專利名稱：鑒定綿羊早期胚胎性別的牙釉蛋白基因引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一對可用于鑒定綿羊早期胚胎性別的牙釉蛋白基因引物及其應(yīng)用，以 及利用該引物鑒定綿羊早期胚胎性別的PCR方法。
背景技術(shù)：
在胚胎生物技術(shù)領(lǐng)域中，對家畜性別的控制是多年來人們夢寐以求的愿望。對綿 羊早期胚胎尤其是附植前胚胎進行性別鑒定后再進行移植，在生產(chǎn)中具有重要的科學(xué)研究 價值和商業(yè)價值。因為有效控制后代性別，不僅意味著經(jīng)濟效益的增加，對促進優(yōu)良綿羊基 因的推廣、加速品種改良有重要的意義。動物的某些生產(chǎn)性狀是受性別限制(泌乳等)或性 別影響的(產(chǎn)毛等)，通過性別控制，達到理想的性別比例，可以獲得更多的所需性狀及更大 的經(jīng)濟效益。家畜胚胎的早期性別鑒定技術(shù)，是實現(xiàn)家畜性別控制的一種重要方法。通過 移植已知性別的胚胎，控制家畜后代的性別，能加快優(yōu)良母畜的繁殖速度，促進高效畜牧業(yè) 的發(fā)展。通過性別控制還可以排除畜群中有害基因和基因型，防止性連鎖疾病。目前，能夠?qū)崿F(xiàn)性別控制的手段主要有兩種一是X精子和Y精子的分離，即通過 x、Y精子微弱的生物學(xué)差異，分離出含兩種染色體的精子，用于人工授精或體外受精。流式 細胞分離儀分離精子的準確率達到90%，但目前分離速度太慢，精液價格昂貴，且分離后精 液不耐冷凍，后代有一定的畸形率，因而應(yīng)用受到限制。二是早期胚胎的性別鑒定。綿羊早 期胚胎的性別鑒定已有十幾年的發(fā)展歷史，從早期的免疫學(xué)方法到胚胎細胞的染色體核型 分析和現(xiàn)在的分子生物學(xué)方法，該項技術(shù)取得了巨大的進展，但最具有推廣和實用價值的 綿羊早期胚胎性別鑒定技術(shù)是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)。雖然PCR技術(shù)在牛、羊早期胚胎性別鑒定中已取得了突破性的進展，使胚胎的性 別鑒定進入了一個嶄新的發(fā)展階段。但在國內(nèi)，該法尚未大面積應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，仍停留在 實驗室研究階段。胚胎性別鑒定程序仍很復(fù)雜，使養(yǎng)殖戶和胚胎操作者一籌莫展。同時，在 操作過程中會偶爾損壞或丟失胚胎。因此，建立一種能大規(guī)模的應(yīng)用于生產(chǎn)的簡便、省時、 實用、經(jīng)濟的早期胚胎性別鑒定技術(shù)顯得尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可用于鑒定早期羊胚胎性別的綿羊牙釉蛋白基因特異 性引物序列，并提供使用該引物鑒定綿羊早期胚胎性別的PCR方法。該發(fā)明具有簡單、快 速、準確，靈敏的特點，完全適合在野巧外操作，可在生產(chǎn)現(xiàn)場應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種牙釉蛋白基因引物，序列如下
上游引物5，-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3’ 下游引物5 ’-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3，。編碼牙釉蛋白(AMEL)的基因位于哺乳動物的X和Y染色體上，其等位基因外顯子 具有相同的基因序列，但其內(nèi)含子序列不同。因此，由X和Y染色體決定性別的哺乳動物，雌性(XX)個體具有兩種相同的AMEL基因，而雄性(XY)則具有兩種不同的AMEL基因。Y染 色體上的AMEL基因在第1內(nèi)含子有一小段的缺失，可用特異性引物同步擴增X- Y染色體 AMEL基因序列，使之產(chǎn)生不同的DNA片段，從而可以判斷性別。本發(fā)明還涉及所述的牙釉蛋白基因引物在制備鑒定綿羊早期胚胎性別的試劑盒 中的應(yīng)用。所述試劑盒主要包括牙釉蛋白基因引物和PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶。本發(fā)明還涉及一種鑒定綿羊早期胚胎性別的PCR方法，所述方法包括取綿羊胚 胎細胞(4 6個細胞樣品)作為模板，以所述牙釉蛋白基因引物作為擴增引物，配制PCR反 應(yīng)體系進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)262bp和202bp兩條條 帶，則待測羊胚胎為雄性胚胎；若電泳結(jié)果只出現(xiàn)一條262bp的條帶，則待測羊胚胎為雌性 胚胎。本發(fā)明可直接取胚胎細胞進行PCR擴增，而不需要提取細胞DNA，操作更加簡便。 由于只需要1對引物就可以同時解決性控引物和內(nèi)標引物的問題，這樣就不存在性控引物 和內(nèi)標引物擴增效率不同的問題，同時由于只需使用1對引物，既能降低實驗成本，又能減 少引物太多導(dǎo)致交叉產(chǎn)生引物二聚體等不良影響，有利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明 綿羊牙釉蛋白基因特異性引物序列，共對25枚綿羊胚胎進行了性別鑒定，結(jié)果顯示出生的 羔羊性別與胚胎鑒定的結(jié)果完全一致。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一對綿羊牙釉蛋白基因特異性引物 序列，用該特異性引物建立了綿羊胚胎性別鑒定的PCR檢測方法，具有簡單、快速、準確，靈 敏的特點，可在生產(chǎn)現(xiàn)場推廣應(yīng)用。


