專利名稱：一種根際促生菌sxh-2及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物促生菌技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種根際促生菌SXH-2及其應用。
背景技術(shù)：
韭菜(Alliumtuberosum Rottl. ex Spr.)為百合科蔥屬(Allium tuberosum)的多年生宿根植物，原產(chǎn)中國，國內(nèi)各地均有栽培。韭菜富含維生素及各種礦物質(zhì)，并且因含有多種硫醚而具有特殊芳香味，可增進食欲，并有一定的藥用價值。它的種子和葉等可入藥。具健胃、提神、止汗固澀、補腎助陽、固精等功效。在中醫(yī)里，韭菜有ー個很響亮的名字 叫“壯陽草”，還有人把韭菜稱為“洗腸草”，不但如此，韭菜還有很多名字。韭菜還叫草鐘乳、起陽草、長生草，又稱扁菜。由于其ロ感佳，味道鮮美所以受到大家的喜愛，尤其在春節(jié)前更是備受追棒，故而是ー種經(jīng)濟植物。但種植韭菜需要使用大量化肥，這不僅影響了韭菜的品質(zhì)，也破壞了土壤環(huán)境，并且隨著化肥的大量使用，其利用率不斷降低已是眾所周知的事實。這說明，僅靠大量增施化肥來提高韭菜產(chǎn)量是有限的。為此各國科學家一直在努力探索提高化肥利用率達到平衡施月巴、合理施肥以克服其弊端的途徑。微生物肥料在解決這方面問題上有獨到的作用。所以，根據(jù)我國作物種類和土壌條件，采用微生物肥料與化肥配合施用，既能保證增產(chǎn)，又減少了化肥使用量，降低成本，同時還能改善土壌及作物品質(zhì)，減少污染。微生物肥料是指ー類含有活微生物的特定制品，應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，能夠獲得特定的肥料效應。在這種效應的產(chǎn)生過程中，制品中活微生物起關(guān)鍵作用。目前一般將微生物肥料制品分為兩大類ー類是狹義的微生物肥料，指通過微生物的生命活動，増加了植物營養(yǎng)元素的供應量，包括土壌和生產(chǎn)環(huán)境中植物營養(yǎng)元素的供應總量，導致植物營養(yǎng)狀況的改善，進而產(chǎn)量増加，這ー類微生物肥料的代表品種是根瘤菌肥；另ー類是廣義的微生物肥料，指通過其中的微生物的生命活動，不但能提高植物營養(yǎng)元素的供應量，還能產(chǎn)生植物生長激素，促進植物對營養(yǎng)元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，減輕農(nóng)作物病蟲害而促進作物產(chǎn)量的増加。與化學肥料相比具有以下特點不破壞土壤結(jié)構(gòu)、保護生態(tài)、不污染環(huán)境，對人、畜和植物無毒無害；肥效持久；提高作物產(chǎn)量和改進作物產(chǎn)品品質(zhì)；成本低廉。近年來，有關(guān)植物根際促生細菌(PGPR)的研究日益受到人們的關(guān)注。由于化肥、農(nóng)藥對環(huán)境造成嚴重污染，化肥價格高漲，能源緊缺，澳大利亞、美國、歐共體組織和日本等國，都開展了 PGPR的專項研究。1988 1997年已分別在加拿大、瑞士、澳大利亞和日本召開了四次國際研討會，并將繼續(xù)3年一屆輪流在世界各大洲舉行。表明PGPR研究和應用已成為當前農(nóng)業(yè)微生物研究的新熱點之一，與它有關(guān)的方面正在形成ー個新的領(lǐng)域。作為微生物肥料的PGPR能直接為宿主植物提供營養(yǎng)或間接為宿主植物根部的生長提供積極的作用，或者幫助宿主植物與其它共生體形成有益的共生關(guān)系
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種根際促生菌SXH-2及其應用，該菌是一種新的植物促生菌，可應用于植物促生劑或微生物肥料的制備。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種根際促生菌SXH-2，其分類命名為產(chǎn)酸克雷伯菌SXH-2 (Klebsiellaoxytoca)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 6297該菌能夠在胞內(nèi)合成ACC脫氨酶，在好氧條件下將ACC作為唯一氮源進行生長，同時將其分解。進一步，還具有以下特征該菌能夠合成吲哚乙酸。
