專利名稱：Hcv ns3蛋白酶復(fù)制子穿梭載體的制作方法
HCV NS3蛋白酶復(fù)制子穿梭載體本發(fā)明涉及新的HCV NS3蛋白酶復(fù)制子穿梭載體，其可用于篩選、測試和評價HCV 和其他黃病毒蛋白酶抑制劑。丙型肝炎病毒是全世界主要的健康問題，并且是慢性肝病的主要病因(Boyer， N.等人，J.H印atol.200032 :98-112)。HCV感染的患者有發(fā)展為肝硬化和隨后發(fā)展為肝細(xì) 胞癌的危險，因此HCV是肝移植的主要指征。根據(jù)世界衛(wèi)生組織，世界范圍存在超過2億感染個體，每年至少3百萬至4百萬人 感染。一旦被感染，約20%的人清除該病毒，但其余人可能余生攜帶HCV。10%至20%的慢 性感染個體最終發(fā)展為破壞肝臟的肝硬化癥或癌癥。這種病毒病以腸胃外方式由污染的血 液和血液制品傳播、由污染的針頭傳播、或者以性方式傳播或者從感染母親或攜帶母親垂 直地傳播至后代。針對HCV感染的現(xiàn)有療法具有有限的臨床益處，特別對于基因型1，其中 所述的現(xiàn)有療法限于用重組干擾素- α單獨或與核苷類似物利巴韋林聯(lián)合的免疫治療，迫 切需要有效戰(zhàn)勝慢性HCV感染的改進(jìn)的治療劑。HCV已經(jīng)劃歸作為黃病毒科(Flaviviridae)的成員，黃病毒科包括黃病毒屬 (f laviviruses)、癌病毒屬(pestiviruses)禾口月干炎病毒屬(hepaciviruses)，其中所 述肝炎病毒屬包括丙型肝炎病毒(Rice，C. M.，F(xiàn)laviviridae :The viruses and their r印lication，在《Fields Virology》中，F(xiàn)ields，B. N.，Knipe，D. Μ·和 Howley，P. Μ·編著， Lippincott-RavenPublishers, Philadelphia, Pa.，第 30 章，931-959，1996)。HCV 是含有 約9. 4kb正義單鏈RNA基因組的有包膜病毒。病毒基因組由一個5’非翻譯區(qū)(UTR)、編碼 大約3011個氨基酸的多聚蛋白前體的一個長可讀框(ORF)和一個短的3’ UTR0 5’ UTR是 HCV基因組中最高度保守的部分，并且對于多聚蛋白翻譯的啟動和調(diào)控重要。HCV的遺傳分析已經(jīng)確定在DNA序列呈現(xiàn)> 30%趨異性的6種主要基因型。每種 基因型含有一系列更密切相關(guān)的亞型，其中所述亞型在核苷酸序列上顯示20% 25%趨 異性(Simmonds，P.，2004，J. Gen. Virol.85 :3173-88)。已經(jīng)區(qū)分出多于 30 種亞型。在美 國，大約70%的感染個體患有Ia型和Ib型感染。Ib型是在亞洲的最流行亞型(X. Forns 禾口 J. Bukh, Clinics in Liver Disease 1999, 3 :693_716 ; J. Bukh 等人，Semin. Liv. Dis., 1995，15 41-63)。遺憾地，1型感染對現(xiàn)有療法應(yīng)答比2型或3型基因型更小(N. N. Zein, Clin. Microbiol. Rev.，2000，13 :223_235)。瘟病毒和肝炎病毒的ORF的非結(jié)構(gòu)蛋白部分的基因組織和多聚蛋白加工是非常 相似的。這些正鏈RNA病毒具有單一的大可讀框(ORF)，編碼病毒復(fù)制必需的全部病毒蛋 白。這些蛋白質(zhì)作為多聚蛋白表達(dá)，其中所述的多聚蛋白經(jīng)細(xì)胞蛋白酶和病毒編碼的蛋白 酶共翻譯和翻譯后地加工以產(chǎn)生成熟的病毒蛋白。負(fù)責(zé)病毒基因組RNA復(fù)制的病毒蛋白定 位于羧基端。ORF的三分之二稱為非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。對于瘟病毒和肝炎病毒而言，成熟的 非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白從非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的氨基端至該ORF羧基端的依次順序由p7、NS2、NS3、 NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B 組成。瘟病毒和肝炎病毒的NS蛋白共有以特定蛋白質(zhì)功能為特征的序列結(jié)構(gòu)域。例如， 這兩組病毒中的病毒NS3蛋白具有屬于絲氨酸蛋白酶特征的氨基酸序列基序和屬于解旋
6酶特征的氨基酸序列基序(Gorbalenya 等人，Nature 1988333 22 ；Bazan 和 Fletterick， Virology 1989，171 :637_639 ;Gorbalenya等人，Nucleic Acid Res. 1989，17，3889-3897)。 類似地，瘟病毒和肝炎病毒的NS5B蛋白具有屬于RNA指導(dǎo)RNA聚合酶特征的基序(Koonin， Ε. V.和 Dol ja，V. V.，Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 1993，28 :375_430)。瘟病毒和肝炎病毒的NS蛋白在病毒生活周期中的實際作用和功能是直接類似 的。在這兩種情況下，NS3絲氨酸蛋白酶負(fù)責(zé)ORF中其位置下游的多聚蛋白前體的所有蛋 白酶解加工(Wiskerchen 和 Collett, Virology, 1991，184 :341_350 ；Bartenschlager 等 人，J. Virol. 1993,67 3835-3844 ；Eckart 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993,192 399-406 ；Grakoui 等人，J. Virol. 1993,67 :2832_2843 ；Grakoui 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1993,90 10583-10587 ；Ilijikata 等人，J. Virol. 1993,67 4665-4675；Tome 等 人，J.Virol. 1993,67 =4017-4026) 在這兩種情況下，NS4A蛋白均作為輔因子與NS3絲 氨酸蛋白酶作用(Bartenschlager 等人，J. Virol. 1994,68 5045-5055 ；Failla 等人， J. Virol. 1994,68 :3753_3760 ；Xu 等人，J Virol. 1997,71 :5312_5322)。這兩組病毒的 NS3 蛋白均也發(fā)揮解旋酶的作用(Kim 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995，215 160-166 ； Jin 禾口 Peterson, Arch.Biochem. Biophys. 1995,323 :47_53 ；Warrener 禾口 Collett, J. Virol. 199569 :1720_1726)。最后，瘟病毒和肝炎病毒的NS5B蛋白均具有預(yù)測的RNA依 賴的 RNA 聚合酶活性(Behrens 等人，EMBO 1996，15 12-22 ；Lechmann 等人，J. Virol. 1997， 71 8416-8428 ；Yuan 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997，232 :231_235 ；Hagedorn, PCT WO 97/12033 ；Zhong 等人，J. Virol. 1998，72 :9365_9369)。HCV NS蛋白3(NS3)含有幫助加工大部分病毒酶的絲氨酸蛋白酶活性并因此視 為對病毒復(fù)制和感染是必需的。