新檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥和癌癥檢測領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及對敏感指征例如腫瘤細 胞活性的新檢測方法。根據(jù)本發(fā)明的方法可用于對上皮源性癌，例如非小細胞肺癌，和膀胱 癌患者的管理。
【背景技術(shù)】
[0002] 在工業(yè)世界，癌癥是主要致死原因中的一個。為了改善病人護理，當前致力于發(fā)現(xiàn) 關(guān)于預(yù)測、治療反應(yīng)的早期跡象和疾病進程的其它信息。為此感興趣的工具是癌癥生物標 記的使用，即表明體內(nèi)存在癌癥的物質(zhì)。生物標記是腫瘤或人體對存在的癌癥的特異反應(yīng) 分泌的分子。理想的是，這種生物標記能夠在非侵入式收集的生物液體如尿液、血液或血清 中檢測。
[0003] 人們感興趣的一個領(lǐng)域是肺癌，它是世界范圍內(nèi)最普遍和最致命的癌癥疾病。肺 癌致死的人比結(jié)腸、乳腺和前列腺癌的總和還多(WHO統(tǒng)計）。大約80-85%的肺癌患者有非 小細胞組織(NSCLC)。非小細胞肺癌(SCLC)占所有肺癌情況的約15-20%。大部分患者具有 處于晚期且無法手術(shù)的疾病。對于早期階段的NSCLC，切除作為僅有的有療效的治療方法仍 然是重要的。過去的十年間，人們廣泛研究了腫瘤標記物在肺癌中的價值。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的對肺 癌具有臨床重要性的最普遍的生物標記是CEA、CYFRA、TPA、TPS和NSE。然而，靈敏性和專一 性的缺乏限制了癌癥生物標記在對肺癌進行檢查和早期診斷中的應(yīng)用。對于疾病的預(yù)后評 價和過程檢測，癌癥生物標記顯得更加有效。
[0004] 所有真核細胞具有已知為中間絲的細胞質(zhì)細胞骨架結(jié)構(gòu)。細胞骨架網(wǎng)絡(luò)負責細胞 的機械完整性且在細胞過程如細胞分裂、運動和細胞間接觸中至關(guān)重要。目前，已經(jīng)確認了 超過20種不同的細胞角蛋白，其中在簡單上皮細胞中細胞角蛋白8、18和19是最充足的。細 胞角蛋白是上皮細胞特有的且細胞角蛋白模式在正常細胞轉(zhuǎn)化成惡性細胞過程中通常保 留下來。
[0005] 檢測細胞角蛋白8、18和19上限定的表位的固相兩位點免疫放射分析（IRMA)是商 業(yè)上可獲取的（IDL Biothch，Bromma Sweden)，商標為]VlonoTotal?。將捕獲抗體，單克隆抗 體6D7(CK8)、3F3(CK18)和IDLC4(CK19)涂覆于塑料珠上。分析中使用多克隆 125I-標記抗體 作為示蹤劑。用γ計數(shù)器檢測放射活性且放射活性正比于細胞角蛋白抗原片段的濃度。 MonoTotal是設(shè)計為進行患者血清檢測的定量檢測。MonoTotal作為預(yù)后標記對于診斷、預(yù) 后，和對于監(jiān)控患者的治療是有價值的。通過跟蹤患者的重復MonoTotal檢測，醫(yī)生能夠獲 取有關(guān)腫瘤細胞活性的關(guān)鍵信息。變化的MonoTotal標記水平表明腫瘤細胞活性發(fā)生變化， 且提高的水平指向腫瘤的存在。在患者管理和隨訪中該信息被認為特別重要，其中血液樣 品可用于監(jiān)測治療和對腫瘤復發(fā)的早期檢測。當疾病仍限制于肺部時大約15%的肺癌患者 被確診，且早期檢測對于增加生存的可能是至關(guān)重要的。通過使用MonoTotal，醫(yī)生可以得 到疾病過程的指征信息，其以腫瘤細胞活性而不是傳統(tǒng)的腫瘤負荷檢測來測定。Mono Total能夠向醫(yī)生提供對診斷、建立預(yù)后、治療監(jiān)測和患者隨訪中可靠的輔助信息。
[0006] 根據(jù)已公開研究，MonoTotal顯現(xiàn)出與患者的臨床反應(yīng)非常相關(guān)。相較于肺癌患者 中的Cyfra，MonoTotal具有更高的靈敏度。在肺癌診斷中，不依賴于組織分型，MonoTotal的 整體靈敏度是約70-75 %，且特異性為95 %。非小細胞肺癌（NSCLC)的靈敏度更高。 MonoTotal與腫瘤細胞活性和疾病程度非常相關(guān)。此外，MonoTotal可預(yù)測疾病進程(無病期 間和整體存活率），且在NSCLC隨訪中是復發(fā)的早期標志。MonoTotal中的變化通常早于傳統(tǒng) 成像方法的復發(fā)的檢測。由于血清中細胞角蛋白的半衰期小于一天，所以在幾天內(nèi)能夠進 行對治療反應(yīng)的檢測。MonoTotal對于NSCLC是比程序化臨床實踐中目前使用的其他生物角 蛋白標記更靈敏的腫瘤標記。
