專利名稱：一株苜蓿根際促生菌mjm-5及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ー株苜蓿根際促生菌MJM-5及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹽堿土是陸地上分布廣泛的ー種土壤類型，是陸地表面生態(tài)脆弱區(qū)域。目前全世界鹽堿地面積約10億公頃以上，且隨著生態(tài)環(huán)境的日益惡化，土壌次生鹽堿化也日益加劇，影響了農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展，加重了沙漠化、荒漠化程度，已成為世界性環(huán)境問(wèn)題。中國(guó)鹽堿化土地約有0. 12億公頃，占世界鹽堿地面積的I. 2%左右，占中國(guó)現(xiàn)有耕地面積的15%左右，這些地區(qū)植被減少，已經(jīng)成為限制中國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素。鹽堿化土地資源的及時(shí)恢復(fù)和合理利用開(kāi)發(fā)對(duì)推動(dòng)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展具有重大意義。作物耐鹽堿性的提高、鹽堿土的生物治理和綜合開(kāi)發(fā)是未來(lái)農(nóng)業(yè)的重大課題。
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鹽堿脅迫從多方面對(duì)植物整個(gè)生命周期都會(huì)產(chǎn)生影響。鹽堿脅迫能抑制種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)，影響根、莖、葉、花、果實(shí)等器官的生長(zhǎng)發(fā)育，抑制植物的光合作用過(guò)程，影響根系對(duì)礦質(zhì)離子的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分布和利用，干擾植物碳、氮、氧的利用及次生代謝的形成，同時(shí)嚴(yán)重影響植物的呼吸作用，給農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。I-氨基環(huán)丙燒-I-羧酸(l-aminocyclopropane-l-carboxylate, ACC)是植物體內(nèi)こ烯的合成前體，含ACC脫氨酶的植物根際促生細(xì)菌(plant growth-promotingrhizobacteria,簡(jiǎn)稱PGPR)對(duì)植物的促生作用基于細(xì)菌能產(chǎn)生ACC脫氨酶，降低了逆境條件下植物體內(nèi)こ烯積累來(lái)減少植物脅迫，促進(jìn)植物根部生長(zhǎng)和繁殖，從而提高植物抗逆性。同吋，PGPR合成的植物生長(zhǎng)素IAA，能刺激植物細(xì)胞生長(zhǎng)和増殖，還能誘導(dǎo)ACC合成酶的活性。通過(guò)接種PGPR有助于減輕鹽分對(duì)植物產(chǎn)生的不良反應(yīng)，被認(rèn)為是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)有效提高作物產(chǎn)量、改良鹽潰化土壌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5。本發(fā)明提供的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5,其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6293。上述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5在如下1)_4)至少一種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍I)制備ACC脫氨酶；2)制備吲哚こ酸；3)制備嗜鐵素；4)促進(jìn)植物生長(zhǎng)；所述促進(jìn)植物生長(zhǎng)具體在鹽堿脅迫條件下進(jìn)行。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供ー種制備產(chǎn)物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟發(fā)酵上述的突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株MJM-5，即得到產(chǎn)物；所述產(chǎn)物為ACC脫氨酶、吲哚こ酸或嗜鐵素。上述方法中，若所述產(chǎn)物為ACC脫氨酶時(shí)，所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為T(mén)SB培養(yǎng)基和ADF培養(yǎng)基；其中，TSB培養(yǎng)基胰蛋白胨17g、大豆胨3g、NaC15g、葡萄糖2. 5g、K2HP042. 5g溶解到1000ml蒸餾水中，調(diào)整pH值至pH=7. 5。ADF 培養(yǎng)基KH2P044. 0g、Na2HP046 . 0g、MgSO4 7H200. 2g、FeSO4 7H200. lg、葡萄糖2. 0g、葡萄糖酸2. 0g、檸檬酸2. 0g、微量元素0. lmL、加入蒸餾水中溶解后，調(diào)整pH值至pH=7. 5，定容至1000ml，高溫滅菌后加入I-氨基環(huán)丙烷_(kāi)1_羧酸(ACC)，使其終濃度為3. 0mmol/L (可先配制母液 0. 5mol/L);其中，微量元素(IOOmL) =H3BO3IOmg, MnSO4Il. 2mg,ZnS04124. 6mg、CuS0478. 2mg、MoO3IOmg0若所述產(chǎn)物為吲哚こ酸(IAA)時(shí)，所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為DF培養(yǎng)基或含有色氨酸的DF培養(yǎng)基；其中DF培養(yǎng)基KH2P044. 0g、
