一種從基因組dna中獲得側(cè)翼序列的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的方法。該方法包括如下步驟：1）根據(jù)基因組DNA上的已知序列設(shè)計三條方向一致用于擴增側(cè)翼序列的特異性引物，按距離側(cè)翼序列由遠及近的順序?qū)⑵湟来斡洖镚SP1、GSP2和GSP3；2）以基因組DNA為模板，以引物SAP（序列1-15中任一）和所述GSP1進行第一輪PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物1；3）以所述PCR產(chǎn)物1為模板，以引物SEP（序列16和17）和所述GSP2進行第二輪PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物2；4）以所述PCR產(chǎn)物2為模板，以引物SNP（序列18）和所述GSP3進行第三輪PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物3，從而獲得所述側(cè)翼序列。本發(fā)明所提供方法具有如下優(yōu)點：操作簡易、高特異性擴增、高成功率、容易得到大的片段、耗時短等。
【專利說明】-種從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的方法，特別涉及一種通過 SNM-PCR從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 基因組時代的來臨對生物學各領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的影響。對于已完成基因組測序的 少數(shù)物種(如人、擬南芥、水稻等)，可直接從數(shù)據(jù)庫中找到已知序列的側(cè)翼序列。然而，自然 界中大多數(shù)生物基因組DNA序列仍未知，想要知道一個已知區(qū)域兩側(cè)的DNA序列，染色體步 移技術(shù)是一種非常有效的方法。因此，染色體步移技術(shù)（Genome Walking)是一種重要的現(xiàn) 代分子生物學研究技術(shù)，可以有效獲取與已知序列相鄰的未知序列。
[0003] 染色體步移技術(shù)主要有以下幾方面的應用：1.根據(jù)基因的已知片段、分子標記 等，獲取完整的基因序列，研究其表達調(diào)控。如分尚克隆啟動子和基因結(jié)構(gòu)并對其進行功能 研究；2.鑒定T-DNA、轉(zhuǎn)座子及外源基因在基因組中的插入位點；3.用于染色體測序工作中 的空隙填補，獲得完整的基因組序列。
[0004]目前，眾多基于PCR技術(shù)的染色體步移方法，包括反向PCR法，隨機PCR法和接頭 連接法等，都有操作復雜、非特異性擴增、連接效率低等弊端。
[0005] 迄今為止，利用隨機引物最成功的是熱不對稱交錯（thermalasymmetric interlacedPCR)TAIL-PCR。這種方法成本相對較低，可直接用PCR進行克隆，不需要DNA 限制性內(nèi)切酶消化或接頭連接反應。隨后，TAIL-PCR被廣泛應用，尤其是T-DNA插入位點側(cè) 翼序列的克隆，啟動子序列的快速分離和全長功能基因的克隆。然而，TAIL-PCR是一個十 分耗時的程序，通常要經(jīng)過三輪PCR擴增。由于較短的隨機兼并引物和低的退火溫度，往往 會出現(xiàn)非特異性擴增，也可能會出現(xiàn)目的序列的無效擴增。另外，傳統(tǒng)的TAIL-PCR往往會 產(chǎn)生小片段擴增。隨后，TAIL-PCR經(jīng)改進為（hi)TAIL-PCR和FPNI-PCR。但改進的高效率 TAIL-PCR仍然費時費力，并且引物設(shè)計與合成的費用昂貴。同時hiTAIL-PCR和FPNI-PCR 技術(shù)也遇到了巨大的挑戰(zhàn)，如：DNA聚合酶的活性問題和非特異性擴增等，所以往往伴隨著 低效率的擴增結(jié)果。綜上所述，這些改進的方法仍然費時費力，不能發(fā)揮傳統(tǒng)TAIL-PCR廣 泛的應用潛力。因此，進一步開發(fā)快速、高效的染色體步移或側(cè)翼序列的克隆的新方法是非 常必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的方法，命名為Suppression and nested mediated PCR (SNM-PCR)，具體可包括如下步驟：
[0008] (1)選擇基因組DNA上位于待擴增的側(cè)翼序列旁側(cè)的一個已知序列區(qū)，根據(jù)所述 已知序列區(qū)的核苷酸序列設(shè)計三條方向一致用于擴增所述側(cè)翼序列的特異性引物，將三條 所述特異性引物按照距離所述側(cè)翼序列由遠及近的順序，依次記為GSPUGSP2和GSP3 ;
[0009] (2)以所述基因組DNA為模板，以隨機兼并引物SAP和所述GSP1進行第一輪PCR 擴增，得到PCR產(chǎn)物1 ;
