專利名稱：一種簡便快速檢測綿羊多胎基因bmpr-ib的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其適用于從綿羊羊毛毛囊中簡便快速提取基因組DNA，繼而用于檢測綿羊BMPR-I B多胎基因A746G位點的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
Fed基因是在綿羊中識別出的高繁殖力的第一個主效基因，后被證明該基因?qū)嶋H為BMPR-IB基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在澳大利亞Booroola Merino綿羊、印度Garole綿羊、印度尼西亞Javanese綿羊、中國的湖羊、小尾寒羊、中國美利奴羊(軍墾型)、中國美利奴羊(新疆型)、灘羊、策勒黑羊中存在BMPR-IB基因A746G突變位點，該基因?qū)d羊的排卵數(shù)與產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響，是控制綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因之一。文獻(xiàn)檢索披露①2010年11月由新疆農(nóng)墾科學(xué)院的管峰等申請了專利“一種快 速檢測綿羊多胎FecB基因的方法”，該發(fā)明所提供的利用四條單鏈擴(kuò)增引物進(jìn)行FecB基因分型的方法，是由特異性上游引物F1、下游引物Rl和對照上游引物F2、下游引物R2共同對待測綿羊基因組DNA擴(kuò)增，然后對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，確定序列擴(kuò)增產(chǎn)物中條帶大小和數(shù)目，產(chǎn)物有三種情況包含220bp和120bp ；220bp和160bp ;220bp、160bp和120bp。②2011年5月，新疆農(nóng)墾科學(xué)院的楊華等申請了專利“綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性檢測試劑盒及檢測方法”，公開的綿羊BMPR-IB基因A746G多態(tài)性檢測試劑盒，主要包含擴(kuò)增液、至少I張基因芯片、雜交緩沖液I和II、預(yù)雜交液、Taq酶、雜交顯色試劑；另外公開了利用該試劑盒進(jìn)行檢測的方法步驟制備多個綿羊的染色體DNA備用；試劑盒組裝；用PCR方法擴(kuò)增；變性處理；預(yù)雜交及雜交；雜交信號檢測。目前，關(guān)于檢測BMPR-IB基因A746G突變位點的試劑盒及方法的相關(guān)發(fā)明較少，針對BMPR-IB基因檢測的發(fā)明及方法，獲取DNA的手段基本上都是通過酚仿抽提法提取試驗動物血液中的DNA來實現(xiàn)的，但常規(guī)的酚仿抽提法操作過程較為繁瑣，需要用蛋白酶K進(jìn)行較長時間的消化，在多步操作中會有基因組DNA損失，整個檢測過程較長，且所用酚仿等試劑對操作者身體健康不利。高質(zhì)量基因組DNA的提取是后續(xù)分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，較容易獲得而且最常用的材料有動物的血液、耳組織、尾組織或趾尖等樣品，采集這些組織雖不至于導(dǎo)致動物死亡，但對動物均會或多或少地造成身體傷害，易產(chǎn)生應(yīng)激，尤其是對于經(jīng)濟(jì)價值高或瀕臨滅絕的珍稀保護(hù)動物更不適用，提取動物毛發(fā)則相對簡便，并且對動物幾乎不會造成傷害，另外，毛發(fā)更便于長期保存和長途運輸，不需要冷藏，也不需要特殊處理。文獻(xiàn)關(guān)于從毛發(fā)中提取DNA的方法也有報道⑴余艦等在蛋白酶K(56°C )作用下，采用酚-氯仿反復(fù)抽提法從毛發(fā)中提取了微量的DNA，但缺點是提取的DNA的量較少。⑵徐艷春等和伍新堯等用Chelex-100處理毛發(fā)制備DNA，達(dá)到I根毛發(fā)提取得到的DNA即可得到較好的實驗結(jié)果，但用此方法對毛囊細(xì)胞裂解不夠徹底，殘留的消化液對后繼的PCR過程有一定的影響。而后，⑶李軍林等在常規(guī)的酚-氯仿提取法的基礎(chǔ)上加以優(yōu)化，以pH8. 8Tris-HCl、MgCl2溶液和蛋白酶K為裂解液消化，使其獲得了較高質(zhì)量的DNA，但操作繁復(fù)、耗時。