Na2HP046. 0g、MgS04 7H200. 2g,FeSO4 7H200. lg、葡萄糖 2. 0g、葡萄糖酸 2. 0g、檸檬酸 2. 0g、(NH4)2S042. 0g、微量元素0. lmL、加入蒸餾水中溶解后，調(diào)整pH值至pH=7. 5，定容至1000ml。微量元素配制同上。若所述產(chǎn)物為嗜鐵素時(shí)，所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為MKB培養(yǎng)基，其中MKB培養(yǎng)基(IL):酸解酪蛋白 5g，甘油 15mL, K2HP042. 5g, MgSO4 7H202. 5g, pH7. 20 121°C，20min 滅菌。上述制備ACC脫氨酶的方法包括如下步驟I)在所述TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5，收集菌體，得到培養(yǎng)菌I ;2)將所述培養(yǎng)菌I接種到所述ADF培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體，即得到ACC脫氨酶。在上述制備ACC脫氨酶的方法中，步驟I)中，所述培養(yǎng)條件為28°C，180rpm培養(yǎng)12h ；步驟2)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為28°C，180rpm培養(yǎng)48h。上述制備ACC脫氨酶的方法中還包括如下步驟先將所述菌體、0. lmol/LTris-HCl (pH=8. 5)、甲苯和0. 5mol/L ACC混勻，培養(yǎng)，得到甲苯培養(yǎng)物；再將所述甲苯培養(yǎng)物加入0. 56mol/L HCl混勻，離心收集上清液，得到ACC脫氨酶。在上述制備ACC脫氨酶的方法具體包括如下步驟挑取上述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5于50ml TSB培養(yǎng)基中28°C，180rpm培養(yǎng)12h后，4°C離心收集菌體，用50ml DF培養(yǎng)基洗滌三次，將菌體轉(zhuǎn)接于ADF培養(yǎng)基中28°C，180rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)48h，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)物；將誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)物離心收集菌體，再將菌體懸浮于ImlO. lmol/L Tris-HCl (pH=7. 6)中轉(zhuǎn)移至I. 5ml的離心管中，1600g離心去上清，收集菌體;再重懸菌體于600 ii 10. lmol/LTris-HCl (pH=8. 5)中，加入30 u I甲苯漩渦震蕩30s，得到甲苯細(xì)胞，向甲苯細(xì)胞中加入20iU0. 5mol/L ACC短暫震蕩后，30°C培養(yǎng)15min，之后加入ImlO. 56mol/LHCl混合震蕩室溫(25°C )離心5min，收集上清液，得到ACC脫氨酶。上述制備吲哚こ酸的方法包括如下步驟在所述DF培養(yǎng)基或所述含有色氨酸的DF培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5,收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到吲哚こ酸。上述制備吲哚こ酸的方法中，所述含有色氨酸的DF培養(yǎng)基中色氨酸的終濃度為0-500 u g/mL,且不為 0。上述制備吲哚こ酸的方法中的培養(yǎng)條件為28°C，ISOrpm培養(yǎng)2天；上述制備吲哚こ酸的方法還包括如下步驟將所述發(fā)酵產(chǎn)物離心，收集上清液，得到吲哚こ酸。上述制備吲哚こ酸的方法具體包括如下步驟上述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)單菌落MJM-5于DF液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基中28で，180印111培養(yǎng)2(1，轉(zhuǎn)接到添加不同濃度(0、50、100、200、5001^*111じ1)色氨酸的DF培養(yǎng)基中，280C，180rpm培養(yǎng)2d，收集發(fā)酵產(chǎn)物，然后將發(fā)酵產(chǎn)物8000rpm離心lOmin，收集上清液，得到IAA。上述制備嗜鐵素的方法包括如下步驟在MKB培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5,收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到嗜鐵素。·上述制備嗜鐵素的方法的培養(yǎng)條件為28°C，180rpm培養(yǎng)48h ；上述制備嗜鐵素的方法中還具體包括如下步驟將所述發(fā)酵產(chǎn)物離心，收集上清液，得到嗜鐵素。上述制備嗜鐵素的方法具體包括如下步驟將上述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5接種于MKB培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)(180r min^)48h ;收集發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵產(chǎn)物lOOOrpm、離心IOmin取上