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該菌能夠合成嗜鐵素。該菌具有溶磷性。所述的根際促生菌SXH-2在促植物生長的應用。具體的包括所述在制備促植物生長的制劑的應用。所述的制劑為抑制ACC生成的制劑、促吲哚乙酸合成的制劑、促嗜鐵素合成的制齊U、促磷吸收的制劑中的一種或幾種。在制備促韭菜生長的制劑的應用。所述的制劑為微生物菌劑或微生物肥料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的產(chǎn)酸克雷伯菌SXH-2，是以ACC作為唯一 N源的培養(yǎng)基對從韭菜的根際土中的微生物進行篩選分離，得到的能夠以ACC作為唯一 N源生長的微生物，檢測結(jié)果表明該菌是一種能夠合成ACC脫氨酶的新的產(chǎn)酸克雷伯菌，分類命名為Klebsiellaoxytoca。本發(fā)明提供的產(chǎn)酸克雷伯菌SXH-2，由于其合成ACC脫氨酶，所有能夠抑制植物體內(nèi)ACC的合成，進而降低由于環(huán)境脅迫所導致植物體內(nèi)乙烯的大量積累，從而提高其抗逆性。本發(fā)明提供的產(chǎn)酸克雷伯菌SXH-2，還能夠合成吲哚乙酸和嗜鐵素，而且還具有溶磷作用，從而能夠幫助植物提供吲哚乙酸及鐵元素，促進磷的吸收，從而起到促植物生長的作用。因此，雖然該菌是從韭菜根基土中所篩選分離到的，由于上述作用所具有的促植物生長的共性，所以該菌還能夠作為一種廣泛的促生菌應用于其他植物當中。本發(fā)明提供的產(chǎn)酸克雷伯菌SXH-2，對韭菜的株高具有顯著的促進作用。經(jīng)產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2處理的韭菜,在14天時，與對照相比，株高增加73. 18%。產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2活菌對韭菜的植株鮮重及干重、具有顯著的促進作用。經(jīng)產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)SXH_2處理的韭菜,與對照相比，植株鮮重增加230. 26%，干重增加179. 13%。保藏說明本發(fā)明所述的產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2進行了下述保藏保藏時間2012年6月26日，保藏地點北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC ;保藏號為 CGMCC NO. 6297。


圖I為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2在ADF培養(yǎng)基上的生長狀況。圖2為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2合成的生長激素含量。圖3為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2嗜鐵素圈的圖片。圖4為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2溶磷圈的圖片。圖5為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2對韭菜促生14天時株高。圖6為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2對韭菜促生14天時鮮重(10 株)比較。圖7為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2對韭菜促生14天時干重(10株)比較。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2的分離和鑒定I、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2 的分離產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2的分離包括取樣,篩選和純化兩個步驟，具體方法如下I. I、取樣從韭菜的根際土中進行篩選，具體的供試韭菜及土壤取于黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)雙井鎮(zhèn)(土壤理化性質(zhì)如下pH 8. 15,全鹽含量I. 83%,堿解氮36mg/kg,有效磷8mg/kg,速效132mg/kg,有機質(zhì)2. 69%)。將韭菜及植物根際土壤裝入事先準備好的干凈保鮮袋中，帶回實驗室種植待測。稱取Ig根際土樣于含50mL PAF培養(yǎng)液的三角瓶中，室溫(21 士 1°C )振蕩培養(yǎng)(200r/min)24h。然后，轉(zhuǎn)移ImL菌懸液至另一 50mL PAF培養(yǎng)液中，同等條件下培養(yǎng)24h。第3天，從PAF培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移ImL菌懸液至50mL DF培養(yǎng)液中，相同條件下培養(yǎng)24h。第4天，再轉(zhuǎn)移ImL菌懸液至50mL ADF培養(yǎng)液中，相同條件下培養(yǎng)48h，用于含ACC脫氨酶活性細菌的分離純化。I. 2、篩選和純化(I)取Ig根際土樣于50mL PAF培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)24小時。該PAF培養(yǎng)基中。PAF培養(yǎng)基含有蛋白胨10g，酪蛋白水解物10g，MgSO4L 5g, K2HPO4L 5g，甘油10ml，(1L量ΡΗ=7· 5)具體參照Penrose D M, Glick B R. Methods for isolating and characterizingACC deaminase-containing plant growth-promoting rhizobacteria[J]. PhysiologiaPlantarum, 2003，118(1) :10-15 來配制。