圖1為應(yīng)用牙釉蛋白基因特異性引物對綿羊胚胎樣品進行PCR擴增的產(chǎn)物電泳分 析圖。其中，1泳道為陰性對照；2、泳道為待測綿羊胚胎樣品；10泳道為IOObp梯度的DNA 分子量標準。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此
實施例1 特異性引物的合成
本發(fā)明根據(jù)Genbank所提供的AMEL基因序列，設(shè)計合成的特異性引物如下所示
引物 1 5，-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3’ 引物 2 5，-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3，
委托生物技術(shù)公司按上述提供的引物序列在基因合成儀上人工合成了上述兩種 寡核苷酸短片段，用于PCR反應(yīng)。
實施例2:通過綿羊基因組DNA進行性別鑒定，檢測引物的特異性 先分別采集雄性和雌性綿羊耳尖部耳皮膚組織，用試劑盒提取基因組DNA，溶于滅菌超 純水中，用于PCR擴增。
使用本發(fā)明設(shè)計合成的引物進行性別鑒定的具體實驗過程如下
以提取的DNA為模板，用本發(fā)明設(shè)計合成的引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系為模板DNA 50 100 ng，10XPCR buffer (sigma 公司)2 μ L，上、下游引物(20 μ mol/L)各為 0. 5 μ L， dNTP (IOmM) 0. 5 μ L, MgCl2 (2. 5mM) 1· 2 μ L，Taq 酶(5U/μ L) 0· 5 μ L，去離子水補足至 20yL。PCR擴增條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性35 s，61°C退火50 s、72°C延伸35 s， 共30個循環(huán)，再72°C延伸7min。擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠成像系統(tǒng) 觀察結(jié)果。實驗結(jié)果表明用本發(fā)明的AMEL基因特異性引物序列對綿羊進行性別鑒定時， 雄性綿羊樣品可以擴增出262bp和202bp的片段，而母羊只產(chǎn)生262bp的擴增片斷，用超純 水作對照則沒有任何擴增條帶。共檢測了 15份雄性綿羊和15份母羊耳部DNA樣品，檢測 結(jié)果和實際完全符合，說明本發(fā)明設(shè)計合成的AMEL基因特異性引物序列可用于綿羊性別 鑒定。
實施例3 綿羊胚胎性別鑒定PCR法
微量綿羊胚胎細胞的提取用胚胎分割儀，從?？芭呋蚰遗咔腥? 6個細胞，然后把 胚胎細胞樣品放入200 μ L離心管中，加入8 μ L滅菌超純水備用。PCR性別鑒定PCR反應(yīng) 體系及擴增條件與實施例2相同。部分胚胎的性別鑒定結(jié)果如圖1所示3，5，7，9泳道擁 有源自X染色體的262bp的擴增片段和源自Y染色體的202bp的擴增片段，所以性別鑒定 為雄性胚胎；而2，4，6，8泳道只產(chǎn)生源自X染色體的262bp擴增片斷，所以性別鑒定為雌性 胚胎。共檢測了 25枚胚胎的性別，性別鑒定胚胎移植后羔羊的性別和檢測結(jié)果完全一致。
權(quán)利要求
一種牙釉蛋白基因引物，序列如下上游引物5' CAGCCAAACCTCCCTCTGC 3'下游引物5 ' CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC 3'。
2.如權(quán)利要求1所述的牙釉蛋白基因引物在制備鑒定綿羊早期胚胎性別的試劑盒中 的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述試劑盒主要包括牙釉蛋白基因引物和 PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶。
4.一種鑒定綿羊早期胚胎性別的PCR方法，所述方法包括取綿羊胚胎細胞作為模板， 以所述牙釉蛋白基因引物作為擴增引物，配制PCR反應(yīng)體系進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行 電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)262bp和202bp兩條條帶，則待測羊胚胎為雄性胚胎；若電泳結(jié) 果只出現(xiàn)一條262bp的條帶，則待測羊胚胎為雌性胚胎。
全文摘要
本發(fā)明屬家畜繁殖技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種可用于鑒定綿羊早期胚胎性別牙釉蛋白基因引物序列，該引物序列為:上游引物5'-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3'，下游引物5'-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3'，以及用鑒定綿羊早期胚胎性別的常規(guī)PCR方法。本發(fā)明的牙釉蛋白基因引物序列和檢測綿羊胚胎性別的方法，提高了反應(yīng)的靈敏度，縮短了性別鑒定所需的時間，不容易產(chǎn)生污染，而且適合在胚胎移植現(xiàn)場操作，便于在生產(chǎn)實際中推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N15/11GK101935700SQ20101022705
公開日2011年1月5日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者俞頌東, 應(yīng)璐祺, 王爭光, 王莉, 白惠琴, 陳阿琴 申請人:浙江大學(xué)