清液，得到嗜鐵素。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟播種前，將植物種子浸泡到上述的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5菌懸液A中；播種后，將上述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5菌懸液B燒灌所述植物；實(shí)現(xiàn)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。上述方法中，所述植物生長(zhǎng)在鹽堿脅迫條件下進(jìn)行；本發(fā)明的實(shí)施例中用的是表I指標(biāo)所示的鹽堿土。所述植物具體為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物進(jìn)ー步具體為小麥或苜蓿。上述促進(jìn)植物生長(zhǎng)體現(xiàn)在提高發(fā)芽率、株高、根長(zhǎng)、地上植株鮮重、地上植株鮮重干重、地下根系鮮重和/或地下根系干重。上述方法中，播種后的菌懸液澆灌植物的根部。上述播種前的菌懸液(菌懸液A)濃度為I X 101(lCfu/ml ;播種后的菌懸液(菌懸液B)濃度為 lX109cfu/ml。上述突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5菌懸液A按照如下方法制備將突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5接種于LB培養(yǎng)基中，于280C，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)24h，收集菌液，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌液濃度為I X 101(lCfu/ml，得到菌懸液A。上述突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5菌懸液B按照如下方法制備用無(wú)菌水調(diào)節(jié)上述菌懸液A至濃度為I XlO9CfuAil，得到菌懸液B。上述促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法具體包括如下步驟播種前，將植物種子預(yù)先用10%(V/V)次氯酸鈉表面消毒IOmin后用無(wú)菌水洗滌三次，浸泡于菌懸液A中處理Ih ;播種后，將菌懸液B均勻澆灌于植物苗根部周圍。上述菌株MJM_5(Pseudomonas fluorescens)于2012年6月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)),保藏號(hào)為CGMCC No. 6293,分類命名為突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明分離得到ー株苜蓿根際促生菌MJM-5，其可以合成ACC脫氨酶、IAA嗜鐵素，而且可在鹽堿脅迫環(huán)境中有效地促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)以及提高植物在逆境條件下抗逆能力，該菌株可應(yīng)用在作物栽培，能夠增進(jìn)肥效，提高產(chǎn)量。


圖I為菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)在ADF培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)圖2為菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)在不同色氛酸濃度下IAA合成含
量圖3為菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)嗜鐵素定性檢測(cè)平板效果4為菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)在鹽堿脅迫下對(duì)苜猜促生效果5為菌株MJM-5 (Pseudomonasfluorescens)在鹽喊脅迫下對(duì)小麥促生效果圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、苜蓿根際促生菌的篩選和鑒定I、篩選取Ig根際土樣于50mL PAF培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)。該P(yáng)AF培養(yǎng)基中含有蛋白胨，酪蛋白水解物，MgSO4, K2HPO4，甘油。取ImL震蕩后的PAF培養(yǎng)液，于50mL PAF培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)。取ImL得到的PAF培養(yǎng)液，于50mL DF鹽培養(yǎng)液中，28°C振蕩培養(yǎng)。該DF鹽培養(yǎng)液含有 KH2PO4, Na2HPO4,MgSO4, FeSO4,葡萄糖，葡萄糖酸，檸檬酸，(NH4) 2S04，H3BO3,MnSO4,ZnSO4, CuSO4, MoO30取ImL得到的DF鹽培養(yǎng)液，于50mL不含(NH4) 2S04，但含有3mMl_氨基環(huán)丙烷-I-羧酸(ACC)的上述DF鹽培養(yǎng)液中，28°C振蕩培養(yǎng)。