專利名稱：：腸道病毒71型基因組的序列及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及腸道病毒，更具體的涉及腸道病毒71型基因組的序列及其應用。
背景技術：
：2008年全國大面積爆發(fā)了兒童手足口病。引起此次手足口病的罪魁禍首就是人腸道病毒71型(EV71)。截止到2008年12月16曰，NCBI公布的EV71相關序列為2145個，但其中并沒有EV71病毒全基因序列，因此無法得到全面資料以準確判斷全球以及我國人腸道病毒71型的流行和遺傳變異情況，進而無法了解目前全球手足口病的流行和遺傳衍化情況。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種EV71病毒的全基因序列。為解決上述問題，本發(fā)明一方面提供了一種腸道病毒71型全基因組序列，其具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。本發(fā)明另一方面提供了所述序列及與所述序列同源性達50-95%的序列在制備用于預防腸道病毒71型疫苗和血清學診斷ELISA試劑中的用途。本發(fā)明另一方面提供了所述序列及與所述序列同源性達50-95%的序列在制備抗腸道病毒71型中和抗體中的用途。本發(fā)明的有益效果在于該序列為進一步獲得我國華南地區(qū)EV71型遺傳衍化特征提供了客觀依據，為進一步研制開發(fā)針對我國不同地區(qū)發(fā)病A^的血清學ELISA診斷試劑和疫苗提供了可靠的數(shù)據資料，為深入研究EV71的遺傳變異規(guī)律及手足口病的致病機制提供了寶貴資源。圖1是用megalign中的聚類clusterW進行一個聚類后，獲得的比對結果。圖2是EV71VP1區(qū)進化樹分析結果。具體實施例方式病毒基因組核酸的提取和測序1.采集標本采集深圳市東湖醫(yī)院收治的手足口病人的病毒分離標本，包括糞便、皰滲液、腦脊液和咽拭子，用于采集咽拭子的無菌拭子要;^文在適當?shù)谋４嬉褐?，如維持液或生理鹽水，以防干燥。2.標本處理2.1糞便標本的處理2.1.1每管中加入10mlPBS、lg玻璃珠和lml氯仿;2丄2在生物安全拒中從每份糞便標本中取大約2g加入到標記好的離心管中；2丄3將剩余的原始標本留在原容器中并在-20。C凍存；2丄4擰緊離心管，機械震蕩器劇烈震蕩20分鐘；2.1.5蓋好離心機的蓋子，密封離心桶，冷凍離心機在1500g離心20分鐘；2丄6在生物安全拒中將每一份標本的上清液分別吸入2個有外螺旋蓋的凍存管中；2丄7—管糞便懸液凍存于-20。C作為備份，另一管存于4-8。C以備接種。2.2皰滲液標本的處理皰滲液標本直接用于病毒分離。2.3腦脊液標本的處理腦脊液標本直接用于病毒分離。2.4咽拭子標本的處理在標本保存液中充分攪動咽拭子(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞，然后在4。C條件下，10000rpm離心20分鐘，用上清接種到細胞上，如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌。3.分離病毒3.1顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康的，一個健康的4單層細胞會在傳代后3天左右形成；3.2倒掉生長液(GM)，換上1-1.2ml的維持液(MM);3.3每一份標本需要同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記每支細胞培養(yǎng)管(包括標本的編號、日期、傳代數(shù))；3.4每一種細胞至少標記一管作為陰性對照；3.5每支試管接種0.2ml的標本懸液，34-35。C溫度培養(yǎng)；3.6每天使用倒置顯微鏡觀察細胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細胞病變效應(CPE)的出現(xiàn)(如細胞變圓，折光增強并脫離管壁等)；3.7記錄接種管和對照管細胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE(l+-4+)、提示細胞受毒性反應、老化或污染的影響而發(fā)生的變化(l+，<25%;2+,25%國50%;3+，50%-75%;4+，75%-100%);3.8如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實記錄，并觀察直到75。/。的細胞發(fā)生變化(3+CPE)，然后儲藏在-20。C以備二次傳代。同一病例的二次傳代的病毒分離物可以放到一起用于進一步的鑒定；3.9第l代培養(yǎng)見可疑細胞病變時繼續(xù)傳代，待細胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后-2(TC或-7(TC凍存；3.10—代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現(xiàn)，將病毒保存在-20。