[0007] 另一個感興趣的領(lǐng)域是膀胱癌，在世界范圍內(nèi)其是男性和女性中常見的癌癥。超 過70%的情況都是非肌層浸潤性膀胱癌，但是很多患者發(fā)展成肌層浸潤性膀胱癌或轉(zhuǎn)移性 疾病。為提高對膀胱癌的預(yù)后，使用有效的方法進行早期檢測和常規(guī)隨訪對于患者而言是 重要的。
[0008] 非浸潤性膀胱癌檢測具有很多潛在應(yīng)用，如幫助診斷復發(fā)，降低對侵入性檢測的 需求和檢測患者是否落入高風險范疇。UBC?免疫檢測（IDL Biotech)是一種非侵入性檢 測。
[0009] 然而，盡管當前市場上存在一些方法和檢測，但仍然存在對改進的診斷工具的需 求以從患者獲得關(guān)鍵臨床數(shù)據(jù)，避免能夠?qū)膊〉脑缙诎Y狀進行有效檢測和對患者體內(nèi)的 疾病狀況進行快速檢測時與使用多克隆抗體有關(guān)的弊端，例如通過血清或尿液分析。在該 領(lǐng)域中產(chǎn)品和過程滿足高質(zhì)量標準，并根據(jù)標準化流程來開發(fā)、生產(chǎn)并供應(yīng)到市場是至關(guān) 重要的。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 盡管可獲得的指征腫瘤細胞活性的方法運行的較好，但它取決于放射性標記抗體 的使用，其受限于特定規(guī)則和預(yù)防措施，對該方法的使用者產(chǎn)生了管理性和實踐性負擔。它 進一步取決于來自特定源的多克隆抗體的使用，如果來源不能提供多克隆抗體則會導致供 應(yīng)問題。因此本發(fā)明人確認了開發(fā)不依賴于放射活性或多克隆抗體的特定源，但同時與現(xiàn) 存方法臨床上可兼容的方法的需求。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，使用一個、兩個或三個抗體固定于固相來捕獲來自液體樣品的細胞 角蛋白。標記的抗體與固相隨后接觸并使得能夠結(jié)合到固定的抗體-細胞角蛋白復合物，對 結(jié)合的抗體進行檢測。
[0013] 因此，本發(fā)明的一個方面涉及檢測樣品中至少兩種細胞角蛋白和/或其可溶性片 段的方法，所述細胞角蛋白選自細胞角蛋白8、18和/或19組成的組中，所述方法包括步驟：
[0014] -使所述樣品接觸其上已經(jīng)固定了對細胞角蛋白8具有特異性的第一抗體，和/或 對細胞角蛋白18具有特異性的第二抗體，和/或?qū)毎堑鞍?9的第一表位具有特異性的 第三抗體的固相；
[0015] -使所述樣品中的細胞角蛋白和/或其可溶性片段結(jié)合到所述第一、第二和/或第 三抗體從而形成復合物；
[0016] -使所述復合物與對細胞角蛋白8和18的二聚體具有特異性的第一標記抗體和對 細胞角蛋白19的第二表位具有特異性的第二標記抗體接觸；
[0017] -使所述標記抗體結(jié)合到所述復合物；
[0018]-檢測結(jié)合到所述復合物的所述標記抗體。
[0019]在另一方面，本發(fā)明涉及定量檢測選自細胞角蛋白8、18和19組成的組中的至少兩 種細胞角蛋白的可溶性片段的方法，包括根據(jù)前述方面的方法，和進一步的將對細胞角蛋 白8和18的二聚體具有特異性的第一標記抗體和任選的對細胞角蛋白19具有特異性的第二 標記抗體的量與細胞角蛋白8、18和/或19可溶性片段的量定量相關(guān)聯(lián)的步驟。
[0020] 在另一方面，本發(fā)明涉及實施根據(jù)上述任一方面方法的組配試劑盒，所述組配試 劑盒包括其上固定了對細胞角蛋白8具有特異性的第一抗體，和/或?qū)毎堑鞍?8具有特 異性的第二抗體和/或?qū)毎堑鞍?9具有特異性的第三抗體的固相;和對細胞角蛋白8和 18的二聚體具有特異性的第一標記抗體，和任選的，對細胞角蛋白19具有特異性的第二標 記抗體，優(yōu)選的是在緩沖溶液中。
[0021] 本發(fā)明進一步的實施方式在以下的詳細說明和從屬權(quán)利要求中進行了限定。
[0022] 附圖的簡要說明
[0023] 圖1是如何實施根據(jù)本發(fā)明的方法的示意圖。
[0024]圖2是顯示了實施例2.1獲得的結(jié)果的圖。
[0025]圖3是顯示了實施例2.2獲得的結(jié)果的圖。
[0026]發(fā)明優(yōu)選實施方式的詳細說明
[0027] 本發(fā)明人已經(jīng)確認了對于制備新的或發(fā)現(xiàn)存在的抗體來優(yōu)化檢測以避免現(xiàn)有技 術(shù)的缺陷，并保持與存在的檢測方法