(2)取ImL上述(I)震蕩后的PAF培養(yǎng)液(混懸液)，于50mL PAF培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)24小吋。(3)取ImL上述(2)得到的PAF培養(yǎng)液，于50mL DF鹽培養(yǎng)液中，28°C振蕩培養(yǎng)24小時。該 DF 鹽培養(yǎng)液含有 KH2P044g, Na2HP046g, MgSO4 · 7H20 O. 2g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 Img，葡萄糖2g，葡萄糖酸 2g，檸檬酸 2g，(NH4) 2S042g,微量元素 0. Iml (100ml 量 H3BO3IOmg, MnSO4I I. 2mg，ZnS04124. 6mg, CuS0478. 2mg, MoO3IOmg)。(4)取ImL上述(3)得到的DF鹽培養(yǎng) 液，于50mL不含(NH4)2S04，但含有3mM I-氨基環(huán)丙烷-I-羧酸(ACC)的DF鹽培養(yǎng)液中(即以ACC作為唯一 N源)，28°C振蕩培養(yǎng)24小時。(5)取ImL上述(4)得到的培養(yǎng)液，涂布于含3mM ACC的ADF鹽瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)；48小時時間長出菌落。(6)取上述(5)培養(yǎng)基上生長的菌落，在ADF培養(yǎng)基上劃線純化，得到單ー菌落。這樣經(jīng)過以ACC作為唯一 N源的培養(yǎng)基對根際土中能夠利用其作為N源生長的細菌進行篩選，從而得到了單ー菌落(純培養(yǎng)物)。2、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2 的鑒定對上述分離純化得到的純培養(yǎng)菌株進行一系列生理生化鑒定，并進行DNA提取，16S rDNA的擴增和測序。2. I該菌株在ADF培養(yǎng)基上形成圓形、半透明、乳白色、突起光滑、邊緣整齊、有粘性的菌落，如圖I所示。鏡檢顯示器無鞭毛，有莢膜，屬革蘭氏陰性菌。2. 2利用引物F8和R1541進行擴增16S rDNA，引物序列如下F8/20 5,AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3/ ，R1541/20 :5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3。PCR 擴增條件為94°C 3min ；94°C 30s，55°C 30s, 72 °C 90s，30 個循環(huán)；72 °CIOmin0對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果如SEQ. ID. NO. I所示。將上述獲得的純培養(yǎng)菌株中的一株命名為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)SXH-2，并將其保藏，保藏號為CGMCC No. 6297。 實施例2、CGMCC No. 6297的ACC脫氨酶活性測定供試菌株在TSB培養(yǎng)液(胰蛋白胨17. Og,大豆胨3. 0g, NaCl 5. 0g，葡萄糖2. 5g，K2HP042. 5g，蒸餾水lOOOmL，pH 7. 5)中過夜培養(yǎng)，4°C離心收集菌體。菌體細胞用DF培養(yǎng)液洗滌三次，重新懸浮于ADF培養(yǎng)液，室溫(21 士 1°C)振蕩培養(yǎng)2天后，4°C離心收集菌體，用O. Imol ·じ1Tris-HCl緩沖液(pH=7. 6)洗滌離心三次，重懸浮于600 μ L
