專利名稱：一種篩選高效降解茶籽餅粕的微生物菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一套篩選高效降解茶籽餅粕的生物菌株的方法，屬于發(fā)酵工程、生物質(zhì)資源再利用的生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
油茶是我國南方丘陵地區(qū)一種重要的油料作物，占全國木本食用油料作物的80% 以上。茶籽餅，又稱茶粕，別名茶麩、茶枯，茶籽餅。呈紫褐色顆粒，是野山茶油果實(shí)榨油后剩下的殘?jiān)２枳呀?jīng)榨油后的餅粕中還含有大量的淀粉、蛋白質(zhì)、粗脂肪、可溶性糖和茶皂素等，可以再提取利用。我國油茶林面積約400萬公頃，是世界上油茶品種最多、分布最廣、產(chǎn)量最多的國家。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國采摘茶園面積約為100萬公頃，我國近年來年產(chǎn)油茶茶籽約55萬噸，油茶茶籽含油率為沈% 39%，按機(jī)榨得油率70%計(jì)算，油茶餅粕年均產(chǎn)量約40 萬噸。我國油茶林主要分布在湖南、江西、廣西三省，三省油茶茶籽產(chǎn)量占全國的80%以上。我國油茶茶籽粕和茶葉茶籽粕產(chǎn)量約為70萬噸，由此可見，我國潛在的可利用茶粕資源十分豐富。茶油茶餅粕一般含有7%的粗脂肪，149Γ15%的粗蛋白質(zhì)，33%的粗纖維，40%多的糖類，茶皂素約129Γ18%，是潛在的可利用的茶籽殘?jiān)Y源。因而，開發(fā)利用茶籽粕具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。目前，茶籽主要采用傳統(tǒng)的壓榨法榨油工藝制油，所生產(chǎn)的茶粕中茶皂素、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量過高，不適宜直接用于動(dòng)物飼料的生產(chǎn)，大部分被用作清塘劑、 肥料、燃料，少量用于茶皂素的提取。同時(shí)，因茶籽餅粕中含有109Γ15%溶血性茶皂素，而茶皂素的存在使飼料味苦且辛辣，并對(duì)魚類等水生動(dòng)物有很強(qiáng)的毒性，因此，限制了其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用。但是，如果茶粕去除了有毒物質(zhì)茶皂素，其營養(yǎng)價(jià)值可與米糠媲美，且經(jīng)過微生物發(fā)酵后，可得到較高的菌體蛋白，不僅可以提高茶粕的利用價(jià)值，且可通過降解菌發(fā)酵使之成為一種較好的飼料資源
目前對(duì)茶籽餅粕降解的研究還比較薄弱，代表性的研究有肖玉娟等以提取茶皂素后的茶粕為材料，研究ctmm(粗壯脈紋胞菌)降解茶粕培養(yǎng)基的粗纖維；李君君等通過剛果紅培養(yǎng)基、羧甲基纖維素培養(yǎng)基等培養(yǎng)基纖維素酶獲得6株菌種纖維素酶產(chǎn)生菌；田璨熙等從自然界中篩選得到一株能有效降解具有較強(qiáng)抑菌作用的茶籽餅的菌株T7。 專利KR 20110090215公開了一種具有確保清凈性能佳、起泡好、對(duì)皮膚刺激性小、保濕效果好液體洗滌劑組合物，其中包括59Γ40%陰離子表面活性劑茶皂素，0. 5 20%非離子表面活性劑或兩性表面活性劑，0.0廣10%乳酸和皂素，剩余的尾水量此話不通。皂素從綠茶或皂莢中提取獲得。專利W02011113221公開了一種由70% 80%檸檬油精、2% 10%茶皂素、 19Γ10%卵磷脂、29TlO%檸檬醛和0. 59Tl%檸檬酸組成的洗滌劑，該洗滌劑不損壞汽車、涂料膜和家電玻璃。