取ImL得到的培養(yǎng)液，涂布于含3mM ACC的DF鹽瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)。取培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落純化，對(duì)純化后的細(xì)菌進(jìn)行編號(hào)，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到ADF培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆?，命名為MJM-5。2、菌落特征及菌體形態(tài)該菌株MJM-5在ADF培養(yǎng)基(配方見(jiàn)后面)上形成圓形、不透明、淡黃色、突起光滑、邊緣整齊、有粘性的菌落。如圖I所示。3、生理生化特征根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》對(duì)分離出的菌株MJM-5進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶、甲基紅、こ酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、檸檬酸鹽作用生理生化實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)和鑒定。MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)為革蘭氏陰性菌,表現(xiàn)出接觸酶陽(yáng)性,淀粉水解陽(yáng)性，吲哚實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陽(yáng)性，甲基紅、こ酰甲基甲醇、檸檬酸鹽作用實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陰性。4、16S rDNA 序列分析MJM-5的16S rDNA基因序列，見(jiàn)核苷酸序列表I所示。將MJM-5的16S rDNA基因序列與數(shù)Genbank據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,結(jié)果表明MJM_5與Pseudomonasfluorescens的16S rDNA基因序列的相似性達(dá)99%。上述菌株MJM_5(Pseudomonas fluorescens)于2012年6月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)),保藏號(hào)為CGMCC No. 6293,分類命名為突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。實(shí)施例2、菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)在制備ACC脫氨酶中的應(yīng)用I、發(fā)酵制備ACC脫氨酶TSB培養(yǎng)基胰蛋白胨17g、大豆胨3g、NaC15g、葡萄糖2. 5g、K2HP042. 5g溶解到1000ml蒸餾水中，調(diào)整pH值至pH=7. 5。ADF 培養(yǎng)基KH2P044. 0g、Na2HP046 . 0g、MgSO4 7H200. 2g、FeSO4 7H200. lg、葡萄糖2. 0g、葡萄糖酸2. 0g、檸檬酸2. 0g、微量元素0. lmL、加入蒸餾水中溶解后，調(diào)整pH值至pH=7. 5，定容至1000ml，高溫滅菌后加入I-氨基環(huán)丙烷_(kāi)1_羧酸(ACC)，使其終濃度為3. 0mmol/L (可先配制母液 0. 5mol/L);其中，微量元素(IOOmL) =H3BO3IOmg, MnSO4Il. 2mg,ZnS04124. 6mg、CuS0478. 2mg、Mo0310mg。無(wú)(NH4)2SO4的 DF 培養(yǎng)基KH2P044. 0g、Na2HP046. 0g、MgSO4 7H200. 2g、FeSO4 *7H200. lg、葡萄糖2. 0g、葡萄糖酸2. 0g、檸檬酸2. 0g、微量元素0. lmL、加入蒸餾水中溶解后，調(diào)整pH值至pH=7. 5，定容至1000ml。微量元素配制同上。挑取由實(shí)施例I 獲得的 MJM-5 (Pseudomonas fluorescens) CGMCC NO. 6293 單菌落于50ml TSB培養(yǎng)基中28°C，180rpm培養(yǎng)12h后，4°C、8000g、離心IOmin收集菌體，用50ml無(wú)(NH4) 2S04的DF培養(yǎng)基洗滌三次，將菌體轉(zhuǎn)接于ADF培養(yǎng)基中28°C，180rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)48h，得到收集誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)物。將誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)物4°C、8000g、離心IOmin收集菌體。將菌體懸浮于ImlO. lmol/L Tris-HCl (pH=7. 6)中轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中，1600g離心5min去上清液,收集菌體。重懸菌體于600 y 10. lmol/L Tris_HCl(pH=8. 5)中，加入30 ill甲苯漩渦震蕩30s，取其200 ill的甲苯細(xì)胞做酶活測(cè)定(其余做蛋白測(cè)定)；在甲苯細(xì)胞中加入20iU0. 