已知在黃熱病毒NS3蛋白酶中的突變降低病毒感染性 (Chambers 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990,87 :8898_8902)。已顯示 NS3 的頭 181 個 氨基酸(病毒多聚蛋白的第1027 1207位殘基)含有NS3的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu) 域加工HCV多聚蛋白的全部4個下游位點(Lin等人，J. Virol. 1994，68 :8147_8157)。HCV NS3絲氨酸蛋白酶及其相關(guān)的輔因子NS4A幫助加工全部的病毒酶，并因此視為對病毒復(fù)制 是必需的。這個加工過程似乎與人免疫缺陷病毒的天冬氨酰蛋白酶所實施的加工過程類 似，其中所述天冬氨酰蛋白酶也參與病毒酶加工HIV蛋白酶抑制劑，其中所述的HIV蛋白酶 抑制劑是人類中的強效抗病毒藥，從而表明破壞病毒生活周期的這個階段導(dǎo)致了治療活性 劑。因此，它是發(fā)現(xiàn)藥物的有吸引力的靶點。當(dāng)前存在有限數(shù)量的目前可用于治療HCV感染的已批準(zhǔn)療法。已經(jīng)綜述了治 療HCV和抑制HCV NS5B聚合酶的新治療方法和現(xiàn)有治療方法R.G.Gish，Sem. Liver. Dis. ,1999,19 5 ；Di Besceglie, Α. Μ.禾口 Bacon， B. R， Scientific American，1999 年 10月，80-85 ；G.Lake-Bakaar，“針對慢性HCV病毒肝病的現(xiàn)今和將來的療法(Current and FutureTherapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease)，，，Curr. DrugTarg. Infect Dis. 2003, 3 (3) :247_253 ；P. Hoffmann 等人，“關(guān)于丙型肝炎病毒實 驗性療法的最近專利(1999-2002 年)(Recent patents onexperimental therapy for hepatitis C virus infection)(1999-2002)Exp. Opin. Ther. Patents 2003,13(11) 1707-1723 ；F. F. Poordad 等人，"2000-2002 年期間丙型肝炎療法進(jìn)展(Developments in Hepatitis Ctherapy during 2000-2002)，，，Exp. Opin. Emerging Drugs 2003,8(1) 9-25 ；M. P. Walker等人，“用于慢性丙型肝炎治療的有前景候選物(Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C) ”，Exp. Opin. Investig. Drugs 2003，12(8) : 1269-1280 ；S. _L. Tan等人，“丙型肝炎治療藥現(xiàn)今狀況和新出現(xiàn)的策 略(Hepatitis C Therapeutics Current Status and Emerging Strategies)，，，Nature Rev. DrugDiscov. 2002,1 :867_881 ；R. De Francesco 等人，“走向丙型肝炎病毒療法的新 紀(jì)元NS3-4A絲氨酸蛋白酶抑制劑和NS5B RNA依賴的RNA聚合酶抑制劑(Approaching a new era for hepatitis C virus therapy inhibitors of the NS3—4A serine protease and the NS5B RNA-dependentRNA polymerase), Antiviral Res. 2003,58 1-16 ;Q.M. Wang等人，“丙型肝炎病毒編碼的蛋白質(zhì)抗病毒治療的靶Ofepatitis C virus encodedproteins targets for antiviral therapy)，，，Drugs of the Future 2000, 25 (9) =933-8-944 ;J. A. Wu和Ζ. Hong, “靶向NS5B依賴的RNA聚合酶用于抗HCV化學(xué)治療 (Targeting NS5B_Dependent RNA Polymerase forAnti-HCV Chemotherapy)，，，Cur. Drug Targ. -Inf. Dis. 20033 :207_219。盡管在理解該病毒的基因構(gòu)造和病毒蛋白的功能方面取得進(jìn)展，然而HCV復(fù)制和 病理發(fā)生的基礎(chǔ)方面仍是未知的。獲得實驗性理解HCV復(fù)制的主要挑戰(zhàn)是缺少允許產(chǎn)生感 染性病毒顆粒的有效細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。雖然已經(jīng)報道了原代細(xì)胞培養(yǎng)物和某些人細(xì)胞系的感 染，然而那些系統(tǒng)中所產(chǎn)生病毒的量和HCV復(fù)制的水平太低以致不允許詳細(xì)分析。已經(jīng)報道了以最小效率在人肝癌細(xì)胞系Huh-7中復(fù)制的可選擇性亞基因組HCV RNA的構(gòu)建。Lohman等人報道通過缺失蛋白質(zhì)編碼區(qū)的C_p7或C-NS2區(qū)構(gòu)建從克隆的 全長HCV共有基因組(基因型lb)衍生的復(fù)制子(I377/NS3-3’ ) (Lohman等人，Science 1999285 110-113)。該復(fù)制子含有以下元件(i)與衣殼編碼區(qū)的12個氨基酸融合的HCV 5’ -UTR ； (ii)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTID ； (iii)插入NPTII基因下游并指導(dǎo)HCV蛋白 質(zhì)NS2或NS3至NS5B翻譯的來自腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES和(iv)3，-UTR。在轉(zhuǎn)染 Huh-7細(xì)胞后，僅那些支持HCV RNA復(fù)制的細(xì)胞表達(dá)NPTII蛋白并顯現(xiàn)針對藥物G418的抗 性。盡管從此類G418抗性集落衍生的細(xì)胞系含有顯著水平的復(fù)制子RNA和病毒蛋白，然而 106個轉(zhuǎn)染的Huh-7細(xì)胞中僅1個細(xì)胞支持HCV復(fù)制。相似的可選擇性HCV復(fù)制子基于HCV-H基因型Ia感染性克隆(Blight等人， Science 2000290 1972-74)構(gòu)建。HCV-H衍生的復(fù)制子不能夠建立有效的HCV復(fù)制，表 明上文L0hmarm(1999)較早構(gòu)建的復(fù)制子依賴于那些實驗中使用的特定基因型Ib共有性 cDNA克隆。上文的Blight等人(2000)通過實施基于PCR的基因裝配方法重復(fù)了由上文 Lohmann等人(1999)所進(jìn)行的復(fù)制子的構(gòu)建并且獲得了耐受G418的Huh_7細(xì)胞集落。將 獨立的G418耐受細(xì)胞克隆測序以確定高水平HCV復(fù)制是否需要復(fù)制子適應(yīng)宿主細(xì)胞。鑒 定了在HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A中簇集的多個獨立的適應(yīng)性突變。所述突變賦予增加的體外 復(fù)制能力，與本領(lǐng)域較早構(gòu)建的復(fù)制子相比，具有從0.2%至10%轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，例 如I377/NS3-3，復(fù)制子具有0. 