美國專利US6007822公開了一種包含山茶屬植物三萜皂苷的動(dòng)物飼料組合物在人類和動(dòng)物中具有提高免疫功能，增強(qiáng)抗菌和抗病毒活性，抗突變，抗氧化和清除自由基。專利CN1148598公開了一種提取精制茶皂素的方法，得到98%以上的固體茶皂素。 關(guān)于茶籽餅粕脫毒的報(bào)道更為鮮見，例如黃良柏先生在“脫毒茶粕殘留茶皂素含量的測(cè)定方法比較” 一文中描述了一種茶籽餅粕脫毒的工藝，將脫脂茶粕浸提，固液分離，蒸發(fā)濃縮，噴霧干燥，分別獲得飼料渣和茶皂素。該方法實(shí)質(zhì)是提取茶皂素，附帶性獲得飼料渣，屬于物理脫毒。但這些研究從茶籽餅粕的一個(gè)側(cè)面來解決其中的一個(gè)問題，要么只是茶籽餅粕脫毒方面的研究，要么只是降解粗纖維方面的研究，要么只是降解粗蛋白方面的研究，缺乏系統(tǒng)性降解茶籽餅粕中的茶皂素、粗纖維和粗蛋白研究方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種獲得高效降解茶籽餅粕的微生物菌株的系統(tǒng)方法，該方法既包括茶籽餅粕脫毒，又包括茶籽餅粕粗纖維的降解，還包括茶籽餅粕粗蛋白的降解，是一種系統(tǒng)降解茶籽餅粕中的茶皂素、粗纖維和粗蛋白的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括以下幾個(gè)步驟
(1)高濃度茶皂素耐受菌株篩選配制高濃度茶籽餅粕固體培養(yǎng)基，其中茶籽餅粕 10% 15%，瓊脂 1. 5% 2. 0%,水 85. 0% 90. 0%, pH 自然，12(Tl30°C滅菌 20 30 min,倒平板若干，每個(gè)平板按10倍稀釋法涂布供試土樣、或水樣獲茶籽餅粕廢棄物樣品稀釋液0. 1 mL, 在30°C 40°C培養(yǎng);Γ5 d，將菌落較大、漲勢(shì)好的菌株轉(zhuǎn)接斜面，獲得茶皂素耐受菌株，編號(hào)，供進(jìn)一步獲得高蛋白酶活性菌株的篩選使用。⑵高蛋白酶活性菌株篩選配制干酪素固體培養(yǎng)基，其中干酪素1.09Γ2.0%， 0. 1 mol/L稀鹽酸加熱溶解后，葡萄糖2. 0% 4. 0%，瓊脂1. 5% 2. 0%，用0. lmol/L氫氧化鈉調(diào)pH至5. (Γ7. 0，其余為水，即用自來水定容至預(yù)訂體積，12(Tl30°C滅菌20 30 min，倒平板若干。將上述發(fā)明技術(shù)方案⑴中得茶皂素耐受菌株，點(diǎn)接種于干酪素培養(yǎng)基上平板，在 300C 40°C培養(yǎng)纊3 d，將水解圈直徑與菌落直徑比值較大、漲勢(shì)好的菌株再次轉(zhuǎn)接無菌斜面，獲得蛋白酶高活性菌株，編號(hào)，供進(jìn)一步篩選高纖維素酶活性菌株的篩選使用。(3)高纖維素酶活性菌株篩選配制羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基，其中羧甲基纖維素素1. 0% 2. 0%，自來水加熱溶解后，蛋白胨0. 3% 0. 5%，瓊脂1. 5% 2. 0%，自然pH，用自來水定容至預(yù)訂體積，121°C滅菌25 30 min，倒平板若干。將上述發(fā)明技術(shù)方案⑵中得蛋白酶高活性菌株，點(diǎn)接種于羧甲基纖維素培養(yǎng)基上平板，在30°C 40°C培養(yǎng)2 3 d，用0. 19Γ0. 5%無菌剛果紅液題染色5 min，再用2.09Γ5.0%無菌氯化鈉溶液脫色5 min，選擇水解圈直徑與菌落直徑比值較大、漲勢(shì)好的菌株再次轉(zhuǎn)接無菌斜面，獲得纖維素酶高活性菌株若干，并編號(hào)，4°C冰箱保存、備用。(4)搖瓶發(fā)酵降解茶籽餅粕進(jìn)一步復(fù)篩將所述的上述發(fā)明技術(shù)方案⑶中得茶皂素高耐受性、高蛋白酶活性以及高纖維素酶活性菌株，用于搖瓶發(fā)酵降解茶籽餅粕進(jìn)一步復(fù)篩。