專利名稱：一種快速檢測(cè)綿羊多胎FecB基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種Tetra-primer ARMS-PCR快速檢測(cè) 綿羊多胎FecB基因的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是最具有潛力的第三 代分子標(biāo)記，在多態(tài)性研究、基因圖譜構(gòu)建、表型性狀和疾病連鎖分析中具有重要作用。而 SNP檢測(cè)是當(dāng)前國(guó)際上研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多商品化和專門化的儀器。目前，用于檢 測(cè)SNP的方法有很多種，但各有優(yōu)缺點(diǎn)，在具有快速和高通量的同時(shí)仍存在一些不足，主要 表現(xiàn)為樣品前處理要求高，試劑昂貴且多數(shù)必須依賴于儀器生產(chǎn)商，少量樣本檢測(cè)成本高 等不足，因此不利于在普通實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。2001年前后，國(guó)外三個(gè)研究小組幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)控制Booroola美利奴羊多胎 的主效基因即FecB基因，該基因是綿羊6號(hào)染色體上骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB基因 (Bonemorphogenetic proteins receptor type IB,BMPR-IB)A^G 突變。通過(guò)序列測(cè)定和PCR-RFLP的方法可以實(shí)施對(duì)該基因的檢測(cè)，且已用于多胎綿羊早期 分子標(biāo)記輔助選擇。我國(guó)較早在關(guān)于綿羊多胎FecB基因研究中也是采用了這些方法(王 根林等，2003 ；柳淑芳等，2003)。但該方法相對(duì)比較繁瑣且所用內(nèi)切酶的價(jià)格較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種快速檢測(cè)綿羊FecB 基因的方法。一種快速檢測(cè)綿羊多胎FecB基因的方法，利用特異性上游引物F1、下游引物Rl和 參照上游引物F2、參照下游引物R2共同對(duì)待測(cè)綿羊基因組DNA擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行電泳分析，確定序列擴(kuò)增產(chǎn)物中條帶大小和數(shù)目；其中，上游引物Fl:5' —GCTGGTTCCGAGAGACGAAAATATAGCG—3'；下游引物Rl:5' —GTTTTCATGCCTCATCAACACCGGCT—3‘；參照上游引物F2 5 ‘ —TCAGATGGTGAAACAGATTGGAAA—3 ‘；參照下游引物R2 5 ‘ —AGAAAGAGAGGAAAGCTAGGAAACC—3 ‘。所述的快速檢測(cè)綿羊多胎FecB基因的方法，所述PCR擴(kuò)增條件為PCR反應(yīng)總體 積 20 μ L，其中基因組 DNA 50 lOOng，IOXbuffer 2 μ L ;MgCL21. 5mmol/L ;dNTP 濃度 ().2mmol/L ；DNA Taq 酶 1. OU ；特異引物 Fl 和 Rl 各 20pmol ；參照引物 F2 和 R2 各 5pmol ； 加雙蒸水至 20 μ L ；PCR 反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，循環(huán) 30 次；72°C 延伸 5min。。 所述的快速檢測(cè)綿羊多胎FecB基因的方法，所述電泳分析中，取PCR產(chǎn)物8 μ L經(jīng) 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。 應(yīng)用本方法對(duì)PCR-RFLP(即限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性)和測(cè)序方法已經(jīng)測(cè)試的109份綿羊樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果表明，前兩種方法結(jié)果完全一致，即湖羊均為BB基因 型，美利奴羊均為++基因型，而美利奴羊和湖羊雜交Fl代均為B+基因型。因此，準(zhǔn)確性很
尚ο本發(fā)明建立了一種簡(jiǎn)便易行、耗時(shí)短、結(jié)果易于判讀、用以檢測(cè)綿羊FecB基因突 變的新方法，以提高測(cè)定FecB基因型的效率，使之易于在實(shí)踐中推廣和應(yīng)用于大規(guī)模群體 的檢測(cè)。


