專利名稱：尿路上皮癌的檢測用試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過測定對尿^各上皮癌的一企測或i貪斷有用的 CXCL1蛋白質(zhì)、或者編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達來檢測尿路上皮癌的 方法。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測尿路上皮癌的尿路上皮癌診斷用試 劑盒，其中含有能夠與上述蛋白質(zhì)或者基因結(jié)合的物質(zhì)。
背景技術(shù)：
所謂尿路上皮癌是指膀胱癌和腎盂癌、尿管癌等的總稱，上述癌 均由尿路的移行上皮細胞癌化產(chǎn)生， 一般認為其性質(zhì)是相同的。尿路 上皮癌是在泌尿生殖器癌中繼前列腺癌之后患病人數(shù)最多的癌癥，在 2001年的日本厚生勞動省大臣官房統(tǒng)計信息部"人口動態(tài)統(tǒng)計"中， 僅膀胱癌在日本每年的患病人數(shù)就多達男9765人、女3243人，死亡人 數(shù)多達男3459人、女1587人。腎盂癌、尿管癌相對較少，死亡人數(shù)男 女總計分別為797人、713人。
目前尚無關(guān)于膀胱癌或其它尿路上皮癌的預(yù)防的研究， 一般認為 膀胱癌多于50歲以上發(fā)病，男性的發(fā)病頻率是女性的2 3倍。另夕卜， 與不吸煙者相比，吸煙者的發(fā)病率高達其4倍左右。膀胱癌大致可分 成2種類型，淺表性乳頭狀癌是惡性度較低的癌，向膀胱內(nèi)腔(膀胱 的內(nèi)表面)突出，侵入較淺，表面呈乳頭狀(花椰菜樣)具有細小的 莖?？梢圆捎脙?nèi)窺鏡治療，但半數(shù)以上患者在膀胱內(nèi)復(fù)發(fā)。雖然癌的 深度有時也達到粘膜下，但未達到膀胱的肌肉層。與此相對，浸潤性 癌是惡性度高的癌，侵入深，具有浸潤至膀胱壁深部的傾向，有時發(fā) 生轉(zhuǎn)移。所以，必須采用切除膀胱、使用抗癌劑、放射療法等對機體 產(chǎn)生負擔(dān)的相關(guān)治療。膀胱癌癥狀中最常見無痛血尿，有時也存在排尿次數(shù)多、排尿時 疼痛、排尿后有余尿感等膀胱炎癥狀。診斷中可采用尿檢(細胞學(xué)診 斷)、X射線攝影、內(nèi)窺鏡等。但是，由于對早期診斷有用的可以在 血液或尿中使用的特異性、高靈敏度胂瘤標記物尚不存在，所以癌癥 多在發(fā)展之后通過檢查被發(fā)現(xiàn)。另外，在膀胱以外的部位發(fā)生的尿路 上皮癌也具有相同的性質(zhì)。因此，人們期待通過可用于尿路上皮癌、 特別是膀胱癌的特異性、高靈敏度腫瘤標記物進行簡便的檢查的方法 得以實用化。
已經(jīng)公開了用于膀胱癌的才企查和確定的多種標記物及方法。例如
可以舉出通過核磷蛋白(nucleophosmin ) / B23 (專利文獻l ) 、 HURP (專利文獻2) 、 CYP4B1或CYP4B2 (專利文獻3)等基因表達水平的 變化來確定膀胱癌的方法，通過尿樣中特定蛋白質(zhì)的存在或量來確定 膀胱癌的方法(專利文獻4、專利文獻5),以血液中可溶性Fas濃度 為指標確定膀胱癌的方法(專利文獻6)等。
專利文獻l:特開2004 - 337120
專利文獻2:特開2004- 248508
專利文獻3:特開2002 - 238599
專利文獻4:特開2004- 61288
專利文獻5:特開平7 - 309895號公報
專利文獻6:特開2000 - 13132
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于發(fā)現(xiàn)一種新型尿路上皮癌腫瘤標記物，并且提 供一種有效地檢測尿路上皮癌、特別是膀胱癌的方法。
本發(fā)明人等為了解決上述課題，經(jīng)潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以CXCL1 蛋白質(zhì)作為腫瘤標記物，通過使用與其特異性結(jié)合的抗體、或者能夠 與編碼該蛋白質(zhì)的基因、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或其cDNA結(jié)合的核酸，能夠有 意義地;險測出尿路上皮癌，從而完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明包含以下發(fā)明。(1) 一種檢測尿路上皮癌的方法，所述方法包括體外測定來自 受試者的生物試樣中的CXCL1蛋白質(zhì)、或編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達。
(2) 如(1 )所述的方法，其中，測定所述蛋白質(zhì)的量或所述基
因的表達量。