0001%轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本發(fā)明以發(fā)展新的HCV復(fù)制子穿梭載體為特征，其在NS3基因的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的 5’和3’端處導(dǎo)入獨特的限制性酶位點，從而自HCV感染患者的樣品衍生的NS3蛋白酶序列 可以在該穿梭載體中克隆并且可以評價所得復(fù)制子的復(fù)制適應(yīng)性和對HCV NS3蛋白酶抑制 劑的易感性。因為個體HCV感染患者一般含有因NS5B RNA聚合酶的高差錯率所致的遺傳多樣的病毒群體，故使用本發(fā)明的穿梭載體將允許表征特定患者衍生的NS3蛋白酶變體和 這些變體對藥物治療的敏感度或抗性。因此，本發(fā)明提供了包含HCV多核苷酸序列的HCV復(fù)制子穿梭載體，其中所述的 HCV多核苷酸序列依次包含位于來自編碼NS3蛋白的多核苷酸序列5’端的10個5’核苷酸 與10個3’核苷酸之間的獨特限制性酶序列；編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序 列；位于來自編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列3’端的10個5’核苷酸與10 個3’核苷酸之間的獨特限制性酶序列；編碼NS3蛋白的解旋酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列；編 碼NS4A蛋白的多核苷酸序列；編碼NS4B蛋白的多核苷酸序列；編碼NS5A蛋白的多核苷酸 序列；和編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，已經(jīng)修飾或缺失編 碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列，從而NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域是無功能的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在編碼NS3蛋白的多核苷酸序列5’端處的獨特限 制性酶序列識別EcoRV并且在編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列3’端處的獨 特限制性酶序列識別AsiSI。仍在本發(fā)明的一個實施方案中，HCV復(fù)制子穿梭載體包含選自 SEQ ID NO 3或SEQ IDNO 6的HCV多核苷酸序列。本發(fā)明的又一實施方案提供了用于評估HCV NS3蛋白酶抑制劑在受試者中控制 HCV感染的有效性的方法，包括步驟提供來自感染HCV的受試者的樣品，通過使用包含獨 特限制性酶序列的有義鏈引物和包含不同的獨特限制性酶序列的反義鏈引物從樣品中存 在的多個HCV準(zhǔn)種中PCR擴增編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列，克隆所述的 PCR擴增的多核苷酸序列至HCV復(fù)制子穿梭載體中以產(chǎn)生嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒，線性化 所述嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒并對所述的線性化質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生嵌合的HCV復(fù)制子 RNA,并且用所述的HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系并在HCV NS3蛋白酶抑制劑存在或不 存在下測量所述HCV復(fù)制子RNA的復(fù)制水平。本發(fā)明的再一實施方案提供了用于評估HCV NS3蛋白酶抑制劑在受試者中控制 HCV感染的有效性的方法，包括步驟提供來自感染HCV的受試者的樣品，通過使用包含獨 特限制性酶序列的有義鏈引物和包含不同的獨特限制性酶序列的反義鏈引物從樣品中存 在的多個HCV準(zhǔn)種中PCR擴增編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列，克隆所述的 PCR擴增的多核苷酸序列至HCV復(fù)制子穿梭載體中以產(chǎn)生嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化所 述的質(zhì)粒至細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多個集落，匯集所述集落并從匯集的集落分離嵌合的 HCV復(fù)制子質(zhì)粒，線性化所述嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒，對所述的線性化質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以 產(chǎn)生嵌合的HCV復(fù)制子RNA，并且用所述的HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系并在HCV NS3 蛋白酶抑制劑存在或不存在下測量所述HCV復(fù)制子RNA的復(fù)制水平。本發(fā)明的前述和其他優(yōu)點和特征以及獲得它們的方式將在考慮以下本發(fā)明詳述 連同伴隨的實施例后變得輕易顯見，其中所述的實施例闡述了示例性實施方案。附圖簡 述

圖1是HCV復(fù)制子穿梭載體的組分的示意圖。圖2顯示NS3蛋白酶復(fù)制子穿梭載體(A)pSC_lb_NS3/蛋白酶_EcoRV_AsiSI (SEQ ID NO 3) ； (B)pSC_lb_NS3/蛋白酶/LacZ_EcoRV_AsiSI(SEQ ID NO 6)的質(zhì)粒圖譜。圖3顯示pSC_lb_NS3/蛋白酶_EcoRV_AsiSI以及含有來自HCV基因型-Ia或基 因型Ib的患者衍生的NS3蛋白酶的復(fù)制子的復(fù)制能力。RLU代表在轉(zhuǎn)染96小時后觀察到的螢火蟲螢光素酶信號水平。本發(fā)明中使用的術(shù)語在下文定義。術(shù)語“HCV復(fù)制子”指來自丙型肝炎病毒的能夠指導(dǎo)自身拷貝產(chǎn)生的核酸。如本文 中所用，術(shù)語“復(fù)制子”包括RNA以及DNA及其雜合體。例如，HCV基因組的雙鏈DNA形式可 以用來產(chǎn)生構(gòu)成HCV復(fù)制子的單鏈RNA轉(zhuǎn)錄物。HCV復(fù)制子可以包括全長HCV基因組或也 稱作“亞基因組復(fù)制子”的HCV亞基因組構(gòu)建體。例如，本文中所述的HCV亞基因組復(fù)制子 含有該病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的大多數(shù)基因，但是沒有編碼結(jié)構(gòu)蛋白的大多數(shù)基因。亞基因組復(fù) 制子能夠指導(dǎo)為病毒亞基因組復(fù)制、亞基因組復(fù)制子復(fù)制所必需的全部病毒基因表達(dá)，而 不產(chǎn)生病毒顆粒?；綡CV復(fù)制子是含有HCV 5’-非翻譯(UTR)區(qū)、HCV NS3-NS5B多聚蛋白編碼區(qū) 和HCV 3’-UTR的亞基因組構(gòu)建體。可以存在其他核酸區(qū)域如提供HCV NS2、HCV結(jié)構(gòu)蛋白 的那些核酸區(qū)域和非HCV序列。HCV 5’_UTR區(qū)提供用于蛋白質(zhì)翻譯的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)和復(fù)制所需的 元件。HCV 5’-UTR區(qū)包括延伸進(jìn)入HCV核心編碼區(qū)約36個核苷酸的天然存在HCV 5'-UTR 和其功能衍生物。