圖1為四引物ARMS PCR法檢測(cè)綿羊FecB基因的電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。1.1材料與試劑用于研究的湖羊樣品采自上海永輝種羊場(chǎng)(87只)，并以該場(chǎng)引進(jìn)的德國(guó)美利奴 羊(6只)以及和湖羊雜交Fl代(16只)作為對(duì)照。每只羊在耳尖部用75%酒精棉球消毒 后用耳缺鉗取耳皮膚組織約5g，酚-氯仿法抽提基因組DNA，-20°C保存?zhèn)溆?。Taq DNA聚 合酶和dNTP及PAGE凝膠電泳和染色等其它試劑均購(gòu)自南京生興生物技術(shù)公司。特異性引物設(shè)計(jì)(a)下游引物BB 型基因組5 ‘ -TATC § GACGGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTGGGCTTCATT—3 ‘
++ 型基因組5 ‘ -TATC @ GACGGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTGGGCTTCATT—3 ‘引物序列 3' —T CGGCCACAACTACTCCGTACTTTTG—5'(b)上游引物BB 型基因組3 ‘ —TCTCCTCCGGTCGACCAAGGCTCTCTGTCTTTATATAG § CTGC-5 ‘++ 型基因組3 ‘ —TCTCCTCCGGTCGACCAAGGCTCTCTGTCTTTATATAG @ CTGC-5 ‘弓丨物序列 5 ‘ —GCTGGTTCCGAGAGACGAAAATATAGC G—3 ‘根據(jù)四引物ARMS PCR原理設(shè)計(jì)綿羊FecB(Genebank登陸號(hào)AF370007)突變點(diǎn)(框 內(nèi)字母代表突變點(diǎn))特異性引物，其序列如下上游引物Fl:5' —GCTGGTTCCGAGAGACGAAAATATAGCG—3'下游引物Rl:5' —GTTTTCATGCCTCATCAACACCGGCT—3‘下游引物3'末端堿基與++基因型匹配而與BB基因型不匹配，在PCR過(guò)程中BB 基因型個(gè)體就會(huì)因在3'末端堿基磷酸二酯鍵形成困難而不能延伸，反應(yīng)終止而無(wú)特異性 擴(kuò)增，電泳結(jié)果中就無(wú)此特異性條帶；上游引物3'末端堿基與BB基因型匹配而與++基因 型不匹配，在PCR產(chǎn)物中就無(wú)++基因型特異性條帶；對(duì)于雜合子(B+)來(lái)說(shuō)，兩種基因型同 時(shí)存在，故擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)具有BB基因型和++基因型的特有條帶。同時(shí)，根據(jù)該技術(shù)原理 在倒數(shù)第三個(gè)堿基引入錯(cuò)配(劃線字母代表引入錯(cuò)配堿基)，以提高檢測(cè)的特異性。1.3參照引物設(shè)計(jì)根據(jù)FecB基因序列在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，用以在PCR擴(kuò)增中作為陽(yáng)性對(duì)照。序列如下上游引物F2 5 ‘ —TCAGATGGTGAAACAGATTGGAAA—3 ‘下游引物R2 5 ‘ —AGAAAGAGAGGAAAGCTAGGAAACC—3 ‘1. 4四引物ARMS PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化四引物ARMS PCR用于SNP檢測(cè)的關(guān)鍵除了引物設(shè)計(jì)之外，主要是對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu) 化。本發(fā)明中采用PCR-RFLP檢測(cè)后已知的綿羊個(gè)體基因組模板，在固定其它條件不變的情 況下對(duì)以下因素進(jìn)行了逐一優(yōu)化。1.4. 1退火溫度的優(yōu)化退火溫度是影響PCR反應(yīng)特異性的重要因素，本發(fā)明中固定其它PCR條件不變，對(duì) 退火溫度為64°C、62°C、60°C、58°C和56°C 5個(gè)溫度進(jìn)行了優(yōu)化。1. 4. 2Mg2+濃度、dNTP濃度和Taq酶的用量及循環(huán)數(shù)的優(yōu)化在最適退火溫度下，20μ L反應(yīng)體系中分別對(duì)Mg2+濃度(1.5、1.8、2.0、2. 5、 3.0mmol/L)、dNTP 濃度(0. 15、0· 20,0. 25,0. 3mmol/L)和 Taq 酶的用量(0. 5、1. 0、1. 5U)及 循環(huán)數(shù)(25、30、35)進(jìn)行優(yōu)化。1.4.3引物組合和引物濃度的優(yōu)化在最適退火溫度、Mg2+濃度、dNTP濃度和Taq酶用量條件下，在20 μ L反應(yīng)體系中 對(duì)引物各組合(見(jiàn)表1)進(jìn)行靈敏度優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行內(nèi)外引物濃度比(4 1、2 1、 1 1、1 2、1 4)優(yōu)化。