O.Imol ·じ1Tris-HCl緩沖液(ρΗ=8. 0)中，加入30 μ L甲苯并迅速振蕩30s以破碎細胞，轉(zhuǎn)移200 μ L含甲苯的細胞提取物至I. 5mL離心管中，加入20 μ L 0. 5mol ·じ1ACC混勻，同時做不添加ACC的空白試驗，30°C培養(yǎng)15min。添加ImL 0. 56mol じ1HC1，16000g離心5min,取ImL懸浮液至試管中，加入800 μ L 0. 56mol じ1HCl和300 μ L 2，4-ニ硝基苯肼，30°C孵育 30min，加入 2mL 2mol ·じ1NaOH，540nm 波長測吸光度。以 ImL 濃度為 0,0. 1,0. 3,0. 7、I和2 μ mol ·じ1的α - 丁酮酸為標準液,測540nm波長下吸光值。蛋白質(zhì)測定采用BioRad蛋白質(zhì)微量測定法，以牛血清白蛋白為蛋白質(zhì)(Pr)標準。ACC脫氨酶的活性以在測酶體系中每毫克蛋白每小時形成α-丁酮酸的量表示，單位為μ mol a -RA · (mgPr · h)'酶活性測定均扣除樣品對照空白后計算，重復3次。采用α - 丁酮酸標準品代替以上細胞提取物進行步驟4的實驗組相同的實驗并制作標準曲線，標準曲線方程(方程甲)如下y=192x-l. 7864，R2=O. 9713，x代表OD54tlnm數(shù)值，Y 代表 a- 丁酮酸(μ mol/L)。根據(jù)制作標準曲線和檢測結(jié)果，即可獲得ACC脫氨酶活性的活性。檢測結(jié)果表明CGMCC NO. 6297的細胞破碎物中具有ACC脫氨酶活性，酶活性最高可達
O.227 μ mol a -KA · (mg Pr · h) ―1，這表明 CGMCC NO. 6289 能夠胞內(nèi)合成 ACC 脫氨酶。ACC是乙烯合成的前體，乙烯的過多存在會抑制植物的生長，而ACC脫氨酶的存在卻可以減少ACC的存在，從而減少乙烯的生成，近而促進植物生長。實施例3、CGMCC NO. 6297生長激素IAA合成含量的測定 供試菌株產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2先在DF培養(yǎng)液中培養(yǎng)2d，再微量轉(zhuǎn)入添加不同濃度色氨酸(L-Trp)的DF培養(yǎng)液(含0、50、100、200和500 μ gL-Trp -πιΓ1)中繼續(xù)培養(yǎng)2d，取樣測菌液OD6tltl,其余培養(yǎng)液室溫下8000g離心，取500 μ L上清液，添加 2mL Salkowski 試劑(含 150mL H2SO4,250mL ddH20 和 7. 5mL 0. 5mol/L FeCl3),室溫黑暗培養(yǎng)20min后，在535nm處測吸光度(OD535)。無菌培養(yǎng)基同上做相同的處理作為對照調(diào)零。以濃度為0、0. 01,0. 05,0. 25,0. 5mg πιΓ1的IAA標準液同方法做標準曲線。IAA含量單位為yg· (mL * OD600)-1 , IAA標準曲線平行2次，樣品重復3次。標準曲線方程如下y=0. 0784x-0. 0139，R2=O. 9792，x 代表 OD535nm 數(shù)值，y 代表 IAA 濃度(μ g · mL-1)。根據(jù)制作標準曲線和檢測結(jié)果，即可獲得CGMCC NO. 6297的IAA合成量；而且檢測結(jié)果還表明，產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2能夠利用色氨酸產(chǎn)生Π引哚乙酸，而且隨著L-Trp濃度的不同,產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2的卩引哚乙酸合成量也隨之增加，如圖2所示，產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2的IAA合成量在L-Trp濃度為500 μ g · mL—1范圍內(nèi)與L-Trp的增加成正比。CGMCC NO. 6297以色氨酸(L-Trp)為前體合成植物生長激素吲哚乙酸(IAA)，由于其吸附在種子和根的表面，從而被植物所利用，同時也可以和植物內(nèi)生的IAA共同作用刺激植物細胞生長和增殖，可促進植物根系的生長發(fā)育及有效吸收土壤中的水分和養(yǎng)分，同時對植物的其他生命活動進行調(diào)節(jié)。實施例4、CGMCC NO. 6297的嗜鐵素合成量測定絡(luò)天青CAS (chrome azurol S)培養(yǎng)基的配制A :藍色染液a. 0. 06gCAS 溶于 50ml 去離子水。b. 0. 0027g FeCl ·6Η20 溶于 10ml, IOmMHCl (36%的濃HCl濃度為11. 6mol/L,配10ml IOmM需濃HCl 8. 6 μ I)用去離子水。C. 0. 073gHDTMA (CTAB)溶于40ml去離子水。a與9ml b混合，再混合c，此時為藍色，高溫滅菌，(121°C20min)B :混合液A MM9 15g KH2PO4, 25g NaCl, 50g NH4Cl 溶于 500ml 去離子水(0. 6gKH2P04, IgNaCl, 2g NH4C1,溶于20ml去離子水中)，b. 20%葡萄糖溶液，110°C單獨滅菌，20g溶于IOOml去離子水，c. NaOH溶液，25g NaOH溶于150ml去離子水，PH約為12，(5g NaOH溶于30ml)d.酪蛋白水解物溶液濾膜過濾。3g酪蛋白水解物溶于27ml去離子水，c. CAS瓊脂板準備(IL量)a. 100mlMM9加到 750ml 去離子水,b.溶解 32.24g piperazine-N, N' -bis (2-ethanesulfonic acid) PIPES (6. 448g PIPES)。c.