(4)趙春江等在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，以常用的PCR緩沖液、MgCl2溶液和蛋白酶K為裂解液，在PCR儀上設(shè)置一個單循環(huán)程序65°C 30min,95°C 15min，4°C lOmin，而后瞬時離心PCR管，上清液即可做PCR模板，此法采用的較高消化溫度(65°C )，可使蛋白酶K在較短時間內(nèi)高效地消化毛囊中的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞釋出DNA ；PCR的緩沖液中含有的Tris堿和PCR緩沖液的pH值，可在DNA提取過程中起到保護(hù)DNA、防止降解的作用；在PCR儀上，950C 15min過程可使蛋白酶K滅活，防止蛋白酶K在后續(xù)PCR過程中消化Taq酶而使PCR擴(kuò)增無法進(jìn)行，該方法可以用于大量標(biāo)本的處理，且效果較好，但該方法中所用試劑價格相對較高且需保存在_20°C條件下。(5)楊勝林等通過從不同數(shù)量的豬毛中提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量比較分析，找出了適合于做分子標(biāo)記試驗所需的豬毛樣本數(shù)量，Di Martino等采用剪除毛干、保留毛囊的方法預(yù)處理毛發(fā)，可以減少角蛋白污染，提高DNA提取物的濃度和純度。本發(fā)明的試劑盒，適用于檢測綿羊BMPR-IB多胎基因A746G位點，可在24小時內(nèi)
準(zhǔn)確得出檢測結(jié)果，為綿羊早期選種，即快速檢測綿羊多胎基因，提供了一種效率高、操作簡便和經(jīng)濟(jì)實用的可規(guī)?；瘜嵤┑臋z測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種效率高、操作簡便、可規(guī)模檢測，適用于檢測綿羊BMPR-IB多胎基因A746G位點的試劑盒及快速檢測方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種簡便快速檢測綿羊多胎基因BMPR-IB的試劑盒，利用試劑盒從羊毛毛囊中快速提取基因組DNA，并運用PCR-RFLP技術(shù)檢測BMPR-IB多胎基因A746G位點；其中試劑盒包括毛樣DNA提取液A和B，PCR擴(kuò)增液、限制性內(nèi)切酶Ava II、IOXBuffer R、染料、ddH20、說明書;(I)毛樣DNA提取液A為175mM的NaOH溶液；(2)毛樣DNA提取液B 為 175mM 的 HCl 16. 7 μ 1，IOOmM 的 Tris-HCl、ρΗ8· 5,500 μ 1，ddH20 483. 3 μ I ;(3) PCR 擴(kuò)增液為 2XTaq PCR MasterMixlO. O μ l,ddH207. 7 μ 1，IOmM 的上下游引物各0.4μ 1，BMPR-IB基因的上下游引物由上海生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司合成；上游引物序列5’GTCGCTATGGGGAAGITTGGATG3’ ；下游引物序列5’CAAGATGITTTCATGCCTCATCAACACGGTC3，；(4)限制性內(nèi)切酶Ava II為IOU/ μ I ；(5) IOXBuffer R 為 IOOmM Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IM KCl, lmg/mlBSA ；(6)染料為 6XRNA/DNA Loading buffer ；(7) ddH20 ；(8)說明書；其中對綿羊繁殖力基因的檢測(I)毛樣DNA的提取取15根帶有毛囊的毛樣，用70%乙醇清洗2次，蒸餾水清洗2次，用消毒剪，剪切O. 4cm根部毛樣，放入O. 2ml離心管中離心，3500rpm、5_10s ;加15μ I毛樣DNA提取液Α，漩渦混合離心，3500rpm、5-10s ;用熱循環(huán)程序處置75°C lmin,80°C 2min，85°C lmin，95°C lmin，97°C 5min ;從熱循環(huán)儀上取下，加入15 μ I毛樣DNA提取液B，漩渦混合，_20°C保存；經(jīng)3500rpm、5-10s離心，取上清作為DNA模板，PCR擴(kuò)增備用；(2)PCR擴(kuò)增將I. 5 μ I DNA模板加入對應(yīng)標(biāo)號的PCR管中，再加入18. 5 μ I PCR擴(kuò)增液，彈去氣泡，震蕩混勻，經(jīng)3500rpm、5-10s離心；放入設(shè)定好程序的PCR儀中，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C退火溫度30s、72°C延伸30s共30個循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存；用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測，電壓120V、電泳30min、EB染色，凝膠成像擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期片段140bp ；(3) PCR-RFLP 檢測酶切反應(yīng)體系為 ddH20 2. 