5’ -UTR區(qū)可以在不同位置存在，如在編碼選擇蛋白、報告蛋白或HCV多 聚蛋白的序列下游的位點。除了 HCV 5，-UTR-PC區(qū)，非HCV IRES元件也可以存在于復(fù)制子中。非HCV IRES元 件可以在不同位置存在，包括緊鄰編碼HCV多聚蛋白的區(qū)域上游?？梢允褂玫姆荋CV IRES 元件的實例是EMCV IRES、脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES和牛病毒性腹瀉病病毒IRES。HCV 3，-UTR幫助HCV復(fù)制。HCV 3，UTR包括天然存在的HCV3，-UTR和其功能衍 生物。天然存在的3’ -UTR包括聚U區(qū)域和約100個核苷酸的額外區(qū)域。NS3-NS5B多聚蛋白編碼區(qū)提供了在細(xì)胞中可以加工成不同蛋白質(zhì)的多聚蛋白。 可以是復(fù)制子的部分的合適NS3-NS5B多聚蛋白序列包括在不同HCV毒株中存在的那些 NS3-NS5B多聚蛋白序列和導(dǎo)致NS3-NS5B加工以產(chǎn)生功能性復(fù)制裝置的其功能等同物。恰 當(dāng)?shù)募庸た梢酝ㄟ^測試NS5B RNA依賴性RNA聚合酶進(jìn)行測量。“載體”是一段DNA，如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，其中另一段DNA區(qū)段可以與之連接，從 而引起所連DNA區(qū)段的復(fù)制、表達(dá)或整合?！按┧筝d體”指載體，其中可以在特定限制性酶位 點處插入或從載體中切除DNA區(qū)段。插入穿梭載體的DNA區(qū)段通常編碼目的多肽或RNA，并 且設(shè)計限制性酶位點以確保DNA區(qū)段插入恰當(dāng)?shù)目勺x框中用于轉(zhuǎn)錄和翻譯。多種載體可以用來表達(dá)核酸分子。此類載體包括染色體型、附加型和病毒衍生的 載體，例如從細(xì)菌質(zhì)粒、從噬菌體、從酵母附加體、從酵母染色體元件(包括酵母人工染色 體)衍生的載體、從病毒如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、痘病毒、偽狂 犬病毒、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的載體。載體也可以從這些來源的組合中衍生，如從 質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件衍生的那些載體，例如粘粒和噬菌粒。用于原核和真核宿主的適宜 克隆和表達(dá)載體在 Sambrook 等人，(1989)Molecular Cloning =ALaboratory Manual.第 2 版.Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, USA 中描述。含有適宜核酸分子的載體可以使用已知技術(shù)導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞以增殖或表達(dá)。宿 主細(xì)胞可以包括細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)和 鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；真核細(xì)胞，包括但不限于酵母、昆蟲細(xì)胞如果蠅(Drosophila)、動物細(xì)胞如 Huh_7、HeLa、COS、HEK 293、MT-2T、CEM-SS 和 CHO 細(xì)胞，和植 物細(xì)胞。載體通常包括能夠選擇含有重組載體構(gòu)建體的細(xì)胞亞群的選擇標(biāo)記。該標(biāo)記可以 在含有本文中所述核酸分子的相同載體中包含或可以存在于分立的載體上。標(biāo)記包括用于 原核宿主細(xì)胞的四環(huán)素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因和用于真核宿主細(xì)胞的二氫葉酸 還原酶或新霉素抗性。然而，提供表型性狀選擇的任何標(biāo)記將是有效的?！岸嗪塑账帷被颉昂怂岱肿印蓖ǔＶ溉我舛嗪颂呛塑账峄蚨嗝撗鹾颂呛塑账幔梢?是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA?！岸嗪塑账帷卑ǖ幌抻趩捂満碗p鏈DNA、作 為單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA、和作為單鏈區(qū)和雙鏈域區(qū)的混合物的 RNA、包含DNA和RNA的雜合分子，其可以是單鏈或更一般地是雙鏈或是單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的 混合物。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或包含RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)。“多核苷 酸”也包括常稱作寡核苷酸的相對短的多核苷酸。另外，術(shù)語“DNA分子”僅指分子的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，并且不將DNA分子限于任 何具體的三級結(jié)構(gòu)形式。因此，該術(shù)語特別地包括在線性DNA分子(例如限制性片段)、病 毒、質(zhì)粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。在討論具體雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時，可以在本文中根 據(jù)僅給出5’至3’方向的序列連同非轉(zhuǎn)錄的DNA鏈(即，具有與mRNA同源的序列的鏈)的 常規(guī)習(xí)慣描述序列。"RNA分子”指處于其單鏈形式或雙鏈螺旋形式的核糖核苷酸的多聚形式。在討論 具體RNA分子的結(jié)構(gòu)時，可以在本文中根據(jù)給出5’至3’方向序列的常規(guī)習(xí)慣描述序列。術(shù)語“限制性酶序列，，指由均在特定核苷酸序列處或其附近切割雙鏈DNA的細(xì)菌 酶識別和切割的特定雙鏈DNA序列。限制性酶“EcoRV”識別序列5’ GAT ^ATC 3’并在所 示(以▼▲顯示的)核苷酸位置處切割3' CTAaTAG 5'雙鏈DNA。限制性酶“AsiSI ”識別序列5，GCGAT ▼ CGC 3，并在識別序列3' CGCaTAGCG 5'的T殘基之后切割。如本文中所用的術(shù)語“引物”指RNA或DNA的、單鏈或雙鏈的、通過限制性酶消化生 成而從生物系統(tǒng)衍生的或合成產(chǎn)生的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在置于恰當(dāng)環(huán)境下時能 夠功能性地充當(dāng)模板依賴性核酸合成的引發(fā)物。當(dāng)連同適宜核酸模板、核酸的合適核苷三 磷酸前體、聚合酶、合適輔因子和條件如合適的溫度和PH存在時，引物可以通過聚合酶作 用或產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物的相似活性所致的核苷酸添加而在引物的3’末端延伸。引起物可 以根據(jù)具體的應(yīng)用條件和要求在長度方面變化。例如在PCR反應(yīng)中，引物長度一般是15-25 個核苷酸或更長。引物必須與目的模板充分互補以引發(fā)目的延伸產(chǎn)物合成，即能夠與目的 模板鏈以這樣的方式復(fù)性，所述方式足以提供處于適宜并置的引物3’ -羥基部分以用在啟 動由聚合酶或相似酶引起的合成中。不要求引物序列代表目的模板的完全互補體。例如， 非互補的核苷酸序列(例如限制性酶識別序列)可以連接至否則是互補引物的5’ -末端。 備選地，非互補的堿基可以散布在寡核苷酸引物序列內(nèi)部，條件是該引物序列與目的模板 鏈具有足夠互補性以功能性地提供模板引物復(fù)合體用于合成延伸產(chǎn)物。如本文中所用的術(shù)語“嵌合的”意指從來自兩個或多個不同來源的DNA產(chǎn)生的已