5mol/L ACC短暫震蕩后，30°C培養(yǎng)15min，之后加入ImlO. 56mol/L HCl混合震蕩室溫(25°C)離心5min，收集上清液，得到ACC脫氨酶?？瞻讓?duì)照為600 u 10. lmol/L Tris-HCl (pH=8. 5)中加入 30 U I 甲苯，再加入 20 U 10. 5mol/L ACC 短暫震蕩后，30°C培養(yǎng)15min，之后加入ImlO. 56mol/LHCl混合震蕩室溫(25°C )離心5min，收集上清液(對(duì)照)。2、ACC脫氨酶活性測(cè)定取上清液Iml與800 U 10. 56mol/L HCl混合，再加入300 U 12，4- ニ硝基苯肼混合，將混合溶液30°C培養(yǎng)30min后，向其中加入2ml2mol/L NaOH使其終止反應(yīng)。于540nm處測(cè)得吸光值。以ImL濃度為0、0. 1,0. 3,0. 7、1和2 ii mo I じ1的a - 丁酮酸為標(biāo)準(zhǔn)液，カロ入800 u 10. 56mol/L HCl混合，再加入300 U 12，4- ニ硝基苯肼混合，將混合溶液30°C培養(yǎng)30min后，向其中加入2ml2mol/L NaOH使其終止反應(yīng)，測(cè)540nm波長(zhǎng)下吸光值，測(cè)定ACC標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3. 7396x-0. 0385。以上清液(對(duì)照)為對(duì)照空白。蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定311. 53 u g/ml上清液。ACC脫氨酶的活性以在測(cè)酶體系中每毫克蛋白每小時(shí)形成a - 丁酮酸(a -RA)的量表示，單位為ymola-KA* (mgPr ^h)'酶活性測(cè)定均扣除樣品對(duì)照空白后計(jì)算，重復(fù)3次。結(jié)果顯示，MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)菌株產(chǎn)生的ACC脫氨酶有較高的活性，高達(dá) 29. 67 u mo I a -KA (mgPr h)-1。實(shí)施例3、菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)在制備IAA合成中的應(yīng)用I、制備 IAADF 培養(yǎng)基KH2P044. 0g、Na2HP046. 0g、MgSO4 7H200. 2g、FeSO4 7H200. lg、葡萄糖2. 0g、葡萄糖酸2. 0g、檸檬酸2. 0g、(NH4)2S042. 0g、微量元素0. lmL、加入蒸餾水中溶解后，調(diào)整pH值至pH=7. 5，定容至1000ml。微量元素配制同上。供試菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)于 DF 培養(yǎng)基中 28°C，180rpm 培養(yǎng)
2天，再轉(zhuǎn)接到添加不同濃度(0、50、100、200、500 u gL-Trp じ1)色氨酸(L-Trp)的新鮮的·DF培養(yǎng)基中，280C，180rpm培養(yǎng)2d，收集發(fā)酵產(chǎn)物。取樣測(cè)得菌液的OD6tltl值，然后將其余發(fā)酵產(chǎn)物(菌液)室溫(25°C)下8000rpm離心lOmin，收集上清液，得到IAA。2、檢測(cè)IAA含量取其500 U I上清液加入2ml Salkowsk試劑，室溫(25°C )培養(yǎng)20min后，于535nm處測(cè)得吸光值。用DF空白培養(yǎng)基相同處理作為對(duì)照調(diào)零。以不同濃度(0. 01,0. 05,0. 25、
0.5mg mL—1) IAA標(biāo)準(zhǔn)液,相同處理測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0. 1729x_0. 0098,進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果如圖2所不，菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)能產(chǎn)生卩引哚Za酸，且合成吲哚こ酸量隨著L-Trp濃度的增加而增加，具體在濃度為0、50、100、200、500 u gL-Trp mじ1 中的吲哚こ酸量分別為 0. 93,3. 56,5. 78,9. 49、17. 64 u g(ml OD600)'實(shí)施例4、菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)在制備嗜鐵素中的應(yīng)用I、嗜鐵素合成的定性檢測(cè)鉻奧醇CAS平板培養(yǎng)基制備CAS藍(lán)色染液溶液A :將0. 06g CAS溶于50mL去離子水中，再加入IOmLlmmol じ1的FeCl3溶液(含 IOmmol L 1 的 HCl)；溶液B :將0. 073g的十六燒基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammoniumbromide, HDTMA)溶于40mT,去離子水中；將溶液A著燒杯壁緩緩加入到溶液B中，輕輕晃動(dòng)混勻溶液A和溶液B，得到CAS藍(lán)色染液。溶液a 15g KH2P04、25gNaCl、50gNH4Cl 溶于 500ml 去離子水；20%的葡萄糖溶液20g葡萄糖溶于IOOml去離子水；溶液c 25gNa0H溶于150ml去離子水；酸性酪蛋白水解物溶液3g酸性酪蛋白水解物溶于27ml去離子水，應(yīng)用濾膜過(guò)濾滅菌；量取IOOml溶液a與750ml去離子水混合，向其中加入32. 24gPIPES(哌嗪_1，4- ニこ磺酸；PIPES在pH小于5以下不溶，應(yīng)調(diào)節(jié)溶液酸堿度在緩慢加入PIPES，并不斷攪拌，最終用溶液c將溶液調(diào)到pH=6. 8)，加入細(xì)菌培養(yǎng)專用瓊脂15g，120°C、15min滅菌。待溶液冷卻到50°C左右加入30ml酸性酪蛋白水解物溶液，10ml20%的葡萄糖溶液，再緩慢加入IOOmlCAS藍(lán)色染液，充分混勻，倒平板。