加入細菌培養(yǎng)用瓊脂 15g。d.高溫滅菌(121°C，20min),冷卻到50°C。e.加入30ml過濾滅菌的水解酪蛋白，IOml 20%的葡萄糖溶液到MM9/PIPES混合液中(6ml+2ml)。f.緩慢加入，IOOml (藍色染液，沿玻璃瓶壁加入，充分混勻)。g.倒板。將已分離保存的細菌接于鉻天青CAS (chrome azurol S)培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48 72h，觀察菌落周圍的顏色變化，以及產(chǎn)生的橘黃色的透明暈圈的直徑。對其進行嗜鐵素合成定性實驗。將產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)SXH-2接于鉻奧醇CAS (chrome azurol S)固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h，觀察菌落周圍的顏色變化，有橘黃色圈產(chǎn)生即可產(chǎn)生嗜鐵素。結(jié)果表明，在CAS固體培養(yǎng)基上，CGMCC NO. 6297菌落周圍有橘黃色暈圈產(chǎn)生，即產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2可產(chǎn)生嗜鐵素。結(jié)果如圖3所示，其直徑比值為(D/d) I.593。
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CAS檢測液的配制①IOmM HDTMACCTAB)50ml: 0. 182g 溶于 50ml 去離子水。② IOmM HC120ml:17. 2ul濃 HCl 定溶至Ij 20ml ImM FeCl · 6H20 20ml:0. 0054g 溶于 20mlIOmM HCl 中，得到 Fe3+溶液。③2mM CAS 50ml:0. 0605g溶于50ml去離子水。④I. 5ml②與7. 5ml③混合，再與6ml①混合，得到混合液④。⑤4. 307gPIPES用去離子水(約20-30ml)溶，加6. 25ml濃HC1，調(diào)PH5. 6 (用NaOH調(diào))。將④與⑤混合，定溶IOOml。將CGMCC 勵.6297的菌液用501111離心管離心，10000卬111/111丨11，IOmin, 28°C。取上清3ml+CAS檢測3ml。反應lh，體積1:1. 0D630測吸光值，樣品值為A。未接種培養(yǎng)基3ml+CAS檢測液3ml。反應lh. OD630為Ar。A/Ar值越小，說明合成嗜鐵素能力越強，低于0. 5最強。結(jié)果表明，產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2的A/Ar值為I. 348，說明其能夠合
成嗜鐵素。嗜鐵素是微生物和部分作物在低鐵應激條件下產(chǎn)生的一種能夠高效率結(jié)合三價鐵離子的低分子量有機化合物。嗜鐵素的能力強弱可以影響植物對三價鐵離子的吸收。這樣CGMCC NO. 6297能通過產(chǎn)生和分泌對鐵具有高親和カ的嗜鐵素，溶解并結(jié)合土壤中的鐵元素供植物細胞利用，増加鐵營養(yǎng)，促進植物生長。實施例5、CGMCC NO. 6297的溶磷性測定溶磷圈用滅過菌的牙簽將菌株點接在NBRIP固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3_5天，測量溶磷圈直徑(D )和菌落直徑(d )。NBRIP 固體培養(yǎng)基 IL 量配制方式葡萄糖 lOg，Ca3(PO4)25g, MgCl25g, MgSO4 · 7H200. 25g, KCl 0. 2g, (MM)2SO4O. Ig，瓊脂 15g，PH=7. 0 110°C滅菌。檢測結(jié)果如圖 4 所示，產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2 的 D/d 值為 1.958。溶磷量將具溶磷性的菌株按1%的接種量接種于NBRIP液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)(170r/min)7天。發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心IOmin,上清含磷量用鑰鋪抗比色法測定。配制方式I)置35ml培養(yǎng)基于200ml三角瓶中，滅菌，搖5天。2)離心后，取上清。3)用比色法測定濾液中的有效磷量。(a)取濾液5-10ml (視濾液中磷含量而定)，置于50ml量瓶中，加入7. 5N硫酸鑰銻抗混合顯色劑5ml，加去離子水定容至刻度，充分搖勻，靜置30min。(b) 30min后在分光光度計比色(波長660nm)，比色時須同時做空白測定。(c)與此同時繪制磷標準曲線，分別吸取5ppm磷酸標準溶液Oml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml于50ml容量瓶中，每一量瓶磷的濃度即為0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5ppm,再個加入7. 