[0010] 所述隨機兼并引物SAP為如下15種引物中的任一種：核苷酸序列如序列表中序列 1所示的引物SAP 1、核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中 序列3所示的引物SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序 列表中序列5所示的引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸序 列如序列表中序列7所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物SAP8、核 苷酸序列如序列表中序列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列10所示的引物 SAP 10、核苷酸序列如序列表中序列11所示的引物SAP 11、核苷酸序列如序列表中序列12所 示的引物SAP12、核苷酸序列如序列表中序列13所示的引物SAP13、核苷酸序列如序列表中 序列14所示的引物SAP14、核苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15 ;
[0011] (3)以所述PCR產(chǎn)物1為模板，以疊套引物SEP和所述GSP2進行第二輪PCR擴增， 得到PCR產(chǎn)物2 ;
[0012] 所述疊套引物SEP由引物A和引物B組成，所述引物A的核苷酸序列為序列表中 序列16,所述引物B的核苷酸序列為序列表中序列17 ;
[0013] (4)以所述PCR產(chǎn)物2為模板，以引物SNP和所述GSP3進行第三輪PCR擴增，得到 PCR產(chǎn)物3 ;從所述PCR產(chǎn)物3中獲得所述側(cè)翼序列；
[0014] 所述引物SNP的核苷酸序列為序列表中序列18。
[0015] 在上述方法中，所述疊套引物SEP中，所述引物A和所述引物B的摩爾比可為 (1-2. 5) :10。
[0016] 在上述方法中，進行三輪PCR擴增時各引物配比如下：
[0017] (al)進行所述第一輪PCR擴增時，所述隨機兼并引物SAP和所述GSP1的摩爾比為 (5 ?10) :1，如 5 :1 ;
[0018] (a2)進行所述第二輪PCR擴增時，所述疊套引物SEP中的所述引物A、所述引物B， 以及所述GSP2三者的摩爾比為（1-2. 5) :10 :10 ;
[0019] (a3)進行所述第三輪PCR擴增時，所述引物SNP和所述GSP3的摩爾比為1 :1。
[0020] 在上述方法中，進行三輪PCR擴增的反應條件如下：
[0021] (bl)進行所述第一輪PCR擴增的反應條件為：94°C 120s，l個循環(huán)；98°C 10s， 60°C 30s，68°C 2min，2 個循環(huán)；98°C 10s，25°C 2min，0. 2°C /s(在 25°C -68°C升溫過程中，控 制每秒上升〇? 2°C)，68°C 2min，1 個循環(huán)；98°C 10s，60°C 30s，68°C 2min，98°C 10s，60°C 30s， 68°C 2min，98°C 10s，44°C 30s，68°C 2min，3-5 個循環(huán)；68°C 5min，1 個循環(huán)；或 / 和
[0022] (b2)進行所述第二輪PCR擴增的反應條件為：94°C 120s ;98°C 10s，60°C 30s， 68°C 2min，30 個循環(huán)；68°C 5min ;或 / 和
[0023] (b3)進行所述第三輪PCR擴增的反應條件為：94°C 120s ;94°C 10s，60°C 30s， 68°C 2min，30 個循環(huán)；68°C 5min。
[0024] 在上述方法中，進行三輪PCR擴增時的反應體系如下：
[0025] (cl)進行所述第一輪PCR擴增的反應體系為：2XPCR Buffer for K0D FX10. 0 ii L ;2mM dNTPs4. 0 ii L ;濃度為 10 ii mol 的所述 GSP10. 6 ii L ;濃度為 10 ii mol 的所述 隨機兼并引物 SAP3. Oil L ;所述基因組 DNA (模板)200-500ng ;K0D FX (1. 0U/iil)0. L ; ddH20 補足至 20ii L。
[0026] (C2)進行所述第二輪PCR擴增的反應體系為：2XPCR Buffer for KOD FX25. 0 ii L ;2mM dNTPslO. 0 ii L ;濃度為 10 ii mol 的所述 GSP21. 5 ii L ;混合濃度為 2. 2-2. 5 y mol的所述疊套引物SEP (其中，引物A的濃度為0? 2-0. 5 y mol，引物B的濃度為 2 ii mol) 7. 5 ii L ;所述 PCR 產(chǎn)物 1，即第一輪 PCR 反應液(模板）1. 0 ii L ;K0D FX (1. 0U/ ii L) 1. Oil L ;ddH20 補足至 50ii L ;
[0027] (c3)進行所述第三輪PCR擴增的反應體系為：2XPCR Buffer for KOD FX25. 0 ii L ;2mM dNTPslO. 0 ii L ;濃度為 10 ii mol 的所述 GSP31. 5 ii L ;濃度為 10 ii mol 的所 述引物3即1.51^;所述？0?產(chǎn)物2，即第二輪？0?反應液(模板）1.〇1^;1(00?乂（1.(^/ ii L) 1. 0 ii L ;ddH20 補足至 50 ii L。
[0028] 以上進行三輪PCR擴增時的反應體系中，所述2XPCR Buffer for KOD FX、所述 KOD FX均為東洋紡生物科技有限公司（Code No.KFX-101)。
[0029] 在上述方法中，所述GSP1、所述GSP2和所述GSP3的長度為22-26nt，GC含量 45-55%，Tm 值 60-70 °C。
[0030] 在上述方法中，所述GSP1、所述GSP2和所述GSP3在所述基因組DNA上，相鄰兩個 引物之間的間隔距離為30-100bp。
[0031] 在上述方法中，所述GSP3在所述基因組DNA上，與所述待擴增的側(cè)翼序列之間的 間隔為40-100bp以上。