按照Schwyn和Neilands的方法，將已分離保存的菌株MJM-5 (Pseudomonasfluorescens)接于絡(luò)奧醇CAS (chrome azurol S)平板培養(yǎng)基上,28°C培養(yǎng)72h,觀察菌落周圍的顏色變化，結(jié)果如圖3所示，有橘黃色圈產(chǎn)生，則該菌株可產(chǎn)生嗜鐵素。2、嗜鐵素合成定量分析I)制備嗜鐵素MKB 培養(yǎng)基(IL):酸解酪蛋白 5g，甘油 15mL，K2HP042. 5g，MgSO4 7H202. 5g，pH7. 2。121°C，20min 滅菌。將菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)接種于 MKB 培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)(180r Iiiirr1MSh,收集發(fā)酵產(chǎn)物(菌液)；發(fā)酵產(chǎn)物IOOOrpm離心IOmin,取上清液,得到嗜
鐵素。2)檢測(cè)嗜鐵素CAS檢測(cè)液的制備I、將 0. 182g CTAB 溶于 50ml 去離子水。2、將 0. 0054g FeCl 6H20 溶于 20mlIOmM HCl 水溶液。3、將0. 0605g鉻天青S溶于50ml去離子水。4、將I. 5ml步驟2得到的溶液與7. 5ml步驟3得到的溶液混合，再與6ml步驟I得到的溶液混合，得到混合液。5、將 4. 307g PIPES 用 20_30ml 去離子水溶解，加入 6. 25ml 濃 HC1，調(diào) pH 為 5. 6。6、將全部步驟4得到的溶液和全部步驟5得到的溶液混合，并用去離子水定容至溶 100mlo以1:1的體積比向上清液中加入CAS檢測(cè)液，充分混勻。靜止Ih后，630nm處測(cè)吸光值(A)，去離子水與CAS檢測(cè)液等體積混合測(cè)得的Ar為對(duì)照，A/Ar代表樣品中嗜鐵素的相對(duì)含量。該值越低，表明嗜鐵素含量越高。結(jié)果MJM_5(Pseudomonasfluorescens)的A/Ar 為 I. 52 ;表明MJM_5(Pseudomonasfluorescens)可以合成嗜鐵素。實(shí)施例5、菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)在鹽堿脅迫下對(duì)植物促生的盆栽實(shí)驗(yàn)一、菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)在鹽堿脅迫下對(duì)苜猜促生的盆栽實(shí)驗(yàn)本發(fā)明所用土樣均取自黑龍江省大慶市采油廠附近鹽堿土。采集樣品時(shí)在每個(gè)區(qū)域內(nèi)設(shè)置5個(gè)樣方，樣方面積為IX Im2,收集表層土壤((T20cm), 土壤混合后,裝入事先準(zhǔn)備好的干凈保鮮袋中，迅速將士樣帶回實(shí)驗(yàn)室，土壤經(jīng)碾碎，混勻，風(fēng)干后過(guò)篩保存。供試土壤的理化性質(zhì)見(jiàn)表I。表I供試土壤理化性質(zhì)
土壤樣本 pH 有機(jī)質(zhì)(g/kg)氮(mg/kg)猶(mg/kg)鉀(mg/kg)鹽(g/kg)
—鹽堿土 —7,9 _18.22 _176.4 _21.1 _176_0.37 — 將由實(shí)施例I得到的突光假單抱菌MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)在ADF固體培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中，于28°C, 180rpm條件下振蕩培養(yǎng)24h,用無(wú)菌水調(diào)菌液濃度為I X 101(lCfu/ml (懸液A)，備用。將苜蓿種子(龍牧803苜蓿)預(yù)先用10%(V/V)次氯酸鈉表面消毒IOmin后用無(wú)菌水洗滌三次。再于懸液A中浸泡Ih處理(MJM-5)，經(jīng)無(wú)菌水浸泡處理Ih的為對(duì)照(CK)。將懸液A處理后的種子和對(duì)照處理后的種子均勻播種于同一規(guī)格的花盆中。將懸液A處理后的種子定期取50ml菌懸液B均勻澆灌于小麥苗根部周圍；菌懸液B為將制備好的菌懸液A調(diào)菌液濃度至I X 109Cfu/ml (菌懸液B)。對(duì)照用等量水澆灌。每盆20株，重復(fù)5次，室溫培養(yǎng)。一周內(nèi)測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，40天后測(cè)定株高、根長(zhǎng)、地上植株干重、地下根系干重，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示，盆栽效果如圖4所示。表2菌株MJM-5 (Pseudomonas fluorescens)對(duì)苜猜促生作用的生物量測(cè)定
權(quán)利要求
1.突光假單胞菌(PseudomonasfIuorescens)菌株MJM-5，其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6293。