C冰箱(二代病毒)。因第二代病毒滴度高于第一代病毒，所以選用第二代病毒進行鑒定。3.11如果7天之后沒有CPE出現(xiàn)，那么盲傳1代繼續(xù)觀察7天。盲傳2代后，仍然沒有出現(xiàn)CPE，則判定為陰性；如果接種后24小時內出現(xiàn)CPE，很可能是標本中的非特異性成分導致的毒性反應。4.提取病毒核酸可使用商業(yè)化試劑盒來提取RNA，例如使用QIAGENViralRNAMiniExtractionKit(QIAGEN公司)從臨床標本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒RNA:4.1向一支1.5ml離心管中加入560pi的AVL緩沖液(含CarrierRNA);4.2再向這支離心管中加入140^臨床標本或病毒分離培養(yǎng)物，充分混勻至少15秒；4.3室溫下(15。C-25。C)放置IO分鐘，瞬時離心；4.4加入560pi純乙醇，充分混勻至少15秒，瞬時離心；4.5小心加入約630[xl的混合溶液至QIAamp柱中，將QIAamp柱套在收集管上，然后8000rpm離心5秒，使液體通過濾膜；4.6棄去收集管中的液體，重復步驟4.6;4.7棄去收集管中的液體，小心加入750pl的AW1緩沖液至QIAamp柱中，8000rpm離心5秒，使液體通過濾膜；4.8棄去收集管中的液體，小心加入750pi的AW2緩沖液至QIAamp柱中，8000rpm離心5秒，使液體通過濾膜；4.9棄去收集管中的液體，13000rpm再次離心1分鐘；4.10將QIAamp柱放入一支干凈的1.5ml的離心管中；4.11向膜上加入40)il的EB緩沖液，然后室溫靜置2-5分鐘；4.128000rpm離心1分鐘，離心下來的液體即為所需的核酸溶液；4.13RNA的檢測4.13.1將制膠用具以及電泳槽用水沖洗干凈后，使用3%過氧化氫室溫浸泡15分鐘，最后使用lxTBE沖洗2-3次，再加入lxTBE電泳緩沖液。4.13.2將1.20/o瓊脂糖凝膠方tA水平電泳槽中，將RNA樣品(2-5pl)和等體積的2xGelloadingbufferAmbion混合均勻，加到凝膠點樣孔中，電泳。4.13.3將膠在EB溶液中染色IO分鐘，紫外燈檢測。4.13.4Agilent2100bioanalyzer(Agilent公司)檢測RNA濃度和質5基因組測序5.1反轉錄第一鏈的合成5.11在200pl的PCR管中加入以下試劑(試劑盒購自invitrogen公司)mRNAl(MN6引物(lug/pl)或oligo(dT)18-20(500ug/pl)1dNTPmix(10mM)2pL5丄2在PCR儀上65。C變性5分鐘后，立即將EP管置于冰上，離心。5.1.3按照下列的配比準備反應混合物，5x1ststrandbuffer4lOOmMDTT1RNAseOUT(40U小L)1|iL5.1.4將步驟5.1.3中的6pl混合物加入步驟1中的EP管中，混勻后如果是N6引物則逆轉錄室溫(25-C)放置10分鐘，如果是oligo(dT)則42。C放置2分鐘。5丄5取出EP管后加入1^SuperscriptII(200U/W),混勻，放入PCR儀，按照以下程序進行反應Step142°C50分鐘Step270°C15分鐘Step34°C保存5.2保守區(qū)引物設計在NCBI數(shù)據庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中選取已經提交的小RNA病毒序列，通過軟件比對進行保守區(qū)篩選，對保守區(qū)高的部分選取相應的序列作為引物，對于分段擴增的區(qū)域，引物擴增片段需要有200bp左右的重疊區(qū)。這里以比對軟件megalign為例，列舉引物設計過程。首先，從NCBI下載一系列序列，用megalign中的聚類clusterW進行一個聚類，獲得比對結果，如附圖1所示。黑箭頭表示選取出的保守區(qū)高的區(qū)域，可以用來作為擴增引物，對于一條片斷長度大的病毒，可以選取多個這樣的區(qū)域，將病毒分為幾個相互重疊的片段，分別進行擴增測序，選取的序列可以有個別堿基的不同，但不要出現(xiàn)在3，區(qū)。EV71五對序列分別設計為EV71F1TTAAAACAGCTGTGGGTTGEV71R1CGTTTATGTATGGCACTATTATEV71F2CCAGAGTATGTCATTGGGACAGTEV71R2TATCCACGCCCTGACGTGCTTCAEV71F3CCATTCATGTCACCTGCGAGEV71R3CGGTGTTTGCTCTTGAACTGCATEV71F4TCCTGGCTCAAGAAGTTCAATGAEV71R4TTAACCCACTGGATCTCTCCTTEV71F5AAAAGTTTAGGGATATCACCAAEV71R5GCTATTCTGGTTATAACAAA5.3保守區(qū)引物擴增5.3.1配置PCR擴增體系根據所用酶的不同，按照擴增酶的說明書配置PCR擴增體系(根據擴增結果和擴增保真度要求改變PCR擴增體系，一般taq酶擴增就可滿足要求)，taq酶擴增體系如下反應體系組成體積體積Taq酶0.250.1nl10xBuffer52^dNTP(10mM)4^11.6^上游引物(20^m)2^0.8^1下游引物(20pm)2^0.8^超純水35.7514.1模板DNA(步驟2所得)1^0.6^1總體系50[il20PCR擴增體系配置過程需在水上完成，注意不同模板之間的區(qū)分，PCR擴增體系需混合均勻，且PCR管管蓋要蓋嚴，防止PCR體系在反應過程中蒸干。