5 μ 1，IOXBuffer R2. O μ 1，限制性內(nèi)切酶Ava II O. 5 μ 1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5. O μ I ;放入37°C恒溫箱消化4h ;用2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切產(chǎn)物檢測，電壓120V、電泳30min、EB染色，凝膠成像系統(tǒng)成像，其基因判型結(jié)果看不到30bp條帶,只見140bp、IlObp條帶。本發(fā)明對毛囊DNA提取的提取液配方、毛囊樣本量和DNA提取液上樣量的最適配 t匕、熱循環(huán)程序進(jìn)行優(yōu)化，確定毛樣DNA提取液A為175mM的NaOH溶液1000 μ 1，毛樣DNA 提取液 B 為 175mM 的 HCl 16. 7 μ I，IOOmM 的 Tris-HCl (ρΗ8· 5) 500 μ 1，ddH20483. 3 μ I ；15根帶毛囊的毛樣加15 μ I毛樣DNA提取液提取效果最佳；最優(yōu)熱循環(huán)程序為75°C lmin,80°C 2min，85°C lmin，95°C lmin，97°C 5min ;此方法將用傳統(tǒng)酚氯仿抽提法提取基因組DNA的時間由1-2天縮短至30min，將利用PCR-RFLP技術(shù)檢測BMPR-IB多胎基因A746G位點的整個試驗時間由2-3天縮短至I天，極大地提高了測定綿羊BMPR-IB多胎基因A746G位點的效率。本發(fā)明的快速檢測綿羊BMPR-IB多胎基因A746G位點的方法，主要通過優(yōu)化和改進(jìn)羊毛毛囊DNA的提取方法，簡便快速的從羊毛毛囊中提取基因組DNA，進(jìn)而進(jìn)行PCR-RFLP檢測得以實現(xiàn)，彰顯技術(shù)進(jìn)步。


本發(fā)明結(jié)合實施例作進(jìn)一步說明。附圖I為PCR擴(kuò)增的電泳圖；如圖所示M為DL2000DNA Marker,泳道2_4為用傳統(tǒng)酚氯仿抽提法從血樣中提取基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，泳道I為該方法的空白對照；泳道6-8為用優(yōu)化后的毛囊DNA提取方法從羊毛毛囊中提取基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，泳道5為該方法的空白對照。附圖2為酶切圖；如圖所示M為DL2000DNA Marker，泳道5為140bp，判定為++基因型，泳道1-4、6、8為140bp、110bp、30bp，判定為B+基因型，泳道7為110bp、30bp，判定為BB基因型;因30bp條帶片段小,有可能從膠中跑出，可能看不到30bp條帶,只可見140bp、IlObp條帶,不影響判型。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合實施例作進(jìn)一步說明。實施例本發(fā)明公開的快速檢測綿羊BMPR-IB多胎基因A746G位點的試劑盒包括下列毛樣DNA提取液A和B、PCR擴(kuò)增液、限制性內(nèi)切酶Ava I IUOXBuffer R、ddH20、染料、說明書，具體規(guī)格如下表
權(quán)利要求
1.一種簡便快速檢測綿羊多胎基因BMPR-IB的試劑盒，其特征在于利用試劑盒從羊毛毛囊中快速提取基因組DNA，并運用PCR-RFLP技術(shù)檢測BMPR-IB多胎基因A746G位點； 其中試劑盒包括毛樣DNA提取液A和B，PCR擴(kuò)增液、限制性內(nèi)切酶Ava II、IOXBuffer R、染料、ddH20、說明書; (1)毛樣DNA提取液A為175mM的NaOH溶液；(2)毛樣DNA 提取液 B 為 175mM 的 HCl 16. 7 U 1，IOOmM 的 Tris-HCl、pH8. 5,500 u 1，ddH20 483. 3u I ；(3)PCR 擴(kuò)增液為 2XTaq PCR MasterMixlO. 0 U I, ddH20 7. 7 ii 1，IOmM 的上下游引物各0.4iU，BMPR-IB基因的上下游引物由上海生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司合成；上游引物序列5’GTCGCTATGGGGAAGITTGGATG3’ ；下游引物序列5’CAAGATGITITCATGCCTCATCAACACGGTC3，； (4)限制性內(nèi)切酶AvaII為IOU/ u I ；(5)IOXBuffer R 為 IOOmM Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IM KCl, lmg/mlBSA ； (6)染料為6XRNA/DNA Loading buffer ； (7)ddH20 ； (8)說明書; 其中對綿羊繁殖力基因的檢測 (1)毛樣DNA的提取取15-30根帶有毛囊的毛樣，用70%乙醇清洗2次，蒸餾水清洗2次,用消毒剪,剪切0. 