[0032] 在上述方法的步驟（4)中，從所述PCR產(chǎn)物3中獲得所述側(cè)翼序列，具體為：以所 述GSP3對所述PCR產(chǎn)物3進行測序，從而獲得所述側(cè)翼序列的核苷酸序列。
[0033] 在本發(fā)明中，所述基因組DNA具體為日本落葉松基因組DNA。
[0034] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述已知序列區(qū)具體為LaTCTP的5'端基因組序列 (序列19)。此時，所述GSP1、所述GSP2和所述GSP3的核苷酸序列分別為序列20、序列21 和序列22。最終通過本發(fā)明方法所獲得的所述側(cè)翼序列的核苷酸序列為序列表中的序列 23或序列24。
[0035] 在本發(fā)明的另一個實施例中，所述已知序列區(qū)具體為LaNFYAl基因的5'端基因 組序列(序列26)。此時，所述GSP1、所述GSP2和所述GSP3的核苷酸序列分別為序列27、序 列28和序列29。最終通過本發(fā)明方法所獲得的所述側(cè)翼序列的核苷酸序列為序列表中的 序列30。
[0036] 本發(fā)明的再一個目的是通過一種用于從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的試劑盒。
[0037] 本發(fā)明所提供的用于從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的試劑盒，具體包含15條隨機 兼并引物中的全部或部分、疊套引物SEP和引物SNP ;
[0038] 所述15條隨機兼并引物如下：核苷酸序列如序列表中序列1所示的引物SAP1、 核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中序列3所示的引物 SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序列表中序列5所示的 引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸序列如序列表中序列7 所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物SAP8、核苷酸序列如序列表中 序列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列10所示的引物SAP10、核苷酸序列如 序列表中序列11所示的引物SAP11、核苷酸序列如序列表中序列12所示的引物SAP12、核 苷酸序列如序列表中序列13所示的引物SAP 13、核苷酸序列如序列表中序列14所示的引物 SAP14、核苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15 ;
[0039] 所述疊套引物SEP由引物A和引物B組成，所述引物A的核苷酸序列為序列表中 序列16,所述引物B的核苷酸序列為序列表中序列17 ;
[0040] 所述引物SNP的核苷酸序列為序列表中序列18。
[0041] 本發(fā)明所提供的從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的SNM-PCR法，具有如下優(yōu)點：
[0042] 1、操作簡易：經(jīng)過巧妙的引物設(shè)計，免去了酶切、接頭連接等繁瑣的實驗步驟；模 板無需經(jīng)過任何特殊處理，可直接用于SNM-PCR擴增，減少受污染的幾率；第一輪和第二輪 PCR產(chǎn)物無需稀釋(大大簡化操作步驟)，可直接進行下一步操作。
[0043] 2、高特異性擴增；利用阻抑PCR原理，在第二輪PCR過程中引入并延伸接頭序列， 使非特異性擴增產(chǎn)物形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)而起抑制效應，極大提高了擴增結(jié)果的特異性。
[0044] 3、高成功率：所【具體實施方式】部分的實驗中，成功的克隆了 2個基因的啟動子序 列，說明對于每一個基因都能夠被有效的步查。一般從中選取四條SAP引物進行SNM-PCR 擴增，就可以得到陽性結(jié)果。
[0045] 4、容易得到大的片段：從的實驗結(jié)果中，可以看出：每次實驗均可獲得lOOObp以 上的步移片段。
[0046] 5、耗時短：傳統(tǒng)TAIL-PCR需要12_16h才能完成PCR擴增過程，而經(jīng)過我們改進后 的SNM-PCR僅需要8個小時就可以完成從PCR擴增到轉(zhuǎn)化克隆的全過程，大大節(jié)省了科研 工作者的時間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047] 圖1為SNM-PCR技術(shù)原理及流程圖。
[0048] 圖2為SNM-PCR特異性引物設(shè)計示意圖。