其中，培養(yǎng)基按重量百分比取茶籽餅粕29Γ5%，含水重量為959Γ98%，ρΗ自然，100 mL 若干瓶，置于250 mL三角瓶，12(T130°C滅菌20 30 min，分別接種上述發(fā)明技術(shù)方案⑶獲得菌株，2(ΚΓ300 r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)72、4 h，測(cè)定發(fā)酵液中茶皂素含量、游離氨基酸含量、還原糖含量、粗蛋白降解率、粗纖維降解率、蛋白酶活力、纖維素酶活力，選擇茶皂素含量低、游離氨基酸含量高、還原糖含量高、粗蛋白降解率高、粗纖維降解率高、蛋白酶活力高、纖維素酶活力高的菌株，編號(hào)，作為茶籽餅粕發(fā)酵的生產(chǎn)菌種，4°C冰箱保存、備用。(5)茶籽餅粕發(fā)酵降解
①菌種制備按重量百分比取茶籽餅粕29Γ5%、麩皮1%1%，含水重量為939Γ97%，ρΗ自然，12(Tl3(TC滅菌2(T30 min，接種上述發(fā)明技術(shù)方案⑷獲得若干菌株，200 300r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)使該種子培養(yǎng)液中菌體濃度達(dá)到10『109 cfu/mL，作為茶籽餅粕發(fā)酵的生產(chǎn)菌種；
②茶籽餅粕固體發(fā)酵降解按重量百分比取茶籽餅粕409Γ50%、含水重量為50%飛0%， 12(T130°C滅菌3(T40 min制成茶籽餅粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基；再接種上述發(fā)明技術(shù)方案①獲得生產(chǎn)菌種以19Γ3%的接種重量接種到該茶籽餅粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻，堆積成高0. 5^0. 8 m,長度寬度不限的壟堆，上面覆蓋草簾，45 55°C下發(fā)酵5 10天，干燥后即得脫毒且降解了的固體茶籽餅粕；
③茶籽餅粕液體發(fā)酵降解按重量百分比取茶籽餅粕109Γ15%、含水重量為859Γ90%， 于100廣1000 L發(fā)酵罐中，12(T130°C滅菌30 40 min制成茶籽餅粕液體發(fā)酵培養(yǎng)基；再將步驟①獲得生產(chǎn)菌種以1。/。 3。/。的接種重量接種到裝有該茶籽餅粕液體發(fā)酵罐中，32 37°C 下通風(fēng)發(fā)酵4飛天，濃縮后即得脫毒且降解了的茶籽餅粕水解液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
⑴在本發(fā)明方法的微生物篩選過程中，先后采用三項(xiàng)指標(biāo)，即高茶皂素濃度耐受性、 高蛋白酶活性以及高纖維素酶活性，所得菌株具有既可降解粗蛋白，又可降解粗纖維，還將茶籽餅粕脫毒為低毒或無毒，功能全面；
⑵以我國現(xiàn)有工藝生產(chǎn)的未脫毒茶籽餅粕為原料，采用本發(fā)明方法獲得菌株發(fā)酵茶籽餅粕，其價(jià)值高于未經(jīng)發(fā)酵的茶籽餅粕，產(chǎn)品粗蛋白蛋白質(zhì)含量為89Γ12%，游離氨基酸含量達(dá)到7. 5%以上，粗纖維含量為2(Γ25%，還原糖含量達(dá)6. 0%以上，皂素含量低于0. 5%，脫毒率高于95%。此方法可以很好地解決現(xiàn)有技術(shù)存在的茶籽餅粕毒性、粗蛋白粗和纖維含量高的問題。⑶本發(fā)明是農(nóng)產(chǎn)品下腳料廢棄物深度利用，具有生產(chǎn)工藝簡單、無三廢、投資小、 易于規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)。