4cm根部毛樣，放入0. 2ml離心管中離心，3500rpm、5_10s ;加15 y I毛樣DNA提取液A,鏇潤混合離心,3500r pm、5_10s ;用熱循環(huán)程序?qū)嵤嵫h(huán)75°C lmin,80 °C 2min,85°C lmin，95°C lmin，97°C 5min ;從熱循環(huán)儀上取下，加入 15 毛樣 DNA 提取液B，漩渦混合，_20°C保存；經(jīng)3500rpm、5-10s離心，取上清作為DNA模板，PCR擴(kuò)增備用； (2)PCR擴(kuò)增將I.5iil DNA模板加入對應(yīng)標(biāo)號的PCR管中，再加入18. 5 PCR擴(kuò)增液,彈去氣泡,震蕩混勻，經(jīng)3500rpm、5-10s離心；放入設(shè)定好程序的PCR儀中，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C退火溫度30s、72°C延伸30s共30個循環(huán)，72°C延伸5min, 4°C保存；用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測，電壓120V、電泳30min、EB染色，凝膠成像擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期片段140bp ； (3)PCR-RFLP檢測酶切反應(yīng)體系為ddH202. 5 u l,10XBuffer R2. Oyl，限制性內(nèi)切酶Ava II 0.5 u I, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5. 0 U I ;放入37°C恒溫箱消化4h ;用2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切產(chǎn)物檢測，電壓120V、電泳30min、EB染色，凝膠成像系統(tǒng)成像，其基因判型結(jié)果:看不至1J 30bp條帶,只見140bp、IlObp條帶。
2.按照權(quán)利I所述的方法，其特征在于所用三羥甲基氨基甲烷，即Tris-base，由莊盟生物提供；2XTaq PCR MasterMix由博邁德生物提供；限制性內(nèi)切酶Ava IIUOXBufferR由MBI Fermentas公司提供；6XRNA/DNA Loadingbuffer由博邁德生物提供；ddH20由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；DL2000DNA Marker由莊盟生物提供；EB由天根生化科技有限公司提供；3_18K高速冷凍離心機(jī)產(chǎn)自SIGMA公司JY04S凝膠成像儀產(chǎn)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種簡便快速檢測綿羊多胎基因BMPR-IB的試劑盒，包括(1)毛樣DNA提取液A為175mM的NaOH溶液；(2)毛樣DNA提取液B為175mM的HC l16.7μl，100mM的Tris-HCl、pH8.5、500μl，ddH2O483.3μl；(3)PCR擴(kuò)增液為2×Taq PCR MasterMix10.0μl，ddH2O 7.7μl，10mM的上下游引物各0.4μl，其中BMPR-IB基因的上游引物序列5'GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG3'；下游引物序列5'CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC3'；(4)限制性內(nèi)切酶Ava II為10U/μl；(5)10×Buffer R為100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，1M KCl，1mg/ml BSA；(6)染料為6×RNA/DNA Loading buffer；(7)ddH2O；(8)說明書。
文檔編號C12Q1/68GK102758016SQ20121023621
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者劉武軍, 王瓊, 邵勇鋼 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)