11經(jīng)融合或剪接在一起的DNA分子。如本文中所用，術(shù)語“準(zhǔn)種”意指優(yōu)勢HCV基因組序列(即基因型)的微變體集 合，所述微變體在單一感染的受試者中甚至在單個細(xì)胞克隆中因HCV復(fù)制期間的高突變率 形成。如本文中所用的術(shù)語“受試者”指脊椎動物，特別地哺乳動物物種的成員，并且包 括但不限于嚙齒類、兔、駒鼯和靈長類，后者包括人。術(shù)語“樣品”指從受試者分離的組織或體液的樣品，包括但不限于例如血漿、血清、 脊髓液、淋巴液、皮膚外切片(the external sections of theskin)、呼吸道、腸道和泌尿生 殖道、淚、唾液、乳、血細(xì)胞、腫瘤、器官和還有體外細(xì)胞培養(yǎng)物組成的樣品(包括但不限于 來自所培養(yǎng)細(xì)胞、推定的病毒感染的細(xì)胞、重組細(xì)胞生長產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基和細(xì)胞組分)。當(dāng)將外源或異源DNA或RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部時，則細(xì)胞已經(jīng)被此類DNA或RNA “轉(zhuǎn) 化”或“轉(zhuǎn)染”。轉(zhuǎn)化性或轉(zhuǎn)染性DNA或RNA可以或可以不整合(共價地連接)入構(gòu)成細(xì)胞 基因組的染色體DNA。例如在原核生物、酵母和哺乳動物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化性DNA可以維持在附 加型元件如質(zhì)粒上。就真核細(xì)胞而言，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是這樣的細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)化性DNA已經(jīng) 整合至染色體中，從而該DNA通過染色體復(fù)制被子代細(xì)胞繼承。這種穩(wěn)定性由真核細(xì)胞建 立細(xì)胞系或克隆的能力展示，其中所述的細(xì)胞系或克隆由含有轉(zhuǎn)化性DNA的子代細(xì)胞群體 組成。在轉(zhuǎn)化如本發(fā)明中所述哺乳動物細(xì)胞的HCV復(fù)制子的情況下，RNA分子例如HCV RNA 分子具有半自主復(fù)制的能力。攜帶HCV復(fù)制子的Huh-7細(xì)胞通過在該復(fù)制子上存在的選擇 標(biāo)記或報道基因檢測。“克隆”指通常借助有絲分裂過程從單個細(xì)胞或共同祖先衍生的細(xì)胞群體。實施例給出以下制備和實施例以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更清楚地理解并實施本發(fā)明。它 們不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍，而僅視為說明和描述本發(fā)明。實施例1質(zhì)粒的構(gòu)建NS3蛋白酶復(fù)制子穿梭載體從HCV復(fù)制子穿梭載體pSC_lb_NS3_EcoRV衍生，其中 所述的pSC_lb_NS3_EcoRV是用來產(chǎn)生HCV NS3復(fù)制子穿梭載體pSC_lb_NS3_EcoRV_XbaI 的中間載體并且在Chua等人于2007年9月27日提交的名為“HCV NS3復(fù)制子穿梭載體” 的美國專利申請USSN 60/995, 558中公開，所述文獻(xiàn)通過引用的方式完整并入本文中作為 參考。所述復(fù)制子穿梭載體的組件在圖1中顯示并且含有來自5’ -UTR、NS3至NS5B蛋白 和3’ -UTR的HCV多核苷酸序列。所述載體也包括控制螢火蟲螢光素酶基因翻譯的脊髓灰 質(zhì)炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)。在螢火蟲螢光素酶基因的下游，來自腦心肌炎病毒 (EMCV)的 IRES 控制 HCV 非結(jié)構(gòu)基因(NS3、NS4A、NS4B、NS5A 禾口 NS5B)的翻譯。使用QuickChange位點定向誘變試劑盒，按照制造商說明書(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，將突變導(dǎo)入pSC_lb_NS3_EcoRV_XbaI。為了在NS3基因的蛋白酶結(jié)構(gòu)域3’ 端(對應(yīng)于氨基酸位置SerlSl)導(dǎo)入AsiSI限制性酶序列，使用以下引物有義引物5' -GAGTCTATGGGAACCACTATGCGATCGCCGGTCTTCACGGACAACTCGTC-3' (SEQ ID NO 1)反義引物
5' -GACGAGTTGTCCGTGAAGACCGGCGATCGCATAGTGGTTCCCATAGACTC-3'(SEQ ID NO 2)這些突變不改變NS3蛋白的氨基酸編碼序列并且導(dǎo)致生成NS3蛋白酶穿梭載體 pSC_lb_NS3/蛋白酶_EcoRV_AsiSI(SEQ ID NO :3，圖 2A)。生成了另一種 NS3 蛋白酶復(fù)制子 穿梭載體，其中編碼NS3基因的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的序列被來自pUC19 (GenBank登錄號M77789) 的半乳糖苷酶(IacZ)編碼序列替代。使用以下引物，通過PCR擴增導(dǎo)入在IacZ基因 5’端的EcoRV限制性位點和在其3’端的AsiSI限制性位點5' -ATCATCATCGATATCACCGCGTTGGCCGATTCATTAATG-3' (SEQ ID NO 4) (EcoRV) (LacZ)5‘ -GATGATGATGCGATCGCCAGCTCCCGGAGACGGTCAC-3‘ (SEQ ID NO 5) (AsiSI) (LacZ)以生成載體 pSC_lb_NS3/ 蛋白酶 /LacZ_EcoRV_AsiSI (SEQ ID NO :6，圖 2B)。使用實施例3中描述(和在圖3中顯示)的表型測定法評估NS3蛋白酶復(fù)制子穿 梭載體的復(fù)制能力。實施例2克隆從感染患者擴增的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域PCR樣品至NS3蛋白酶復(fù)制子穿梭載體 中使用superscript III系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)制造商的方案，通過來自血漿的 RNA的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)產(chǎn)生編碼NS3基因的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的DNA序列，其 中所述的血漿從感染HCV基因型-Ia和基因型Ι-b的患者獲得。用于該RT-PCR步驟的引 物如下?；蛐虸a 有義引物(NS2)5，-CGTGCGGTGACATCATCAACGG-3，(SEQID NO 7)反義引物(NS3/ 解旋酶)5，-CTCGCCCCCGCAGTCTCTGC-3，(SEQ IDNO 8)基因型Ib 有義引物(NS2)5，-GAGACCAAGATCATCACCTGG-3，(SEQID NO 9)反義引物(NS3/解旋酶)5，-GTCCAGGACTGTGCCGATGCC-3，(SEQIDNO 10)首先在50°C進(jìn)行復(fù)性并且隨后是94°C變性、53°C復(fù)性和68°C延伸的PCR循環(huán)。