利用該方法獲得菌株可以簡化多菌株、多菌種發(fā)酵茶籽餅粕生產(chǎn)工藝方法，減少了微生物發(fā)酵茶籽餅粕使用菌株種類，是一種能獲得簡化工藝、降解效果好的微生物菌株的方法。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 篩選高濃度茶皂素耐受菌株，配制高濃度茶籽餅粕固體培養(yǎng)基，其中茶籽餅粕10%，瓊脂2.0%，水88. 0%，定容體積100 mL, pH自然，121°C滅菌25 min，倒平板8個(gè)， 每個(gè)平板按10倍稀釋法涂布供試土樣稀釋液0. 1 mL，在35°C培養(yǎng)4d，獲得菌落較大、漲勢(shì)好、茶皂素耐受菌株 7 株，編號(hào)為 lys2201, lys2202, lys2203, lys2204, lys2205, lys2206, lys2207，并轉(zhuǎn)接斜面。實(shí)施例2 :篩選高蛋白酶活性菌株，配制干酪素固體培養(yǎng)基，其中干酪素2. 0%，0. 1 mol/L稀鹽酸加熱溶解后，葡萄糖3. 0%，瓊脂2. 0%，用0. 1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至5. 5，用自來水定容至100 mL，12rC滅菌25 min，倒平板8個(gè)。將菌株Iys2201、lys2202、lys2203、 lys2204、lys2205、lys2206, lys2207點(diǎn)接種于干酪素培養(yǎng)基上平板，在33°C培養(yǎng)2. 5 d， 將水解圈直徑與菌落直徑比值較大、漲勢(shì)好的菌株再次轉(zhuǎn)接無菌斜面，其中菌株lys2201、 lys2203、lys2204、lys2205、lys2207的水解圈直徑與菌落直徑比值均大于5. 0，并轉(zhuǎn)接斜面，作進(jìn)一步復(fù)篩備用。
實(shí)施例3 篩選高纖維素酶活性菌株，配制羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基，其中羧甲基纖維素2. 0%，自來水加熱溶解后，蛋白胨0. 5%，瓊脂2. 0%，自然pH，用自來水定容至100 mL, 121°C滅菌 25 min，倒平板 8 個(gè)。將菌株 lys2201、lys2202、lys2203、lys2204、lys2205、 lys2206, lys2207點(diǎn)接種于羧甲基纖維素培養(yǎng)基上平板，在33°C培養(yǎng)3 d，用0. 無菌剛果紅液體5 mL，染色平板水5 min，再用2.0%無菌氯化鈉溶液脫色5 min，選擇水解圈直徑與菌落直徑比值較大、漲勢(shì)好的菌株再次轉(zhuǎn)接無菌斜面，其中菌株lys2201、lys2202、 lys2203、lys2207的水解圈直徑與菌落直徑比值均大于4. 0，并轉(zhuǎn)接斜面，4°C冰箱保存、備用。實(shí)施例4 茶籽餅粕搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，配制培養(yǎng)基按重量百分比取茶籽餅粕4%，含水重量為94%，pH自然，100 mL 7瓶，置于250mL三角瓶，121°C滅菌25 min，分別接種菌株 lys2201、lys2202、lys2203、lys2204、lys2205、lys2206, lys2207, 200 r/min 條件下，搖床振蕩培養(yǎng)84 h，其中菌株lys2207發(fā)酵液茶皂素含量為0. 2%、游離氨基酸含量7. 6%、還原糖含量5. 3%、蛋白酶活力與纖維素酶活力最高，因此，選擇菌株lys2207作為茶籽餅粕發(fā)酵的生產(chǎn)菌種，4°C冰箱保存、備用。