專利名稱：一種藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是一種藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)藻生長(zhǎng)只需光照、空氣和無(wú)機(jī)鹽，自身不含毒蛋白，一旦外源目的基因能在藍(lán)藻受體細(xì)胞中正常表達(dá)，在光照下就可生產(chǎn)目的基因的產(chǎn)物。藍(lán)藻可作為外源基因的表達(dá)宿主，與常用的表達(dá)宿主如大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主相比，藍(lán)藻具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、培養(yǎng)成本低、不形成包含體、不含內(nèi)毒素、本身含有對(duì)人類有益的營(yíng)養(yǎng)成分等優(yōu)點(diǎn)。因此，藍(lán)藻在食品、環(huán)境、健康和能源方面的作用越來(lái)越受到人們的重視，具有很大的開(kāi)發(fā)前
旦
ο藍(lán)藻基因工程主要研究來(lái)源于藍(lán)藻目的基因的克隆、向藍(lán)藻中轉(zhuǎn)移外源基因、所需載體平臺(tái)的構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)移方法和檢測(cè)方法的建立等，其中，載體的構(gòu)建是藻類基因工程的關(guān)鍵所在，是影響外源基因表達(dá)穩(wěn)定性和表達(dá)效果的重要因素，常用的載體主要有兩類， 表達(dá)載體和整合型表達(dá)載體。表達(dá)載體的構(gòu)建及完善大大推動(dòng)了藍(lán)藻基因工程的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。目前表達(dá)載體在藍(lán)藻細(xì)胞中的表達(dá)中不是很穩(wěn)定，容易丟失。構(gòu)建整合型表達(dá)載體可定位整合到受體細(xì)胞染色體DNA的同源重組位點(diǎn)上，穩(wěn)定地隨染色體DNA的復(fù)制而遺傳，并在染色體上原有的調(diào)控元件或外源基因表達(dá)單元自帶的調(diào)控元件作用下表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，本發(fā)明所述藍(lán)藻整合型表達(dá)載體是一種環(huán)狀載體，包含整合片段、篩選標(biāo)記基因和外源基因表達(dá)元件等組成部分。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下一種藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體，包含整合片段F1、藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbA1、篩選標(biāo)記基因nptll和整合片段F2，所述載體序列上游至下游的方向依次為整合片段F1、藍(lán)藻啟動(dòng)子 PpsbA1、篩選標(biāo)記基因nptll和整合片段F2，具體序列見(jiàn)序列5。而且，所述外源片段插入位點(diǎn)為Ndel/Clal位于649_667bp之間，具體為 “ CATATGGGGATCCATCGAT”。而且，所述藍(lán)藻載體序列部分來(lái)自于克隆載體pBluescript II SK(+)。而且，所述同源重組整合片段為Fl和F2，來(lái)自于魚(yú)腥藻7120 Anabaena sp. PCC 7120基因組DNA序列第46M703-4655672位點(diǎn)，是ORFs alr3857和alr3858之間的非編碼區(qū)。而且，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)閹в袑Ｓ脝?dòng)子的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Neomycin Phosphotransferase II基因nptll，該酶表現(xiàn)卡那霉素抗性。而且，所述藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbA1來(lái)自魚(yú)腥藻7120光系統(tǒng)II的Dl蛋白質(zhì)強(qiáng)啟動(dòng)子序列。
一種藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)以魚(yú)腥藻7120的基因組DNA為模板，用Fl弓丨物1和2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到整合片段Fl片段；(2)以魚(yú)腥藻7120的基因組DNA為模板，用F2弓丨物3和4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到整合片段F2片段；(3)以魚(yú)腥藻7120的基因組DNA為模板，用PpsbA1弓丨物5和6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到
藍(lán)藻啟動(dòng)子Ppsmi片段；(4)以pET30載體為模板，用nptll基因引物7和8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到篩選標(biāo)記基因nptll片段；(5)載體pPpsbA1_F2的構(gòu)建依次將整合片段F2、藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbA1導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，獲得的克隆重組質(zhì)粒PTF2和pTPpsbA1，用^(bal+BamHI雙酶切，純化回收后進(jìn)行連接，將F2插入到自連的pTPpsbA1載體中獲得pPpsbA1_F2載體；(6)載體pFl-PpsbA1_F2的構(gòu)建將Fl導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，獲得的克隆重組質(zhì)粒PTF1，用Xbal+PstI雙酶切質(zhì)粒pPpsbA1_F2和PTFl后，將pPpsbA1_F2連接到載體PTFl上， 獲得 pFl-PpsbA1-F2 載體。