隨 后用PhusionTM高保真DNA聚合酶系統(tǒng)(New EnglandBiolabs)，使用在NS3蛋白的蛋白酶 結(jié)構(gòu)域的5’和3’端導(dǎo)入獨特限制性酶序列的引物，將擴增產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR。用來在患 者NS3基因序列5’端附近導(dǎo)入EcoRV限制性酶序列的有義引物如下基因型Ia5' -CTGTCTGTCTGATATCACCATGGCGCCCATCACGGCGTACGCC-3， (SEQ ID NO :11)基因型Ib5’-CTGTCTGTCTGATATCACCATGGCGCCTATTACGGCCTACTC-3’ (SEQ ID NO 12)用來在NS3基因的蛋白酶結(jié)構(gòu)域3’端(對應(yīng)于氨基酸位置SerlSl)附近導(dǎo)入 AsiSI限制性酶序列的引物如下基因型Ia5’-TAGTAGTAGGCGATCGCATGGTTGTCCCTAGGTTCTC-3，(SEOID NO 13)
基因型Ib5' -TAGTAGTAGGCGATCGCATAGTGGTTCCCATAGACTCG-3'(SEQ ID NO: 14)用98°C變性、53°C復(fù)性和72°C延伸的PCR循環(huán)實施擴增。擴增的患者NS3蛋白酶 DNA隨后用Qiagen PCR純化柱純化并用EcoRV和SgfI (AsiSI的同切點酶)消化。NS3 蛋白酶穿梭復(fù)制子載體 pSC_lb_NS3/ 蛋白酶 _EcoRV_AsiSI 或 pSC_lb_NS3/ 蛋白酶/LaCZ_EC0RV_AsiSI通過用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRV和SgfI雙重消化而制備。使 用MightMix連接試劑盒(Takara BioInc.)，將25ng穿梭載體與消化的患者擴增子在16°C 連接1.5小時。常規(guī)地使用1 2至1 4的載體對插入物之比。將5μ1反應(yīng)物轉(zhuǎn)化至 50μ 1的ToplO細(xì)胞(Invitrogen)中并在37°C表型表達(dá)1小時后涂板。挑出96個獨立菌落以接種補充有50 μ g/ml氨芐青霉素的200 μ ITerrific肉湯 (ΤΒ)。這個“原種” 96孔平板在37°C孵育過夜。次日，使用該平板來制備一塊重復(fù)平板。 使用48針復(fù)制器以將平板復(fù)制到補充有100 μ g/ml羧芐青霉素的兩塊LB平板上。將96 份獨立的200 μ 1培養(yǎng)物也轉(zhuǎn)移至補充有50 μ g/ml氨芐青霉素的1. 5ml TB培養(yǎng)基以用于 DNA制備。在37°C過夜孵育后，用6ml LB鋪展復(fù)制平板以獲得96個克隆的異質(zhì)匯集物，所 述匯集物隨后用于微量DNA制備?；颊叩倪@種DNA匯集物隨后用于后續(xù)的復(fù)制子表型測定 法。在37°C過夜振搖后，將96份獨立的1. 5ml TB培養(yǎng)物離心下來、傾析并且使用Qiagen 的Qiapr印96Turbo Mini-DNA試劑盒提取質(zhì)粒DNA。這些獨立的分子克隆用于測序反應(yīng)， 其中所述獨立的分子克隆代表用于復(fù)制子表型測定法的復(fù)合96匯集物。對異質(zhì)克隆匯集物質(zhì)粒DNA或獨立的分子克隆進(jìn)行測序以證實患者樣品的身份 并在表型復(fù)制子測定法中檢驗對抑制劑的敏感性。實施例3表型復(fù)制子測定法A.體外轉(zhuǎn)錄RNA的制備5微克DNA質(zhì)粒由Sca I限制性酶(Roche)線性化。在37°C過夜消化后，使用 Qiagen PCR純化試劑盒純化該DNA。使用T7RiboMAX Express (Promega)，按照制造商的方 案，將1微克的線性化DNA用于體外轉(zhuǎn)錄。在37°C孵育2小時后，在37°C進(jìn)行30分鐘DNA 酶處理以除去DNA模板。然后使用RNeasy離心柱(Qiagen)，按照制造商的方案，純化體外 轉(zhuǎn)錄的RNA。B.肝癌細(xì)胞系將肝癌Lunet Huh_7細(xì)胞系在37 °C于含5% CO2的濕潤氣氛下培養(yǎng)在補充有 Glutamax 和100mg/ml丙酮酸鈉的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。該培養(yǎng)基進(jìn) 一步以10% (v/v) FBS和1% (ν/ν)青霉素/鏈霉素補充。全部試劑均來自Invitrogen/ Gibco0C.瞬時型復(fù)制子復(fù)制水平的確定使用電穿孔法，用5 μ g體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染4百萬個Lunet Huh7細(xì)胞。細(xì)胞隨 后重懸于含有5% FBS的7. 2ml DMEM中并以50000個細(xì)胞/孔(在90 μ 1終體積中)鋪種 在96孔平板中。在轉(zhuǎn)染后24小時以3倍稀釋度以DMSO終濃度添加抑制劑(當(dāng)使用抑 制劑時)并且在添加抑制劑后72小時使用螢光素酶測定法系統(tǒng)(Promega)讀取螢火蟲螢光素酶報道信號。將IC5tl值評估為這樣的抑制劑濃度，在所述抑制劑濃度時，與不添加化合 物時螢火蟲螢光素酶信號的水平相比，觀察到螢火蟲螢光素酶報道蛋白的水平降低50%。用螢光素酶信號檢驗復(fù)制子穿梭載體pSC_lb_NS3/蛋白酶_EcoRV_AsiSI以及含 有HCV基因型-Ia和基因型-Ib患者衍生的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的復(fù)制子的那些復(fù)制能力 并在圖3中顯示結(jié)果。也在這些復(fù)制子上檢驗了 HCV蛋白酶抑制劑BILN2061、VX-950和 NM107的抑制作用并且在表1中顯示結(jié)果。表 1
權(quán)利要求
包含HCV多核苷酸序列的HCV復(fù)制子穿梭載體，所述HCV多核苷酸序列依次包含(a)位于來自編碼NS3蛋白的多核苷酸序列5’端中的10個5’核苷酸與10個3’核苷酸之間的獨特限制性酶序列；(b)編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列；(c)位于來自編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列3’端中10個5’核苷酸與10個3’核苷酸之間的獨特限制性酶序列；(d)編碼NS3蛋白的解旋酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列；(e)編碼NS4A蛋白的多核苷酸序列；(f)編碼NS4B蛋白的多核苷酸序列；(g)編碼NS5A蛋白的多核苷酸序列；和(h)編碼NS5B蛋白的多核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的HCV復(fù)制子穿梭載體，其中已經(jīng)修飾或缺失編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié) 構(gòu)域的多核苷酸序列，從而NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域是無功能的。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的HCV復(fù)制子穿梭載體，其中在編碼NS3蛋白的多核苷酸 序列5’端處的獨特限制性酶序列識別EcoRV并且在編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核 苷酸序列3’端處的獨特限制性酶序列識別AsiSI。