5.3.2PCR擴增及檢測將PCR管放在PCR儀上，合上PCR儀頂蓋并蓋緊，根據設計的保守區(qū)引物的TM值，設置PCR反應程序，PCR程序如下94°C5分鐘94°C30秒、(Tm-3畫5)。C72°C72°C10°C45秒l分30秒5分鐘保存35-40個循環(huán)反應完畢，取出PCR管，4。C短期存放；用2。/。濃度的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。5.4PCR產物回收和連接5.4.1PCR產物膠回收a.徹底洗凈電泳槽和配膠槽，然后用純水或lxTAE沖洗2-3遍；在洗凈電泳槽中加入新的lxTAE緩沖液，并配制一塊2%的瓊脂糖凝膠。b.將5pl6x溴酚藍加入20^DNA溶液中，混勻后加入到一個加樣孔中，每個樣品需要隔一個加樣孔，點上相應DNAmarker。c.100V電泳2小時，電泳時環(huán)境溫度不能過高。d.將染色槽用自來水清洗干凈后用純水或lxTAE沖洗2-3遍，倒入新的lxTAE;加入適量EB,攪拌均勻，將膠放入染色槽，染色IO分鐘;e.取一2ml的eppendorf管，并記錄重量，備用；f.取一張保鮮膜，將染好的膠放在膜上，放入凝膠成像儀照相并存儲膠圖，然后將膠連同膜放于紫外分析儀上，準備切膠；g.以DNAmarker做為參照，切取目的條帶，放入稱量好的eppendorf管中，每個樣品用一個對應的刀片；h.將切割后的凝膠放入凝膠成像儀照相并存儲膠i.稱量放有膠塊的eppendorf管重量，并記錄；j.用AxygeneGelExtractionKit(Axygene^^司)進4亍月交純4b回收，回收產物溶于20plDHPC水。k.取2pl電泳確定膠回收正確，并估測PCR回收產物濃度。5.4.2連接以目前使用的TaKaRaPMD18-T連接試劑盒(TaKaRa公司)為例反應體系組成體積PCR回收產物4.5pipMD18-Tvector0.5nlSolutionI5^1總體積10nl連接體系4'C過夜連接(通過改變PCR回收產物和pMD18-T的含量可以提高連接效率)，第二天回收連接產物，-20匸冷凍保存或者轉化。5.5化學轉化5.5.1AIX平板準備a.用70%的乙醇擦拭潔凈工作臺、各移液沖&,將平亞全部攤開擺放，開紫外照射。b.從烘箱中取出LB固體培養(yǎng)基，并使其冷卻到用手掌捂住不會感覺到太燙手，放入潔凈工作臺照紫外。c.紫外照射約20分鐘以后，關閉紫外，開送風排臭氧。d.以氨千抗生素(AMP):培養(yǎng)基-1:1000的比例在培養(yǎng)基中加入AMP,充分搖勻，注意消除氣泡。e.往平皿中倒入培養(yǎng)基，等所有平板的培養(yǎng)基全部凝固后，收板，倒置。f.根據平板大小配制IPTG+X-GAL的混合液(1:4),一般的用量標準為9cm平板加30ptl混合液，12cm平板力口45nl混合液，15cm平板力口65^混合液。g.將涂布器用70%的乙醇浸濕，并放在乙醇燈上灼燒殺菌后，可放在平板頂蓋的內側面上冷卻至室溫。h.按加量標準在各平板中加入IPTG+X-GAL的混合液，用已冷卻的涂布器將其均勻的涂布在平才a面上，至涂干。i.涂菌時加菌液量標準同上，涂布時不要涂得太干，否則菌無法生長。j.涂板完成后，在平板背面標記所涂內容及涂布時間。5.5.2連接產物轉化a.將感受態(tài)細胞(CaCl2法制備的感受態(tài)細胞)置于冰上融化；給各EB管編號，并以每管100pl的量分裝感受態(tài)細胞。b.將10pl步驟5.4所得連接產物和1-2pl質粒(陽性對照)分別加入到lOOpl感受態(tài)細胞中，輕柔吹打混勻，水浴30分鐘。c.42。C熱敷90秒，并立刻放回冰浴2-5分鐘。d.每PE管加入800^的LB液體培養(yǎng)基，37°C200rpm搖床培養(yǎng)l小時。e.5000rpm離心5分鐘，棄上清700pl。f.將PE管內剩余的約100nl菌液吹打混勻，涂平板。g.將涂布好的平板置于培養(yǎng)箱中，37t:培養(yǎng)14-16小時。h.第二天回收平板，觀察培養(yǎng)狀況，進行克隆鑒定。