生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現(xiàn)象，孢子囊有時直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產(chǎn)兩個卵孢子的現(xiàn)象，這兩個卵孢子的發(fā)育可以不同步。
2.如權利要求1所述的腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)，其特征在于培養(yǎng)溫度為5℃～35℃，培養(yǎng)pH5～12。
3.如權利要求1或2所述的腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)，其特征在于培養(yǎng)溫度為25℃～27℃，培養(yǎng)pH為9～11。
4.一種腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)在來滅蚊方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腐霉屬菌種(Pyghiumguiyangense Su)及其用途，該菌形成的菌落在KPYG培養(yǎng)基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型，有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細，孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產(chǎn)生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現(xiàn)象，孢子囊有時直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產(chǎn)兩個卵孢子的現(xiàn)象，這兩個卵孢子的發(fā)育可以不同步。該菌對自然環(huán)境條件的適應范圍廣，容易培養(yǎng)和保存，滅蚊效果好，不污染環(huán)境，不破壞生態(tài)平衡。
文檔編號C12N1/14GK1673347SQ20051000302
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權日2005年3月18日
發(fā)明者蘇曉慶 申請人:貴陽醫(yī)學院