4.HCV復(fù)制子穿梭載體，其包含選自SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 6的HCV多核苷酸序列。
5.用于評估HCVNS3蛋白酶抑制劑在受試者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步驟(a)提供來自感染HCV的受試者的樣品；(b)通過使用包含獨特限制性酶序列的有義鏈引物和包含不同的獨特限制性酶序列的 反義鏈引物，從樣品中存在的多個HCV準(zhǔn)種中PCR擴增編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多 核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR擴增的多核苷酸序列至HCV復(fù)制子穿梭載體中以產(chǎn)生嵌合的HCV 復(fù)制子質(zhì)粒；(d)線性化所述嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒并對所述的線性化質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生嵌 合的HCV復(fù)制子RNA ；和(e)用所述的HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制劑存在或不存 在下測量所述HCV復(fù)制子RNA的復(fù)制水平。
6.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求1的HCV復(fù) 制子穿梭載體。
7.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求2的HCV復(fù) 制子穿梭載體。
8.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求3的HCV復(fù) 制子穿梭載體。
9.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求4的HCV復(fù) 制子穿梭載體。
10.用于評估HCVNS3蛋白酶抑制劑在受試者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步驟(a)提供來自感染HCV的受試者的樣品；(b)通過使用包含識別EcoRV的限制性酶序列的有義鏈引物和包含識別AsiSI的限制 性酶序列的反義鏈引物，從樣品中存在的多個HCV準(zhǔn)種中PCR擴增編碼NS3蛋白的蛋白酶 結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR擴增的多核苷酸序列至HCV復(fù)制子穿梭載體中以產(chǎn)生嵌合的HCV 復(fù)制子質(zhì)粒；(d)線性化所述嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒并對所述的線性化質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生嵌 合的HCV復(fù)制子RNA ；和(e)用所述的HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制劑存在或不存 在下測量所述HCV復(fù)制子RNA的復(fù)制水平。
11.權(quán)利要求10的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求1的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
12.權(quán)利要求10的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求2的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
13.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求3的HCV復(fù) 制子穿梭載體。
14.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求4的HCV復(fù) 制子穿梭載體。
15.用于評估HCVNS3蛋白酶抑制劑在受試者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步驟(a)提供來自感染HCV的受試者的樣品；(b)通過使用包含選自SEQID NO 11或SEQ ID NO 12的核苷酸序列的有義鏈引物和 包含選自SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14的核苷酸序列的反義鏈引物，從樣品中存在的多 個HCV準(zhǔn)種中PCR擴增編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR擴增的多核苷酸序列至HCV復(fù)制子穿梭載體中以產(chǎn)生嵌合的HCV 復(fù)制子質(zhì)粒；(d)線性化所述嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒并對所述的線性化質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生嵌 合的HCV復(fù)制子RNA ；和(e)用所述的HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制劑存在或不存 在下測量所述HCV復(fù)制子RNA的復(fù)制水平。
16.權(quán)利要求15的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求1的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
17.權(quán)利要求15的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求2的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
18.權(quán)利要求15的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求3的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
19.權(quán)利要求15的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求4的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
20.用于評估HCVNS3蛋白酶抑制劑在受試者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步驟(a)提供來自感染HCV的受試者的樣品；(b)通過使用包含獨特限制性酶序列的有義鏈引物和包含不同的獨特限制性酶序列的 反義鏈引物，從樣品中存在的多個HCV準(zhǔn)種中PCR擴增編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多 核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR擴增的多核苷酸序列至HCV復(fù)制子穿梭載體中以產(chǎn)生嵌合的HCV 復(fù)制子質(zhì)粒；(d)轉(zhuǎn)化所述的質(zhì)粒至細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多個集落；(e)匯集所述集落并從匯集的集落分離嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒；(f)線性化來自步驟(e)的所述嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒并對所述的線性化質(zhì)粒進(jìn)行體 外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生嵌合的HCV復(fù)制子RNA ；和(g)用所述的HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制劑存在或不存 在下測量所述HCV復(fù)制子RNA的復(fù)制水平。