實(shí)施例5 茶籽餅粕發(fā)酵生產(chǎn)菌種的制備，按重量百分比取茶籽餅粕4%、麩皮2%， 含水重量為92% 97%，pH自然，121°C滅菌30 min，接種菌株lys2207，在200 r/min條件下， 15L振蕩培養(yǎng)36 h，該種子培養(yǎng)液中菌體濃度達(dá)到1. 2 X IO9 cfu/mL,體積8L，作為茶籽餅粕發(fā)酵的生產(chǎn)菌種。實(shí)施例6 茶籽餅粕固體發(fā)酵降解，按重量百分比取茶籽餅粕40%、含水重量為 60%, 125°C滅菌30 min制成茶籽餅粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基；將菌株lys2207的生產(chǎn)菌種，以1. 5% 的接種重量接種到該茶籽餅粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基中(12000kg)，混合均勻，堆積成高0.6 mX 寬2. 5mX長10. Om的壟堆，上面覆蓋草簾，45°C 55°C下發(fā)酵9天，干燥后即得脫毒且降解了的固體茶籽餅粕；產(chǎn)品粗蛋白含量為9%，游離氨基酸含量達(dá)到7. 7%，提高了 43. 5%，粗纖維含量為21% ；還原糖含量達(dá)6. 5%，提高了 16. 4% ；皂素含量0. 3%，降低了 96. 8%。實(shí)施例7 茶籽餅粕液體發(fā)酵降解，按重量百分比取茶籽餅粕10%、含水90%，于 100L發(fā)酵罐中，121°C滅菌30 min制成茶籽餅粕液體發(fā)酵培養(yǎng)基；將菌株lys2207的生產(chǎn)菌種，以1%的的接種重量接種到裝有該茶籽餅粕液體發(fā)酵罐中，37°C下通風(fēng)發(fā)酵5天，濃縮后即得脫毒且降解了的茶籽餅粕水解液。產(chǎn)品粗蛋白含量為8. 5%，游離氨基酸含量達(dá)到 7. 5%，提高了 40. 3%，粗纖維含量為20%，還原糖含量達(dá)6. 1%，提高了 15. 1% ；皂素含量0. 2%。
權(quán)利要求
1.一種篩選高效降解茶籽餅粕的微生物菌株的方法，其特征包括以下幾個(gè)步驟⑴高濃度茶皂素耐受菌株的篩選配制高濃度茶籽餅粕固體培養(yǎng)基，按重量百分比取茶籽餅粕10% 15%、瓊月旨1. 5% 2. 0%,/Jc 85% 90%，pH自然，12(Tl30°C滅菌20 30 min，利用該培養(yǎng)基篩選高濃度茶皂素耐受菌株，編號(hào)，供進(jìn)一步獲得高蛋白酶活性菌株的篩選使用；⑵高蛋白酶活性菌株的篩選配制干酪素固體培養(yǎng)基，按重量百分比取干酪素 1. 0% 2. 0%、葡萄糖 2. 0% 4. 0%，瓊脂 1. 5% 2. 0%，水 85% 90%，pH 5 7，120 130°C滅菌 20 30 min，利用該培養(yǎng)基從高濃度茶皂素耐受菌株中進(jìn)一步篩選出高蛋白酶活性菌株，編號(hào)，供進(jìn)一步篩選高纖維素酶活性菌株的篩選使用；(3)高纖維素酶活性菌株的篩選配制羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基，按重量百分比取羧甲基纖維素1. 0% 1. 5%、蛋白胨0. 3% 0. 5%，瓊脂1. 5% 2. 0%，水85% 90%，pH 5 7，12(Tl30°C 滅菌2(T30 min，利用該培養(yǎng)基從高濃度茶皂素耐受菌株、且具有高蛋白酶活性菌株中進(jìn)一步篩選出高纖維素酶活性菌株，編號(hào)，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得茶皂素高耐受性、高蛋白酶活性以及高纖維素酶活性菌株，用于搖瓶發(fā)酵降解茶籽餅粕進(jìn)一步復(fù)篩其特征包括復(fù)篩培養(yǎng)基按重量百分比取茶籽餅粕2% 5%、含水重量為93% 97%，pH自然，100 mL若干瓶，置于250 