2.權(quán)利要求I所述的突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株MJM-5在如下I)-4)至少一種中的應(yīng)用 1)制備ACC脫氨酶； 2)制備吲哚乙酸； 3)制備嗜鐵素； 4)促進(jìn)植物生長(zhǎng)；所述促進(jìn)植物生長(zhǎng)具體在鹽堿脅迫條件下進(jìn)行。
3.一種制備產(chǎn)物的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求I所述的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5,即得到產(chǎn)物；所述產(chǎn)物為ACC脫氨酶、卩引哚乙酸或嗜鐵素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于 若所述產(chǎn)物為ACC脫氨酶時(shí)，所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為T(mén)SB培養(yǎng)基和ADF培養(yǎng)基； 若所述產(chǎn)物為吲哚乙酸時(shí)，所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為DF培養(yǎng)基或含有色氨酸的DF培養(yǎng)基; 若所述產(chǎn)物為嗜鐵素時(shí)，所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為MKB培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于 所述制備ACC脫氨酶的方法包括如下步驟 1)在所述TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求I所述的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株MJM-5，收集菌體，得到培養(yǎng)菌I ; 2)將所述培養(yǎng)菌I接種到所述ADF培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體，即得到ACC脫氨酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于 所述制備吲哚乙酸的方法包括如下步驟在所述DF培養(yǎng)基或所述含有色氨酸的DF培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求I所述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5,收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到吲哚乙酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于 所述含有色氨酸的DF培養(yǎng)基中色氨酸的終濃度為0-500 u g/mL,且不為O。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于 所述制備嗜鐵素的方法包括如下步驟在MKB培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求I所述的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到嗜鐵素。
9.一種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法，包括如下步驟播種前，將植物種子浸泡到權(quán)利要求I所述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5菌懸液中；播種后，將權(quán)利要求I所述的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5菌懸液燒灌所述植物；實(shí)現(xiàn)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于 所述促進(jìn)植物生長(zhǎng)在鹽堿脅迫條件下進(jìn)行； 所述植物具體為單子葉植物或雙子葉植物； 所述單子葉植物進(jìn)一步具體為小麥或苜蓿。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株苜蓿根際促生菌MJM-5及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5，其保藏編號(hào)為CGMCC No.6293。上述的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MJM-5在如下1)-4)至少一種中的應(yīng)用1)制備ACC脫氨酶；2)制備吲哚乙酸；3)制備嗜鐵素；4)在鹽堿脅迫下促進(jìn)植物生長(zhǎng)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明分離得到一株苜蓿根際促生菌MJM-5，其可以合成ACC脫氨酶、IAA嗜鐵素，而且可在鹽堿脅迫環(huán)境中有效地促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)以及提高植物在逆境條件下抗逆能力。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102787090SQ20121027923
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者王曉丹, 蔡洪生, 謝寶明, 郭長(zhǎng)虹, 馬嘉敏 申請(qǐng)人:哈爾濱師范大學(xué)