[0049] 圖3為利用SNM-PCR克隆LaTCTP基因5'側(cè)翼序列的電泳圖和利用傳統(tǒng)TAIL-PCR 克隆LaTCTP基因5'側(cè)翼序列的電泳圖。其中，A-1至A-3為SNM-PCR方法，B為TAIL-PCR 方法。A-1中，泳道1-3依次為SAP1組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道4-6依次為SAP2組第一 至三輪PCR產(chǎn)物；泳道7-9依次為SAP3組第一至三輪PCR產(chǎn)物。A-2中，泳道1-3依次為 SAP4組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道4-6依次為SAP5組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道7-9依 次為SAP6組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道10-11依次為SAP7組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道 12-15依次為SAP8組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道16-18依次為SAP9組第一至三輪PCR產(chǎn) 物。A-3中，泳道1-3依次為SAP10組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道4-6依次為SAP11組第一 至三輪PCR產(chǎn)物；泳道7-9依次為SAP12組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道10-11依次為SAP13 組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道12-15依次為SAP14組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道16-18依 次為SAP15組第一至三輪PCR產(chǎn)物。B中，泳道1-3依次為第一至三輪PCR產(chǎn)物(箭頭所示 位置為目的條帶)。各圖中的泳道M均為DNA分子量標準，各條帶由小到大依次為250bp， 500bp,750bp,lOOObp,1500bp,2250bp,3000bp,4500bp。
[0050] 圖4為利用SNM-PCR克隆LaNFYAl基因5'側(cè)翼序列的電泳圖。其中，泳道1-3 依次為SAP1組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道4-6依次為SAP2組第一至三輪PCR產(chǎn)物；泳道M 為DNA分子量標準，各條帶由小到大依次為250bp，500bp，750bp，lOOObp，1500bp，2250bp， 3000bp，4500bp〇【具體實施方式】
[0051] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0052] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0053] 2XPCR Buffer for KOD FX、KOD FX :東洋紡生物科技有限公司（Code No.KFX-101)。
[0054] 實施例1、用于從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的試劑盒的制備及其使用方法
[0055] -、用于從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的試劑盒的制備
[0056] 本發(fā)明所提供的用于從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的試劑盒，包含15條隨機兼并 弓丨物SAP、疊套引物SEP和引物SNP。
[0057] 根據(jù)TAIL-PCR、阻抑PCR和巢式PCR原理，設(shè)計了一批帶有接頭序列的隨機兼并 引物（SAP1-15)用于第一輪PCR反應(如表1);根據(jù)阻抑PCR原理，采用混合的疊套引物 (SEP)，以延長接頭序列，最大程度抑制非特異性擴增；根據(jù)巢式擴增的原理，設(shè)計了引物 SNP用于第三輪PCR反應。具體原理及流程見圖1。
[0058] 表1SNM-PCR中用到的隨機兼并引物SAP、疊套引物SEP和引物SNP
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的方法，包括如下步驟： (1)選擇基因組DNA上位于待擴增的側(cè)翼序列旁側(cè)的一個已知序列區(qū)，根據(jù)所述已知 序列區(qū)的核苷酸序列設(shè)計三條方向一致用于擴增所述側(cè)翼序列的特異性引物，將三條所述 特異性引物按照距離所述側(cè)翼序列由遠及近的順序，依次記為GSPUGSP2和GSP3 ; (2 )以所述基因組DNA為模板，以隨機兼并引物SAP和所述GSP1進行第一輪PCR擴增， 得到PCR產(chǎn)物1 ; 所述隨機兼并引物SAP為如下15種引物中的任一種：核苷酸序列如序列表中序列1 所示的引物SAP1、核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中 序列3所示的引物SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序 列表中序列5所示的引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸序 列如序列表中序列7所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物SAP8、核 苷酸序列如序列表中序列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列10所示的引物 SAP 10、核苷酸序列如序列表中序列11所示的引物SAP 11、核苷酸序列如序列表中序列12所 示的引物SAP 12、核苷酸序列如序列表中序列13所示的引物SAP 13、核苷酸序列如序列表中 序列14所示的引物SAP14、核苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15 ; (3) 以所述PCR產(chǎn)物1為模板，以疊套引物SEP和所述GSP2進行第二輪PCR擴增，得到 PCR產(chǎn)物2 ; 所述疊套引物SEP由引物A和引物B組成，所述引物A的核苷酸序列為序列表中序列 16,所述引物B的核苷酸序列為序列表中序列17 ; (4) 以所述PCR產(chǎn)物2為模板，以引物SNP和所述GSP3進行第三輪PCR擴增，得到PCR 產(chǎn)物3 ;從所述PCR產(chǎn)物3中獲得所述側(cè)翼序列； 所述引物SNP的核苷酸序列為序列表中序列18。