21.權(quán)利要求20的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求1的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
22.權(quán)利要求20的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求2的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
23.權(quán)利要求20的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求3的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
24.權(quán)利要求20的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求4的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
25.用于評估HCVNS3蛋白酶抑制劑在受試者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步驟(a)提供來自感染HCV的受試者的樣品；(b)通過使用包含識別EcoRV的限制性酶序列的有義鏈引物和包含識別AsiSI的限制 性酶序列的反義鏈引物，從樣品中存在的多個HCV準(zhǔn)種中PCR擴增編碼NS3蛋白的蛋白酶 結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR擴增的多核苷酸序列至HCV復(fù)制子穿梭載體中以產(chǎn)生嵌合的HCV 復(fù)制子質(zhì)粒；(d)轉(zhuǎn)化所述的質(zhì)粒至細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多個集落；(e)匯集所述集落并從匯集的集落分離嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒；(f)線性化來自步驟(e)的所述嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒并對所述的線性化質(zhì)粒進(jìn)行體 外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生嵌合的HCV復(fù)制子RNA ；和(g)用所述的HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制劑存在或不存 在下測量所述HCV復(fù)制子RNA的復(fù)制水平。
26.權(quán)利要求25的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求1的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
27.權(quán)利要求25的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求2的HCV復(fù)制子穿梭載體。
28.權(quán)利要求25的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求3的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
29.權(quán)利要求25的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求4的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
30.用于評估HCVNS3蛋白酶抑制劑在受試者中控制HCV感染的有效性的方法，包括步驟(a)提供來自感染HCV的受試者的樣品；(b)通過使用包含選自SEQID NO 11或SEQ ID NO 12的核苷酸序列的有義鏈引物和 包含選自SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14的核苷酸序列的反義鏈引物，從樣品中存在的多 個HCV準(zhǔn)種中PCR擴增編碼NS3蛋白的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列；(c)克隆所述的PCR擴增的多核苷酸序列至HCV復(fù)制子穿梭載體中以產(chǎn)生嵌合的HCV 復(fù)制子質(zhì)粒；(d)轉(zhuǎn)化所述的質(zhì)粒至細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多個集落；(e)匯集所述集落并從匯集的集落分離嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒；(f)線性化來自步驟(e)的所述嵌合的HCV復(fù)制子質(zhì)粒并對所述的線性化質(zhì)粒進(jìn)行體 外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生嵌合的HCV復(fù)制子RNA ；和(g)用所述的HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系并在HCVNS3蛋白酶抑制劑存在或不存 在下測量所述HCV復(fù)制子RNA的復(fù)制水平。
31.權(quán)利要求30的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求1的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
32.權(quán)利要求30的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求2的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
33.權(quán)利要求30的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求3的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
34.權(quán)利要求30的方法，其中步驟(c)的HCV復(fù)制子穿梭載體包含權(quán)利要求4的HCV 復(fù)制子穿梭載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的HCV NS3蛋白酶復(fù)制子穿梭載體，其用于克隆來自HCV感染患者的樣品的HCV多核苷酸序列并測試所得復(fù)制子的藥物易感性。
文檔編號C12N15/09GK101889085SQ200880119508
公開日2010年11月17日 申請日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日
發(fā)明者S·阿力, W-R·蔣 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司