1. 5四引物ARMS PCR擴(kuò)增和電泳PCR 反應(yīng)總體積 20 μ L，其中基因組 DNA 50 lOOng，IOXbuffer 2 μ L ； MgCL21. 5mmol/L ；dNTP 濃度 0. 2mmol/L ；DNA Taq 酶 1. OU ；特異引物 Fl 和 Rl 各 20pmol ；參 照引物F2和R2各5pmol ；加雙蒸水至20 μ L0PCR 反應(yīng)程序；94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30s，62°C 30s, 72°C 30s，循環(huán) 30 次；72°C延 伸5min。取PCR產(chǎn)物8 μ L經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。1. 6四引物ARMS PCR引物擴(kuò)增結(jié)果判讀和意義根據(jù)特異性引物3'端阻斷類型，其不同配對(duì)引物擴(kuò)增片段大小和意義見(jiàn)表1，電 泳圖譜中有220bp和120bp條帶的為BB基因型；有220bp和160bp條帶的為++基因型，而 有220bp、160bp和120bp三條帶的為B+基因型。表1各對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度及意義
產(chǎn)物長(zhǎng)度
I:游引物 下游引物陽(yáng)性結(jié)果及意義陰性結(jié)果及意義
(bp) t
權(quán)利要求
一種快速檢測(cè)綿羊多胎FecB基因的方法，其特征在于，利用特異性上游引物F1、下游引物R1和參照上游引物F2、參照下游引物R2共同對(duì)待測(cè)綿羊基因組DNA擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，確定序列擴(kuò)增產(chǎn)物中條帶大小和數(shù)目；其中，上游引物F15′ GCTGGTTCCGAGAGACGAAAATATAGCG 3′；下游引物R15′ GTTTTCATGCCTCATCAACACCGGCT 3′；參照上游引物F25′ TCAGATGGTGAAACAGATTGGAAA 3′；參照下游引物R25′ AGAAAGAGAGGAAAGCTAGGAAACC 3′。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)綿羊多胎FecB基因的方法，其特征在于，所述PCR 擴(kuò)增條件為PCR反應(yīng)總體積20 μ L，其中基因組DNA 50 lOOng，10Xbuffer2y L ；MgCL2 1. 5mmol/L ；dNTP 濃度 0. 2mmol/L ；DNA Taq 酶 1. OU ；特異引物 Fl 和 Rl 各 20pmol ；參照引物 F2 和 R2 各 5pmol ；加雙蒸水至 20 μ L ；PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，循環(huán) 30 次；72°C延伸 5min。。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)綿羊多胎FecB基因的方法，其特征在于，所述電泳 分析中，取PCR產(chǎn)物8 μ L經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)綿羊多胎FecB基因的方法。本發(fā)明所提供的利用四條單鏈擴(kuò)增引物進(jìn)行FecB基因分型的方法，是由特異性上游引物F1、下游引物R1和對(duì)照上游引物F2、下游引物R2共同對(duì)待測(cè)綿羊基因組DNA擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，確定序列擴(kuò)增產(chǎn)物中條帶大小和數(shù)目。產(chǎn)物有三種情況包含220bp和120bp；220bp和160bp；220bp、160bp和120bp。本發(fā)明的研究結(jié)果表明Tetra-primer ARMS-PCR對(duì)綿羊FecB基因的檢測(cè)具有快速簡(jiǎn)便，成本低廉等特點(diǎn)，對(duì)于研究和綿羊育種提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，并給綿羊生產(chǎn)者帶來(lái)效益。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101979659SQ20101054499
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者萬(wàn)鵬程, 劉守仁, 楊利國(guó), 石國(guó)慶, 管峰, 艾君濤 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院