mL三角瓶，12(Tl30°C 滅菌2(T30 min，分別接種步驟⑶獲得菌株，20(T300 r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)72、4 h， 選擇茶皂素含量低、游離氨基酸含量高、還原糖含量高、粗蛋白降解率高、粗纖維降解率高、 蛋白酶活力高、纖維素酶活力高的菌株，編號(hào)，作為茶籽餅粕發(fā)酵的生產(chǎn)菌種，4°C冰箱保存，備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲得茶皂素高耐受性、高蛋白酶活性以及高纖維素酶活性菌，用于降解茶籽餅粕的方法，其特征在于①菌種制備按重量百分比取茶籽餅粕29Γ5%、麩皮1%1%，含水重量為939Γ97%，pH 自然，12(Tl30°C滅菌2(T30 min，接種步驟⑶獲得菌株，200 300 r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)M 36 h，使該種子培養(yǎng)液中菌體濃度達(dá)到10『109cfU/mL，作為茶籽餅粕發(fā)酵的生產(chǎn)菌種；②茶籽餅粕固體發(fā)酵降解按重量百分比取茶籽餅粕409Γ50%、含水重量為50%飛0%， 12(T130°C滅菌3(T40min制成茶籽餅粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基；再將步驟①獲得菌株以1% 3%的接種重量接種到該茶籽餅粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻，堆積成高0. 5^0. 8m，長度不限的壟堆，上面覆蓋草簾，45°C 55°C下發(fā)酵5 10天，干燥后即得脫毒且降解了的固體茶籽餅粕；③茶籽餅粕液體發(fā)酵降解按重量百分比取茶籽餅粕109Γ15%、含水重量為859Γ90%， 于100廣1000 L發(fā)酵罐中，12(T130°C滅菌30 40 min制成茶籽餅粕液體發(fā)酵培養(yǎng)基；再將步驟①獲得菌株以19Γ3%的接種重量接種到裝有該茶籽餅粕液體發(fā)酵罐中，32 37°C下通風(fēng)發(fā)酵4飛天，濃縮后即得脫毒且降解了的茶籽餅粕水解液。
全文摘要
一種篩選高效降解茶籽餅粕的微生物菌株的方法，該方法依次是通過高濃度茶籽餅粕培養(yǎng)基初篩，干酪素培養(yǎng)基復(fù)篩，羧甲基纖維素培養(yǎng)基三次篩選，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩獲得。該菌株同時(shí)具有茶籽餅粕高濃度茶皂素的耐受性、高蛋白酶活性和高纖維素酶活性的性能。利用該方法獲得菌株發(fā)酵茶籽餅粕，其營養(yǎng)價(jià)值高于未經(jīng)發(fā)酵的茶籽餅粕，產(chǎn)品粗蛋白蛋白質(zhì)含量為8%~12%，游離氨基酸含量達(dá)到7.5%以上，提高了40%。粗纖維含量為20%~25%，還原糖含量達(dá)6.0%以上，提高了15%。皂素含量低于0.5%，脫毒率達(dá)95%以上。該方法很好地解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的茶籽餅粕毒性、粗蛋白和粗纖維利用率低的問題。利用該方法獲得菌株可以簡化多菌株、多菌種發(fā)酵茶籽餅粕生產(chǎn)工藝方法，是一種能獲得簡化工藝、降解效果好的微生物菌株的方法。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102517380SQ20111044165
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者劉來壯, 吳永堯, 林元山 申請(qǐng)人:林元山