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述疊套引物SEP中，所述引物A和所述 引物B的摩爾比為（1-2. 5) :10。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：進行所述第一輪PCR擴增時，所述隨 機兼并引物SAP和所述GSP1的摩爾比為5 :1 ;或/和 進行所述第二輪PCR擴增時，所述疊套引物SEP中的所述引物A、所述引物B，以及所述 GSP2三者的摩爾比為（1-2. 5) :10 :10 ;或/和 進行所述第三輪PCR擴增時，所述引物SNP和所述GSP3的摩爾比為1 :1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：進行所述第一輪PCR擴增的 反應條件為：94°C 120s，l 個循環(huán)；98°C 10s，60°C 30s，68°C 2min，2 個循環(huán)；98°C 10s， 25 °C 2min，0.2 °C /s，68 °C 2min，l 個循環(huán)；98 °C 10s，60 °C 30s，68 °C 2min，98 °C 10s， 60°C 30s，68°C 2min，98°C 10s，44°C 30s，68°C 2min，3-5 個循環(huán)；68°C 5min，l 個循環(huán)；或 / 和進行所述第二輪PCR擴增的反應條件為：94°C 120s ;98°C 10s，60°C 30s，68°C 2min，30個 循環(huán)；68°C 5min ;或/和 進行所述第三輪PCR擴增的反應條件為：94°C 120s ;94°C 10s，60°C 30s，68°C 2min，30 個循環(huán)；68°C 5min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述GSP1、所述GSP2和所述 GSP3 的長度為 22-26nt，GC 含量 45-55%，Tm 值 60-70°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述GSP1、所述GSP2和所述 GSP3在所述基因組DNA上，相鄰兩個引物之間的間隔距離為30-100bp。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步驟（4)中，從所述PCR產(chǎn)物3 中獲得所述側(cè)翼序列，為：以所述GSP3對所述PCR產(chǎn)物3進行測序，從而獲得所述側(cè)翼序列 的核苷酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述基因組DNA為落葉松基因組DNA。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：所述已知序列區(qū)為LaTCTP基因序列或 LaNFYAl基因序列。
10. -種用于從基因組DNA中獲得側(cè)翼序列的試劑盒，包含15條隨機兼并引物中的全 部或部分、疊套引物SEP和引物SNP ; 所述15條隨機兼并引物如下：核苷酸序列如序列表中序列1所示的引物SAP1、核苷酸 序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中序列3所示的引物SAP3、 核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序列表中序列5所示的引 物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸序列如序列表中序列7所 示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物SAP8、核苷酸序列如序列表中序 列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列10所示的引物SAP10、核苷酸序列如序 列表中序列11所示的引物SAP11、核苷酸序列如序列表中序列12所示的引物SAP12、核苷 酸序列如序列表中序列13所示的引物SAP13、核苷酸序列如序列表中序列14所示的引物 SAP14、核苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15 ; 所述疊套引物SEP由引物A和引物B組成，所述引物A的核苷酸序列為序列表中序列 16,所述引物B的核苷酸序列為序列表中序列17 ; 所述引物SNP的核苷酸序列為序列表中序列18。
【文檔編號】C12N15/10GK104450675SQ201310452575
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】張立峰, 韓素英, 齊力旺, 李水根, 張俊紅 申請人:中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所