5.6克隆鑒定通過菌落PCR驗證上述步驟轉化獲得的白斑克隆是否是陽性克隆，步驟如下5.6.1用滅過菌的牙簽挑取白色斑點的單克隆溶于10^無菌水中，從IOW菌液中吸取3pl做PCR反應，程序可以按照先前設定的10目的片革殳擴增的程序進行反應體系為模板DNATaq酶10xBufferdNTP(10mM)上游引物(20^m)下游引物(20^m)超純水總體積3^1;0.12化I.60.80.8II.7"20pl5.6.2電泳;險測菌落PCR結果，將陽性結果菌液接入到液體LB培養(yǎng)基中，37。C和200-220rpm振蕩培養(yǎng)12-16小時。5.7質粒提取(試劑盒購自axygen公司)將接入LB液體培養(yǎng)基的菌液收集1ml保存菌種，剩余LB菌液提取質粒5.7.1取1-4ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液于離心管中，12000rpm離心1分鐘，棄去上清。5.7.2用250^1已加入RNaseA的BufferSI均勻懸浮細菌沉淀。5.7.3加入250^BufferS2，溫和并充分地上下翻轉混合4-6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。5.7.4加入350|alBufferS3,溫和并充分地上下翻轉混合6-8次，12000rpm離心10分鐘。5.7.5吸取步驟4中的離心上清并轉移到DNA制備管(置于2ml離心管中)，12000rpm離心1分鐘。5.7.6將制備管置回離心管,加500^BufferWl,12000rpm離心1分鐘，棄濾液。5.7.7將制備管置回離心管，加700nlBufferW2,12000rpm離心1分鐘，棄濾液，以同樣的方法再用700piBufferW2洗滌一次。棄濾液。5.7.8將制備管置回2ml離心管中，12000rpm離心1分鐘。5.7.9將制備管移入新的1.5ml離心管中，在DNA制備膜中心加60-80nl無菌水，室溫靜置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。5.7.10電泳鑒定正確。5.8測序將電泳鑒定質粒提取效果好的樣品送樣測序。將測序結果通過專業(yè)生物學軟件Seqman進行拼接，通過上述軟件將各個片段一一拼接，可以獲得全長小RNA病毒基因組序列，通過測定多個獨立克隆，可以得到準確的病毒基因組。病毒基因組序列分析序列一致性分析利用網站分析方法http:〃www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index,html，將目標序列輸入到網站數(shù)據提交處，參數(shù)無特殊要求，點擊運行就可獲得結果。1.病毒的生物信息學分析Shzh/S121/08/CHN%A=27.30%G=23.81%T=24.55%C=24.34%Ambiguous=0.000/oA+T=51.85%C+G=48.15Totalnumberofbasesis7404[3565]2.核苷酸序列分析:SEQIDNO:l與其他病毒抹各區(qū)核苷酸水平一致性分析clastalWregionNo.ofcomparedBrCrMSshzh98shzh03TW/2086/98TW/2272/985865/sin/000009CA16G105，UTR7508686969786878882PIregion25868183卯9489878368VP42078384949687878468VP27628082919288888270VP37268282879490898172VP18918284929589848359P2region173477829094797981812A450798291948383807912<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3.氨基酸序列分析http:〃www,ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlSEQIDNO:2與其他病毒林各區(qū)氨基酸水平一致性分析clastalW<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>VPl區(qū)進化樹分析利用進化樹分析軟件mega3進行分析。分析結果見附圖2，通過對該抹病毒的VP1基因序列與已經公布的腸道病毒71型的基因序列進行核苷酸親緣關系樹分析比較，確定了其為C4亞型。病毒基因組為7404個核苷酸的單股正鏈RNA，僅有一個開放閱讀框(ORF)，編碼2194個氨基酸的多聚蛋白，在其兩側為5'和3，非編碼區(qū)(UTRs),在3，非編碼區(qū)的末端含有一個長度可變的多聚腺苷酸尾巴(polyA)。多聚蛋白可進一步被水解成P1、P2、P3三個前體蛋白，Pl前體蛋白可降解成VP1、VP2、VP3、VP4四個病毒外殼蛋白，抗原決定簇基本上位于VP1-VP3上，而VP1蛋白是主要的病毒中和決定因子，它直接決定病毒的抗原性，具有與病毒血清型完全對應遺傳多樣性，以及其變異快速的特點，VP1基因成了EV71基因分型的最重要的對象。所述序列可用于制備用于預防EV71型腸道病毒感染疫苗。所述序列還可用于制備腸道病毒71型中和抗體。