一種篩選異化鐵還原細(xì)菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種篩選異化鐵還原細(xì)菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵是一種變價金屬，鐵的生物氧化還原涉及多種元素的生物地球化學(xué)循環(huán)。以 Fe(III)和Fe(II)為主導(dǎo)的鐵循環(huán)過程是調(diào)控重金屬迀移轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子之一，而微生物 介導(dǎo)的異化鐵還原過程能夠同時實現(xiàn)有機(jī)污染物在厭氧條件下的氧化分解。因此，微生物 介導(dǎo)鐵還原過程在生態(tài)環(huán)境及生物修復(fù)中具有重要作用。
[0003] 由于現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，環(huán)境中有機(jī)污染物逐步的累積，導(dǎo)致許多被污染的環(huán) 境提供了一種厭氧或缺氧的條件。而在厭氧環(huán)境下，F(xiàn)e(III)成為了有機(jī)物氧化最重要 的電子受體。異化鐵還原細(xì)菌不是一個分類學(xué)上的概念，它實際上是具有Fe(III)還原 功能的一類微生物的總稱。具有異化鐵還原能力的微生物在細(xì)菌和古細(xì)菌域中都有發(fā) 現(xiàn)（LeeandNewman,Microbialironrespiration:impactsoncorrosionprocesses. AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 2003, 62:134-138)。迄今為止，已經(jīng)在細(xì) 菌域的9個門，15個綱，27個目，37個科，65個屬及古細(xì)菌域2個門，5個綱，7個目，7個 科，10個屬中發(fā)現(xiàn)有異化鐵還原微生物的分布，表1是有關(guān)沉積物中部分異化鐵還原微 生物及其來源(Lovley,Bioremediationoforganicandmetalcontaminantswith dissimilatorymetalreduction.JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnolo gy， 1995, 14:85-93)。
[0004] 表1部分沉積物中異化鐵還原細(xì)菌及其來源
【主權(quán)項】
1. 一種篩選異化鐵還原細(xì)菌的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 利用逐步提高液體培養(yǎng)基中Fe (III)濃度的方式對沉積物污泥進(jìn)行富集培養(yǎng)：將 污泥樣品加入含F(xiàn)e(III)的液體培養(yǎng)基中，充氮?dú)鈪捬跖囵B(yǎng)，所述液體培養(yǎng)基中Fe(III)的 初始濃度為5~10mm 〇l/L，培養(yǎng)過程中將Fe (III)還原能力較強(qiáng)的菌群逐步轉(zhuǎn)接至Fe (III) 濃度更高的液體培養(yǎng)基中，每次轉(zhuǎn)接將Fe (III)的濃度提高5~10mm〇l/L，直至提高到 50mmol/L ； (2) 從富集菌群中分離純化異化鐵還原細(xì)菌：將經(jīng)過步驟（1)富集培養(yǎng)后的泥漿懸液 離心，取上清菌液稀釋后劃線接種于Fe (III)濃度為10~50mmol/L的固體培養(yǎng)基上，待菌 液完全被固體培養(yǎng)基吸收后再傾倒一層相同的固體培養(yǎng)基，待上層的固體培養(yǎng)基凝固后， 再傾倒一層液體石蠟加以封蓋；將此三層平板培養(yǎng)24~72h后挑取單菌落，接種于Fe (III) 濃度為10~50mmol/L的液體培養(yǎng)基中，充氮?dú)鈪捬跖囵B(yǎng)24~72h后測定液體培養(yǎng)基中 Fe( II )濃度，選取積累Fe( II )濃度最高的菌株，再次接種于所述三層平板中進(jìn)行培養(yǎng)和 分離，重復(fù)上述過程，直至獲得純化菌株； 所述步驟（1)、（2)中培養(yǎng)基的酸堿度均保持在：pH6. 0~9. 0 ;對應(yīng)的培養(yǎng)溫度均為： 20 ~40°C。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選異化鐵還原細(xì)菌的方法，其特征在于：在所述步驟（2) 之后還包括重金屬耐受能力或高鹽度耐受能力的梯度馴化步驟；所述重金屬耐受能力的 梯度馴化步驟采取如下方法：將步驟（2)獲得的純化菌株接種于Fe(III)濃度為10~ 50mmol/L的液體培養(yǎng)基中，充氮?dú)鈪捬跖囵B(yǎng)；培養(yǎng)過程中將重金屬耐受能力及Fe (III)還 原能力較強(qiáng)的菌株逐步轉(zhuǎn)接至Cr ( VI)濃度更高的液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中Cr ( VI) 的最高濃度不超過2. 5mmol/L，F(xiàn)e (III)的濃度保持不變，培養(yǎng)基酸堿度均保持在：pH6. 0~ 9. 0 ;對應(yīng)的培養(yǎng)溫度均為：20~40°C ; 所述高鹽度耐受能力的梯度馴化步驟采取如下方法：將步驟（2)獲得的純化菌株接種 于Fe (III)濃度為10~50mmol/L的液體培養(yǎng)基中充氮?dú)鈪捬跖囵B(yǎng)，培養(yǎng)過程中將耐鹽能 力及Fe (III)還原能力較強(qiáng)菌株逐步轉(zhuǎn)接至NaCl濃度更高的液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中 NaCl的最高濃度不超過60g/L，F(xiàn)e (III)的濃度保持不變，培養(yǎng)基酸堿度均保持在：pH6. 0~ 9. 0 ;對應(yīng)的培養(yǎng)溫度均為：20~40°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的篩選異化鐵還原細(xì)菌的方法，其特征在于：在所述步驟 (1)、⑵、重金屬耐受能力以及高鹽度耐受能力的梯度馴化步驟中使用的含F(xiàn)e (III)的液體 培養(yǎng)基為檸檬酸鐵培養(yǎng)基；所述步驟（2)中使用的含F(xiàn)e(III)的固體培養(yǎng)基為檸檬酸鐵固 體培養(yǎng)基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的篩選異化鐵還原細(xì)菌的方法，其特征在于：在所述步驟 (1)、（2)、重金屬耐受能力以及高鹽度耐受能力的梯度馴化步驟中，充氮?dú)鈪捬跖囵B(yǎng)的方法 為：將液體培養(yǎng)基置于培養(yǎng)容器中，通入氮?dú)馐古囵B(yǎng)容器內(nèi)的空氣完全排出，之后密封容器 進(jìn)行培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種篩選異化鐵還原細(xì)菌的方法，包括：(1)利用逐步提高液體培養(yǎng)基中Fe(Ⅲ)濃度的方式對沉積物污泥進(jìn)行富集培養(yǎng)；(2)從富集菌群中分離純化異化鐵還原細(xì)菌，以及重金屬耐受能力和耐鹽能力的梯度馴化步驟。所述異化鐵還原細(xì)菌的篩選方法簡便易行且篩選周期短，篩選過程中無需厭氧操作系統(tǒng)等昂貴的分離設(shè)備，有效降低了篩選成本，獲得的純化菌株具有較強(qiáng)的Fe(Ⅲ)還原能力。另外，通過對純化菌株的重金屬耐受能力和耐鹽能力的梯度馴化能夠快速、簡便地獲得對Cr(Ⅵ)重金屬以及不同鹽濃度環(huán)境具有耐受能力的異化鐵還原菌株，為重金屬、鹽域等環(huán)境下的生物修復(fù)提供種質(zhì)資源。
【IPC分類】C12N1-20
【公開號】CN104745519
【申請?zhí)枴緾N201510183645
【發(fā)明人】劉洪艷, 王紅玉, 馬帥, 殷艷艷
【申請人】天津科技大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月17日