(7)載體pAnFP的構(gòu)建將nptll導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，獲得的克隆重組質(zhì)粒 pTnptll，用BamHI分別酶切質(zhì)粒pFl-PpsbA1_F2和pTnptll，純化回收后進(jìn)行連接，將nptll 插入到pFl-PpsbA1-F2載體中獲得pFl-PpsbA1-nptII-F2載體即pAnFP載體。一種含有藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體的全序列，其特征在于序列見(jiàn)序列16。本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下1、本發(fā)明中pAnFP整合型表達(dá)穿梭載體能夠直接與藍(lán)藻染色體DNA同源位點(diǎn)重組，將外源基因定位整合到染色體DNA上，可在藍(lán)藻細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，避免質(zhì)粒復(fù)制丟失的問(wèn)題。2、本發(fā)明的整個(gè)基因重組和表達(dá)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，重組效率高，能夠快速高效地構(gòu)建藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)，具有很好的應(yīng)用前景，可為產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻開(kāi)辟一條新途徑。3、本發(fā)明的藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體pAnFP，可運(yùn)用三親接合轉(zhuǎn)移方法和基因整合平臺(tái)系統(tǒng)進(jìn)行外源基因表達(dá)。


圖1為本發(fā)明提供的整合型表達(dá)載體pAnFP的表達(dá)元件盒示意圖，包括同源重組序列Fl和F2，藍(lán)藻特異啟動(dòng)子Ppsmi序列，篩選標(biāo)記基因nptll，以及外源基因插入位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶種類；圖2為本發(fā)明提供的整合型表達(dá)載體pAnFP的構(gòu)建方法流程示意圖；圖3-A到圖3-E為本發(fā)明提供的整合型表達(dá)載體pAnFP構(gòu)建方法及應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施例的鑒定結(jié)果，其中圖3-A、圖3-B為載體pTPpsbA1-F2的鑒定結(jié)果；圖3_C為載體 PTF1-PPSM1-F2的鑒定結(jié)果；圖3-D為載體pAnFP的鑒定結(jié)果；圖3-E為載體pAnFP-gfp的
鑒定結(jié)果；
圖4為本發(fā)明提供的整合型表達(dá)載體pAnFP構(gòu)建方法及應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施例的表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體，命名為pAnFP，包含整合片段F1、藍(lán)藻啟動(dòng)子 PpsbA1、外源基因插入位點(diǎn)和篩選標(biāo)記基因nptll、整合片段F2 ；所述載體序列上游至下游的方向依次為整合片段F1、藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbA1、外源基因插入位點(diǎn)(下劃線)、篩選標(biāo)記基因 nptll和整合片段F2，序列見(jiàn)序列表，起順序均為5’ -3，。外源片段插入位點(diǎn)為Ndel/Clal 位于649-667bp之間，見(jiàn)劃線處，具體為“CATATGGGGATCCATCGAT”,外源基因插入位點(diǎn)為內(nèi)切酶Ndel/Clal的位置。其中，所述藍(lán)藻載體序列部分來(lái)自于克隆載體pBluescript II SK(+)；所述同源重組整合片段為Fl和F2，來(lái)自于魚(yú)腥藻7120 (Anabaena sp. PCC 7120)基因組DNA序列第 4654703-4655672位點(diǎn)，是ORFs alr3857和alr3858之間的非編碼區(qū)；所述篩選標(biāo)記基因?yàn)閹в袑Ｓ脝?dòng)子的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neomycin Phosphotransferase II)基因nptll， 該酶表現(xiàn)卡那霉素抗性；所述藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbA1來(lái)自魚(yú)腥藻7120光系統(tǒng)II的Dl蛋白質(zhì)強(qiáng)啟動(dòng)子序列。一種藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟參考表1、圖1和圖2，(1)以魚(yú)腥藻7120的基因組DNA為模板，用Fl弓丨物1和2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到整合片段Fl片段；(2)以魚(yú)腥藻7120的基因組DNA為模板，用F2弓丨物3和4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到整合片段F2片段；(3)以魚(yú)腥藻7120的基因組DNA為模板，用PpsbA1弓丨物5和6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到