序列表<110>深圳市第三人民醫(yī)院<120>腸道病毒71型基因組的序列及其應用<160>1<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>7404<212>RNA<213>人腸道病毒<400>1uuaaaacagcuguggguugcacccacucacagggcccacugggcgcaagcacucugguac60cucgguaccuuugugcgccuguuuuauaccccccccccagugaaacuuagaagcagcaaa120ccacgaucaauagcaggcauaacgcuccaguuaugucuugaucaagcacuucuguuuccc180cggaccgaguaucaauagacugcucgcgcgguugaaggagaaaacguucguuauccggcu240agcuacuucgggaaaccuaguaacaccaugaaaguugcggagggcuucguucagcacucc300cccaguguagaucaggucgaugagucaccgcauuccccacgggcgaccguggcgguggcu360gcguuggcggccugcccaugggguaacccauggggcgcucuaauacggacauggugugaa420gagucuacugagcuaguuaguaguccuccggccccugaaugcggcuaaucccaacugcgg480agcacacgcccacaagccagcggguagugugucguaacgggcaacucugcagcggaaccg540acuacuuuggguguccguguuuccuuuuaucuuuauauuggcugcuuauggugacaauua600aagaauuguuaccauauagcuauuggauuggccauccagugugcaacagagcaauuguuu660accuauuuauugguuuuguaccauuaaccuugaagacugugaccacccuuaauuauaucu720ugacccuuaacacagcuaaacauggguucgcaggugucuacacagcgcuccgguucucac780gaaaacucaaacucagccacugaggguuccaccauaaacuacaccaccauuaauuauuac840aaagacuccuaugcugcuacagcaggcaaacagagucucaagcaggauccagacaaguuu900gcaaauccuguuaaggacaucuucacugaaauggcagcgccacugaaguccccauccgcu960gaggcaugcggauacagugaucgaguggcgcaauuaacuauuggcaacuccaccaucacu1020acgcaagaagcggcuaacaucauagucgguuauggugaguggccuuccuacugcucggau1080ueugacgcuacagcaguggauaaaccaacgcgcccggauguuucagugaauagguuuuac1140acauuggacacuaaauugugggagaaaucguccaagaguugguacuggaaguucccggau1200gugcuaacugaaacugggguuuuugggcaaaaugcacaauuucacuaccucuaccgauca1260ggguuuuguauucacgugcagugcaaugcuaguaaauuccaccaaggagcacucuuaguu1320gcuguccuaccagaguacgucauugggacaguggcaggcgguacagggacggaagacagu1380caccccccuuacaagcagacucaaccuggugccgauggcuucgaguugcaacacccguac1440guacuugaugccggcaucccaauaucacaguuaacagugugcccacaccaauggauuaau1500uugagaaccaacaacugcgcuacaauaauaguaccauacaucaaugcacugccuuuugau1560ucugcc皿gaaccauugcaacuuuggccuauuaguugugccuauuagcccacuagauuac1620gaccaaggagcgacgccaguaaucccuauaacuaucacauuggccccaaugugcucugaa1680uucgcaggucuuaggcaggcagucacgcaaggguuucccaccgagcugaaaccuggcaca1740aaucaauuucugaccacugaugauggcguuucagcaccuauucuaccaaacuuccacccc1800accccuuguauccauauaccuggugaaguuaggaacuugcuggaguuaugccagguggag1860accauucuggagguuaacaaugugcccacgaaugccacuagcuuaauggagagacugcgc1920uuuccggucucagcacaagcagggaaaggugagcugugugcaguguucagagccgacccu1980gggcgaaauggaccguggcaguccaccuugcugggucaguugugcggguacuacacccaa2040uggucaggaucauuggaagucaccuucauguuuacuggauccuucauggcuaccgguaag2100augcucauagccuauacaccgccaggaggcccuuugcccaaagaccgggcgaccgccaug216016uugggcacgcacgucaucugggauuuugggcugcaaucgucuguuacccuugugauacca2220uggaucagcaacacucacuauagagcgcacgcucgagauggaguguuugauuacuacacc2280acagggcuagucaguauaugguaucagacgaauuacgugguuccaauuggggcgcccaau2340acagccuauauaauagcacuagcggcagcccaaaagaacuucacuaugaaauugugcaag2400gaugcuagugauauccugcagacgggcaccauccagggagauaggguggcagauguaauu2460gaaaguuccauaggagauagcgugagcagagcccucacucaagcucuaccagcgcccaca2520ggccagaauacacaggugagcagucaucgacuggauacaggcaagguuccagcacuccaa2580gcugcugagauuggagcaucaucaaaugcuagugacgagagcaugauugagacacgcugu2640guucuuaacucacacagcacagcugagaccacucuugauaguuucuucagcagagcggga2700uuaguuggagagauagaucucccucuugaaggcacaacuaauccaaauggcuaugccaac2760ugggacauagacauaacagguuacgcgcaaaugcguagaaagguggagcuguucaccuac2820augcgcuuugaugcggaguucacuuuuguugcgugcacacccacagggcaaguuguccca2880caauugcuccaauacauguuugugccaccuggagccccuaagccagauuccagggaaucc2940cucgcauggcaaaccgccaccaaccccucaguuuuugucaagcugucagacccuccagca3000cagguuucaguaccauucaugucaccugcgagugc皿accaaugguuuuaugacggauau3060cccacauucggagaacacaaacaggagaaagaucuugaauauggggcauguccuaauaac3120augaugggcacguucucagugcggacuguagggaccuccaaguccaaguacccuuuagug3180guuaggauuuacaugagaaugaagcacguuagggcguggauaccucgcccgaugcguaac3240caaaacuaccuauucaaagccaauccaaauuaugcuggcaacuccauuaagccaacuggu3300accagucgcacagcgaucacuacucuuggaaaauuugggcaacagucuggggccauuuau3360guggguaacuuuagaguggucaaccgucaucuugccacucacaaugauugggcaaaucuu3420guuugggaagacagcucucgcgacuuacucgugucauccaccaccgcccaagguugugac348017acgauugcccgcugcaauugccagacagggguguacuacuguaacucgaggagaaaacac3540uacccagucaguuuuucaaaacccagccugaucuauguagaggcuagcgaguauuaccca3600gccagguaccagucacaucuuaugcucgcacagggccacucagaaccuggugauugcggu3660gguauccuuagaugccaacacggcgucgucgguauagugucaacugguggcaacgggcuc3720guuggcuuugcagacgucagggaccucuugugguuagaugaagaagcuauggagcagggc3780guguccgacuacaucaagggucucggagaugcuuucgggacaggcuucacugaugcaguc3840ucaagggagguugaagcucucaagaguuaucuuauagggucugaaggagcaguugagaaa3900auuuugaaaaaucuuauuaaacuaaucucugcacuggugauuguaaucaggagugauuac3960gacaugguuacccuuacugcaaccuuagcgcugauagguugucauggcaguccuugggcu4020uggaucaaagccaaaacagcuucuaucuuagguaucccuaucgcucaaaagcaaagugcu4080uccuggcucaagaaguucaaugacauggccaacgcugcuaagggguuggaguggguuucc4140aacaagaucagcaaguuuauugauuggcuuaaggagaaaauaguaccagcagccaaggag4200aagguugaauuccuaaauaacuugaaacaguugccacugcuagaaaaucagaucucaaac4260uuggaacaaucugcugccucacaagaggaccuugaaguuauguuugggaaugugucguau4320cuagcccacuucugucgcaaguuccaaccgcuauacgcuacggaagcuaaaagagucuac4380gcccuggagaagagaaugaauaauuacaugcaguucaagagcaaacaccgaauugaaccu4440guaugucucauuauuaggggcucaccaggcacugggaagucucuagccacugguauuauu4500gcucgagcaaucgcugauaaguaccacucuagcguguacucgcuuccaccagacccagau4560cauuuugacgguuacaagcaacaggugguuacagugauggaugacuugugucaaaacccc4620gacggcaaggauaugucuuuauucugucaaaugguauccacuguagacuucauuccacca4680auggcuucucuugaggagaagggaguuuccuucaccucuaaguuugucaucgcauccacu4740aaugccaccaacaucauagugccaacagugucugauucugacgcuauucgccgcagguuc4800uacauggauugugacauugaagugacagacucauacaaaacagaucuagguagacuggau4860gcagggcgagccgcuaaacugugcucugaaaacaacacugcaaacuucaaacguugcagc4920ccauuagugugugggaaagcuauccaacuuagagauagaaagucuaaagucagauacagu4980guggauacgguaguuucagaacuuauuagggaauacagcaauagguccgccauuggcaac5040acaaucgaggcucuuuuccaagguccgcccaaauucaggccaauuaggauuagucuugaa5100gagaaaccagccccagacgcuauuagcgaucuccuugcuaguguagauagugaagaagua5160cgccaguacugcagggaucagggcuggaucaimccugaaacucccaccaacguagagcgg5220caccuuaauagagcagugcuugucaugcaaucuaucgccacaguaguggcgguugucucg5280uugguguaugucaucuacaagcucuuugcagggimucagggugcguacucuggugcuccu5340aagcaagugcuuaagaaaccugcucuucgcacagcaacaguacagggcccgagccuugau5400uuugcucucucccuacugaggaggaacgucaggcaaguccaaacagaccaggggcauuuc5460accauguuggguguuagggaucgcuuagcaguccucccacgccacucacaacccggcaaa5520acuauuuggauugagcacaaacucgugaacguccuugaugcaguugaauugguggaugag5580caaggagucaaccuggaauuaacccucaucacucuugauaccaacgagaaguuuagggau5640aucaccaaauucaucccggaaaauauuagcacugcuagugaugccacccuagugaucaac5700acggagcacaugcccucgauguuugucccggugggugacguugugcaguaugguuuccug5760aaucucagugguaagccuacucaucgcaccaugauguacaacuuuccuacuaaggcaggg5820caauguggagggguggugacaucaguuggaaaagucaucgguauacacauagguggcaac5880gguagacaaggauuuugugcaggucuuaagagaagcuacuuugccagcgagcaaggagag5940auccaauggguuaaacccaauaaagaaacugggaggcuuaacaucaacggaccaacccgc6000accaagcucgagccuaguguguuccaugaugucuuugagggcagcaaggagccagcaguc6060uuacauagcaaagacccucgccuugagguagauuucgagcaggcguuguuuucuaaguac612019guaggaaacacacuacaugagccugaugaguacaucagagaggcagcccuucacuaugcg6180aaccaguugaagcaacuggauauagacaccacucaaaugagcauggaggaagcuugcuac6240ggcacagauaaccuugaggcuauugaucuucauacuagugcaggcuaccccuacagugcc6300cugggaauaaagaagagagauauuuuagacccuaccacuagagaugugagcaaaaugaag6360uuuuauauggauaaauauggucuugaucucccuuacuccaccuaugucaaagacgaacuu6420cgcucgauagauaaaaucaagaaagggaaaucccgacugauugaggccagcaguuugaau6480gauucaguuuaccucagaauggcuuuuggacaccuuuaugaaacuuuccaugcaaacccu6540gggacugugacuggcueagcugugggguguaacccagauguguuuuggaguaagcuacca6600auccugcucccugguucccucuuugccuuugacuacucagg皿augaugcuagucucagc6660ccaguuugguuuagagcacuggaguugguccuuagagagauaggcuauagugaagaggcg6720gucucgcuuauugaaggaaucaaccacacacaccacguguaccgcaacaaaaccuauugc6780gugcuugguggaaugcccucagguugcucaggaacauccaucuuuaacucaaugauuaau6840aacaucaucaucagagcauuacuuauuaaaacauucaagggcauugaucuggaugaacuc6900aacaugguugccuacggggacgaugugcucgcuaguuaccccuuuccaauugacugccug6960gagcuagcaaaaacagguaaggaguauggucuaaccaugaccccugcagacaaguccccu7020ugcuucaaugaaguuaauugggaaaacgcaaccuuccucaagagaggcuucuugccugau7080gagcaauucccguuuuugauccacccuaccaugccaaugaaggaaauucaugaauccauu7140cgguggaccaaggaugcacgcaauacucaagaucacgugcgaucccuaugucuauuggca7200uggcauaacgguaagcaagaauaugaaaaauuugugagcucaauuagauccgucccaaua7260ggaaaagcauuggcaauucccaacuaugaaaaccugagacguaauuggcucgaauuguuu7320uagaggucgaacaaaccucaaccccaccagaaaucuggucgcgaaaaugacugguggggg7380uaaauuuguuauaaccagaauagc740權利要求1、一種腸道病毒71型全基因組序列，其特征在于，所述序列具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2、權利要求1所述的序列及與所述序列同源性達50-95%的序列在制備用于預防腸道病毒71型疫苗和血清學ELISA診斷試劑中的用途。3、權利要求1所述的序列及與所述序列同源性達50-95%的序列在制備抗腸道病毒71型中和抗體中的用途。全文摘要一種腸道病毒71型全基因組序列，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，所述序列可用于制備預防腸道病毒71型疫苗和用于制備抗腸道病毒71型中和抗體。該序列為進一步獲得我國華南地區(qū)EV71型遺傳衍化特征提供了客觀依據，為進一步研制開發(fā)針對我國不同地區(qū)發(fā)病人群的血清學酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)診斷試劑和疫苗提供了可靠的數(shù)據資料，為深入研究EV71的遺傳變異規(guī)律及手足口病的致病機制提供了寶貴資源。文檔編號C07K16/08GK101509003SQ20091010617公開日2009年8月19日申請日期2009年3月23日優(yōu)先權日2009年3月23日發(fā)明者劉威龍,劉映霞,周伯平,張明霞,徐六妹,楊桂林,陳心春申請人:深圳市第三人民醫(yī)院