5N硫酸鑰銻抗，混合顯色劑5ml，然后與待測液一樣進行比色。繪制標準曲線。(d)結(jié)果計算pmg/100g磷源= (ppmX比色體積X分取倍數(shù))/(培養(yǎng)基中加入磷化合物克數(shù)X 10)，結(jié)果表明，產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) SXH-2的溶磷值為5. 549，溶磷能力較強。這樣CGMCCN0. 6297將有助于植物將土壤中的難溶磷，轉(zhuǎn)換成易于吸收的磷，使植物更易于吸收。實施例6、CGMCC NO. 6297對韭菜的促生效果分別采用兩種方式對韭菜進行促生實驗，一種是采用菌液對韭菜進行浸種實驗；另一種方式是對多年生韭菜進行灌根實驗。為期一個月，期間澆灌一次菌液，觀察澆灌菌液的韭菜的株高，地上鮮重和地上干重與未澆灌菌液的韭菜相比較生長的狀況。用于韭菜促生實驗的土壤取于黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)雙井鎮(zhèn)，采集樣品時在每個區(qū)域內(nèi)設(shè)置5個樣方，樣方面積為1X0. 3m2,收集表層土壤((T20cm), 土壤混合后,裝入事先準備好的干凈保鮮袋中，迅速將土樣帶回實驗室，土壤經(jīng)碾碎，混勻，風干后過篩保存。將CGMCC NO. 6297接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28°C下振蕩培養(yǎng)，4°C離心收集菌體，用無菌水洗滌離心2次后重懸浮于無菌水中，使活菌數(shù)在無菌水中的終濃度達109CFU/mL。將韭菜種子用O. 5%(V/V)次氯酸鈉表面消毒IOmin后用無菌水洗滌，然后用CGMCC NO. 6297浸泡lh，使其附著在種子表面。以不用CGMCC NO. 6297浸泡處理的韭菜種子作為對照(CK)，均勻種在盆中，每盆20株，重復5次，于培養(yǎng)室內(nèi)(25°C)培養(yǎng)，隔天澆水；于七天后澆灌CGMCC NO. 6297菌液(對照正常澆水)，每次(50) ml，每7天一次。于發(fā)芽后14天測定植株高，14天后測量10株植株鮮重及干重、根鮮重及干重。具體的檢測結(jié)果如表I所示表I CGMCC NO. 6297對韭菜的促生效果
權(quán)利要求
1.一種根際促生菌SXH-2，其特征在于，其分類命名為產(chǎn)酸克雷伯菌SXH-2(Klebsiella oxytoca),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏號為 CGMCC No. 6297。
2.如權(quán)利要求I所述的根際促生菌SXH-2，其特征在于，該菌能夠在胞內(nèi)合成ACC脫氨酶，在好氧條件下將ACC作為唯一氮源進行生長，同時將其分解。
3.如權(quán)利要求I所述的根際促生菌SXH-2，其特征在于，該菌能夠合成吲哚乙酸。
4.如權(quán)利要求I所述的根際促生菌SXH-2，其特征在于，該菌能夠合成嗜鐵素。
5.如權(quán)利要求I所述的根際促生菌SXH-2，其特征在于，該菌具有溶磷性。
6.權(quán)利要求I所述的根際促生菌SXH-2在促植物生長的應用。
7.如權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，在制備促植物生長的制劑的應用。
8.如權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述的制劑為抑制ACC生成的制劑、促吲哚乙酸合成的制劑、促嗜鐵素合成的制劑、促磷吸收的制劑中的一種或幾種。
9.如權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，在制備促韭菜生長的制劑的應用。
10.如權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于，所述的制劑為微生物菌劑或微生物肥料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種根際促生菌SXH-2，其分類命名為產(chǎn)酸克雷伯菌SXH-2(Klebsiella oxytoca)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.6297。該菌能夠合成吲哚乙酸和嗜鐵素，而且還具有溶磷作用，從而能夠幫助植物提供吲哚乙酸及鐵元素，促進磷的吸收，從而起到促植物生長的作用。該菌對韭菜的株高、鮮重及干重具有顯著的促進作用。
文檔編號C12P1/04GK102816719SQ201210284750
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月10日
發(fā)明者郭長虹, 史煦涵, 彭玲玲, 蔡洪生, 程園園 申請人:哈爾濱師范大學