藍(lán)藻啟動(dòng)子Ppsmi片段；(4)以pET30載體為模板，用nptll基因引物7和8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到篩選標(biāo)記基因nptll片段；(5)載體pPpsbA1_F2的構(gòu)建依次將整合片段F2、藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbA1導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，獲得的克隆重組質(zhì)粒PTF2和pTPpsbA1，用^(bal+BamHI雙酶切，純化回收后進(jìn)行連接，將F2插入到自連的pTPpsbA1載體中獲得pPpsbA1_F2載體。(6)載體pFl-PpsbA1_F2的構(gòu)建將Fl導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，獲得的克隆重組質(zhì)粒PTF1，用Xbal+PstI雙酶切質(zhì)粒pPpsbA1_F2和PTFl后，將pPpsbA1_F2連接到載體PTFl上， 獲得 pFl-PpsbA1-F2 載體；(7)載體pAnFP的構(gòu)建將nptll導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，獲得的克隆重組質(zhì)粒 pTnptll，用BamHI分別酶切質(zhì)粒pFl-PpsbA1_F2和pTnptll，純化回收后進(jìn)行連接，將nptll 插入到pFl-PpsbA1-F2載體中獲得pFl-PpsbA1-nptII-F2載體即pAnFP載體；(8)上述各載體的酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。用BamHI+Xbal雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到F2片段和載體pBS-T(見(jiàn)圖3-A)；用^(bal+Pstl雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到 PpsbAl+F2 片段和載體 pBS-T(見(jiàn)圖 3-B)；分別用 EcoRI+PstI、BamHI+Xbal 和 Pstl+BamHI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，泳道1、2和3分別為Fl、F2、PpsbA1片段和載體pBS-T (見(jiàn)圖 3-C)；分別用Xbal+PstLBamHI+XbaUstl+BamHI和BamHI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 泳道1、2、3和4分別為Fl、F2、PpsbA1、nptII片段和載體pBS-Τ (見(jiàn)圖3-D)；用Ndel+Clal雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到gfp片段和載體PAnFP (見(jiàn)圖3-E)。應(yīng)用實(shí)施例本實(shí)施例提供的整合型表達(dá)載體pAnFP在魚(yú)腥藻7120中表達(dá)綠色熒光蛋白GFP 的具體步驟如下(1)以含有g(shù)fp基因的pART27為模板，用引物9和10進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段 gfp ；(2)載體pAnFP-gfp的構(gòu)建通過(guò)Ndel+Clal雙酶切載體pAnFP，將gfp片段插入載體pAnFP中(見(jiàn)圖幻，用Ndel+Clal雙酶切鑒定載體pAnFP-gfp，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)gfp的正確連接(見(jiàn)圖3E)；(3)載體pAnFP-gfp用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，用三親接合轉(zhuǎn)化魚(yú)腥藻 7120。每管感受態(tài)細(xì)胞中加入5ul連接液，輕彈混勻，冰浴30min，42°C熱休克90sec，冰浴 3min使體系冷卻，加入溫浴至37°C的LB培養(yǎng)液，150rpm振蕩45min。取適量菌液鋪于含相應(yīng)抗生素的LB平板上，待平板表面干燥后，倒置培養(yǎng)過(guò)夜。 魚(yú)腥藻7120培養(yǎng)在BG-Il負(fù)氮培養(yǎng)基中，溫度27°C，pH 7. 2，液體培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速為130r/ min0經(jīng)過(guò)三親接合轉(zhuǎn)化，在含有卡那霉素的培養(yǎng)液中篩選具有抗性的轉(zhuǎn)基因魚(yú)腥藻7120 ；上述連接液購(gòu)自Takara生物公司的商品化試劑2XT4 DNA Rapid Ligation Buffer，用量一般為5ul (以IOul反應(yīng)體系為例)。三親接合轉(zhuǎn)化方法具體如下(1)大腸桿菌的準(zhǔn)備在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中接種含有穿梭表達(dá)載體的大腸桿菌及含有接合質(zhì)粒RP4和輔助質(zhì)粒pRL623的大腸桿菌，搖菌過(guò)夜。離心收菌，用普通LB培養(yǎng)液洗，用適量LB培養(yǎng)液重懸。等體積混合兩種菌液；(2)藍(lán)藻的準(zhǔn)備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期(OD665 = 0 . 4)藍(lán)藻培養(yǎng)物，離心收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌，再以適當(dāng)體積的培養(yǎng)液懸浮藻細(xì)胞；(3)接合轉(zhuǎn)化將藻細(xì)胞與細(xì)菌以適當(dāng)?shù)谋壤旌暇鶆?，輕輕地將其涂于無(wú)抗生素的含濾膜的LB固體培養(yǎng)基上，盡量使濾膜上的混合液均勻，正置平板使液體完全滲入培養(yǎng)基中，倒置光照培養(yǎng)使藍(lán)藻表達(dá)抗性，小心地轉(zhuǎn)移濾膜到含有相應(yīng)抗生素的平板上，繼續(xù)照光培養(yǎng)直至出現(xiàn)陽(yáng)性克隆。(4)熒光顯微鏡檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)。熒光顯微鏡結(jié)果如圖4所示，在488nm 光激發(fā)作用下，綠色熒光蛋白發(fā)出綠色熒光。轉(zhuǎn)gfp基因魚(yú)腥藻7120出現(xiàn)綠色熒光，表明有綠色熒光蛋白表達(dá)，而且表達(dá)的蛋白具有生物活性。表1是本發(fā)明提供的整合型表達(dá)載體pAnFP構(gòu)建涉及的基因特異性引物。包括Fl 的引物1、2 ；F2的引物3、4 ；Ppsmi的引物5、6 ；基因nptll的引物7、8 ；基因gfp的引物9、 10。表達(dá)元件序列可以將外源基因整合至染色體上。具體應(yīng)用時(shí)，需要將它與“其他序列”組成融合載體進(jìn)行功能的體現(xiàn)，如本例就是將這個(gè)表達(dá)元件序列與pBluescript II SK(+)載體組合來(lái)表達(dá)外源基因。
上述的“其他序列”就是商品化克隆或表達(dá)載體，這些載體只有在多克隆位點(diǎn)插入外源片段-包括基因或表達(dá)元件序列才能表現(xiàn)出載體功能，如果沒(méi)有外源片段插入，就是空載體，不會(huì)表達(dá)任何功能。本例的表達(dá)元件序列插入pBluescript II SK(+)載體形成一個(gè)新功能的整合表達(dá)載體，PBluescript II SK(+)載體使用非常廣泛，許多新載體都是以它為出發(fā)載體構(gòu)建新的功能載體。表達(dá)元件序列與“其他序列”的連接通過(guò)EcoRI和^(bal，它們分別位于表達(dá)元件的兩端，即Fl的5，-端EcoRI位點(diǎn)和F2的3，-端)(baI位點(diǎn)。表1中已經(jīng)列出。表 1
基因引物序列酶切位點(diǎn)產(chǎn)物(bp)Fl引物1 5'CCGGAATTCACGCCATAATCATGTGTC 3'EcoRI479引物2 5'TGCACTGCAGTGGGGATAATTACAACTC 3'PstIF2引物3 5'CGCGGATCCCCCCAATTTTGAAACCTATC 3' 引物4 5 'CTAGTCTAGAGGCTCACCATAGGTGAATGCAC 3 ‘BamHI XbaI431PpsbAl引物5 5 'GAGCTGCAGGGATTCCCAAAGATAGGG 3' 引物6 5 'CTCGGATCCCCATATGTTTTTATGATTGCTTTG 3 ‘ 引物7PstI BamHI/ NdeI BamHI/182nptll5 'CGGGATCCCATCGAT ACTCACGTTAAGGGAT3 ‘ 引物8 5 'CGGGATCC CAGGTGGCACTTTTCGGGGA3 ‘ClaI BamHI985Φ引物9 5'GGAATTCCATATG TTATTCAACA GCTGT3' 引物10 5 'CCATCGATGG ATGGCGAACAACGA3 ‘NdeI ClaI7171、整合型表達(dá)載體pAnFP的表達(dá)元件序列(2077bp)，外源片段插入位點(diǎn)為NdeI/ ClaI (位于649-667bp之間，見(jiàn)劃線處)5 ’ -TATTATTGTTTACTCTACGCTTTACATAGAAATTGTGAAAAGCTCTTTTCCAGACGCTTAGAACTT AGGGACAAAAATGATTTCTGGATACTTGCGCTCACCGTGTAGTACGTTTCCAGTGGCAATTGTTCAGTCTGTAGCAG ATATTCAAACTGATTGACTTTACGACTGAACAGCTTGATAGGCTTAGATAGTATTGCTATTAAGTTTCAGTTTGGTC ACAAAAAGTAACAAATTAATTAATCAGTCAGATTTTTATTCCTTTGTTATCTTTAAATTTTCGCATCAATAAATAAC ACAGATAGGAGTTGACTTTGATTTCTGTTGGCGCAGTGTGGCATAGCTATAGGTACTTGTGTATCTAGGGGATGGTC 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CATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATA GGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGA GTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTC ATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACA AATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGGCAGTGAAGACTTGCCATAACCTATATTTCTCGCAT GAAGTAATCTGCTGAGAACTATGAGTTGTGTAATATATTGTATTTTTATTAAGTGTAGGTTTAATTGCATAGAGTTA GCCGTTAGAACTAATTATCCCAGAATAGATACCTCAAATTCTCAGTAGCAGAAATTAAATAGATAACAAAATATACA AAATGCCTTCAGTATTTAAAACTTCTTCTCAGAAGACAAACACAGTTAGTAACCAGATGAATAACTCATCAAAATCA TCAACAGAAGTATTAGCTGTGTCTCCTGCATCCCAAAGGTATACTATGCAAAAATTGCCATGTAGAGACAATATTAA TAAGTTGTGGAAGTTATACAGATCAATTTTAAGTAAATGTATGTATACTTCTCTAGAATTAGCTGTGCATTCACCTA TGGTGAGCC-3’2、整合型表達(dá)載體pAnFP全序列(5014bp)，劃線處為表達(dá)元件序列 (707bp-2783bp，共 2077bp)5 ’ -CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTT TAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAG TTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGC CCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGG GAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGG GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAG GGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCA GCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAA CGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGT ATCGATAAGCTTGATATCGAATTCTATTATTGTTTACTCTACGCTTTACATAGAAATTGTGAAAAGCTCTTTTCCAG ACGCTTAGAACTTAGGGACAAAAATGATTTCTGGATACTTGCGCTCACCGTGTAGTACGTTTCCAGTGGCAATTGTT CAGTCTGTAGCAGATATTCAAACTGATTGACTTTACGACTGAACAGCTTGATAGGCTTAGATAGTATTGCTATTAAG TTTCAGTTTGGTCACAAAAAGTAACAAATTAATTAATCAGTCAGATTTTTATTCCTTTGTTATCTTTAAATTTTCGC ATCAATAAATAACACAGATAGGAGTTGACTTTGATTTCTGTTGGCGCAGTGTGGCATAGCTATAGGTACTTGTGTAT CTAGGGGATGGTCACTCCTTCACCAACAAAATTTAAATGGGATGCCTTATGGAAGTCTAATTGTATGGTTAGAGTTG TAATTATCCCCAATTTTGAAACCTATCAACTATATTATTAACTTTAGAGTAATTTTAACATCTCGGTGTCAATTGTC ATGCGGATAACATTTATGTACTCAGCCGAAAAATTTTACTTACTTCGCTTGACAACTATATTATTATAAAGTTATATATGATTGTAAGACAAGTTACACCCTTGTCGGTTGATATTCAAAGCAATCATAAAAACATATGGGGATCCATCGATAC TCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCC ATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGG GCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCT GAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGC CTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACA GCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTT GCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGA 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TTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAA CATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGC TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGG TTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTAT CAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGC CAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCA CAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCT CCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCG CTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACC CCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGC CACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGG CCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGT TGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAA GGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAT CTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTC TATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCC AGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGC CGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATG GCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTC CTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATT CTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGT ATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCT CATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCA CTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAAT GCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCAT TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCA CATTTCCCCGAAAAGTGCCAC-3‘。
權(quán)利要求
1.一種藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體，其特征在于包含整合片段F1、藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbA1、篩選標(biāo)記基因nptll和整合片段F2，所述載體序列上游至下游的方向依次為整合片段F1、藍(lán)藻啟動(dòng)子Ppsmi、篩選標(biāo)記基因nptll和整合片段F2，具體序列見(jiàn)序列5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述外源片段插入位點(diǎn)為 Ndel/Clal 位于 649_667bp 之間，具體為 “CATATGGGGATCCATCGAT，，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述藍(lán)藻載體序列部分來(lái)自于克隆載體PBluescript II SK(+)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述同源重組整合片段為Fl和F2，來(lái)自于魚(yú)腥藻7120 Anabaena sp. PCC 7120基因組DNA序列第 4654703-4655672 位點(diǎn)，是 ORFs alr3857 和 alr3858 之間的非編碼區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述篩選標(biāo)記基因?yàn)閹в袑Ｓ脝?dòng)子的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Neomycin Phosphotransferase II基因nptll，該酶表現(xiàn)卡那霉素抗性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述藍(lán)藻啟動(dòng)子 PpsbAi來(lái)自魚(yú)腥藻7120光系統(tǒng)II的Dl蛋白質(zhì)強(qiáng)啟動(dòng)子序列。
7.—種如權(quán)利要求1所述的藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于步驟如下(1)以魚(yú)腥藻7120的基因組DNA為模板，用Fl弓丨物1和2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到整合片段Fl片段；(2)以魚(yú)腥藻7120的基因組DNA為模板，用F2弓丨物3和4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到整合片段F2片段；(3)以魚(yú)腥藻7120的基因組DNA為模板，用PpsbA1引物5和6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到藍(lán)藻啟動(dòng)子Ppsmi片段；(4)以pET30載體為模板，用nptll基因引物7和8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到篩選標(biāo)記基因 nptll片段；(5)載體pPpsbA1_F2的構(gòu)建依次將整合片段F2、藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbA1導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，獲得的克隆重組質(zhì)粒PTF2和pTPpsbA1，用^(bal+BamHI雙酶切，純化回收后進(jìn)行連接，將 F2插入到自連的pTPpsbA1載體中獲得pPpsbA1_F2載體；(6)載體pFl-PpsbA1-F2的構(gòu)建將Fl導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，獲得的克隆重組質(zhì)粒 PTF1，用Xbal+PstI雙酶切質(zhì)粒pPpsbA1_F2和PTFl后，將pPpsbA1_F2連接到載體PTFl上，獲得 pFl-PpsbA1-F2 載體。(7)載體pAnFP的構(gòu)建將nptll導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，獲得的克隆重組質(zhì)粒 pTnptll，用BamHI分別酶切質(zhì)粒pFl-PpsbA1_F2和pTnptll，純化回收后進(jìn)行連接，將nptll 插入到pFl-PpsbA1-F2載體中獲得pF l-PpsbA1-nptII-F2載體即pAnFP載體。
8.一種含有如權(quán)利要求1所述的藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體的全序列，其特征在于序列見(jiàn)序列16。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藍(lán)藻整合型穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，包含整合片段F1、藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbAl、篩選標(biāo)記基因nptII和整合片段F2，所述載體序列上游至下游的方向依次為整合片段F1、藍(lán)藻啟動(dòng)子PpsbAl、篩選標(biāo)記基因nptII和整合片段F2，具體序列見(jiàn)序列表。本發(fā)明中pAnFP整合型穿梭表達(dá)載體能夠直接與藍(lán)藻染色體DNA同源位點(diǎn)重組，將外源基因定位整合到染色體DNA上，可在藍(lán)藻細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，避免質(zhì)粒復(fù)制丟失的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102352374SQ201110319828
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者付靜娟, 宋東輝, 朱義平, 楊國(guó)蘭 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)