(3) 如(1 )或(2)所述的方法，其中，以所述蛋白質(zhì)的量或 所述基因的表達量與對照試樣的量相比顯著增加為指標。
(4) 如(3)所述的方法，其中，所述增加為2倍以上。
(5) 如(3)所述的方法，其中，所述增加為3倍以上。
(6) 如(1) ~ (5)中任一項所述的方法，其中，所述測定是 通過免疫學(xué)方法進行的測定。
(7) 如(1) ~ (5)中任一項所述的方法，其中，所述測定是 通過雜交進行的測定。
(8) 如(1) ~ (7)中任一項所述的方法，其中，所述測定是 使用能與所述蛋白質(zhì)或所述基因結(jié)合的物質(zhì)進行的。
(9) 如(8)所述的方法，其中，能夠與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì) 為抗體或其片段。
(10) 如(8)所述的方法，其中，能夠與所述基因結(jié)合的物質(zhì) 為核酸探針。
(11) 如(10)所述的方法，其中，所述核酸探針由下述成分構(gòu) 成由序列號l所示的堿基序列或其變異體構(gòu)成的核酸、由其互補序 列構(gòu)成的核酸、與上述核酸在嚴格條件下雜交的核酸、或含有上述核 酸的15個以上連續(xù)堿基的片段。
(12) 如(9) ~ ( 11 )中任一項所述的方法，其中，所述抗體 或核酸探針是被標記的。
(13) 如(1 ) ~ (6) 、 (8) 、 (9)及(12)中任一項所述的 方法，其中，使用與所述蛋白質(zhì)或其片段特異性結(jié)合的抗體或其片段， 采用免疫學(xué)方法測定試樣中的該蛋白質(zhì)，以該蛋白質(zhì)的量與對照試樣 的量相比增加為指標，；險測尿^各上皮癌。(14) 如(1) ~ (5) 、 (7)、 (8)、 (10)~(12)中任一 項所述的方法，其中，使用下述探針測定試樣中上述基因的表達量， 以與對照試樣的量相比該表達量的增加為指標，檢測尿路上皮癌，所 述探針由下述成分構(gòu)成由序列號l所示的堿基序列或其變異體構(gòu)成 的核酸、由其互補序列構(gòu)成的核酸、與上述核酸在嚴格條件下雜交的 核酸、或含有上述核酸的15個以上連續(xù)堿基的片段。
(15) 如(1) ~ ( 14)中任一項所述的方法，其中，所述尿路 上皮癌選自膀胱癌、腎盂癌、尿管癌及尿道癌。
(16) 如(1) ~ ( 15)中任一項所述的方法，其中，所述試樣 力血液、血漿、血清或尿。
(17) 如(1) ~ ( 15)中任一項所述的方法，其中，所述試樣 為尿路上皮組織或細胞。
(18) 如(1 ) ~ (6) 、 (8)、 (9)、 (12)、 (13)、 (15) ~ (17)中任一項所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)具有序列號2所示的
氨基酸序列或其變異體序列。
(19) 如(1 ) ~ (5) 、 (7)、 (8)、 (10)~(12)、 (14)~ (17)中任一項所述的方法，其中，所述基因具有序列號l所示的堿
基序列或其變異體序列。
(20) —種尿路上皮癌診斷用試劑盒，含有與CXCL1蛋白質(zhì)或其
片段特異性結(jié)合的抗體或其片段或它們的化學(xué)修飾衍生物。
(21 )如(20)所述的試劑盒，其中，所述蛋白質(zhì)具有序列號2 所示的氨基酸序列或其變異體序列。
(22) 如(20)或(21)所述的試劑盒，其中，所述蛋白質(zhì)的片 段含有由至少8個氨基酸構(gòu)成的表位。
(23) 如(20) ~ (22)中任一項所述的試劑盒，其中，所述尿 路上皮癌選自膀胱癌、腎盂癌、尿管癌及尿道癌。
(24) 如(20) ~ (23)中任一項所述的試劑盒，其中，所述抗 體或其片段與固相載體結(jié)合。
(25) 如(20) ~ (24)中任一項所述的試劑盒，其中，還含有能夠與所述抗體或其片段結(jié)合的標記第二抗體。
(26) 如(25)所述的試劑盒，其中，所述第二抗體的標記為酶、
焚光或》1射性標記。
(27) —種尿路上皮癌診斷用試劑盒，含有由序列號l所示的堿 基序列或其變異體序列構(gòu)成的核酸、由其互補序列構(gòu)成的核酸、與上 述核酸在嚴才各條件下雜交的核酸、或含有上述核酸的15個以上連續(xù)i威 基的片段、或它們的化學(xué)修飾衍生物。
(28) 如(27)所述的試劑盒，其中，所述核酸具有序列號l所 示的堿基序列或其變異體序列。
(29) 如(27)或(28)所述的試劑盒，其中，所述尿路上皮癌 選自膀胱癌、腎盂癌、尿管癌及尿道癌。
(30) 如(27) ~ (29)中任一項所述的試劑盒，其中，所述核 酸與固相載體結(jié)合。
(31 )如(30)所述的試劑盒，其中，所述固相載體為DNA芯片 或微陣列基板。
(32)上述(20) ~ (31)中任一項所述的試劑盒的使用方法， 用于體外檢測受試者的尿路上皮癌。
<用語定義〉
本說明書中1^吏用的用語具有以下定義。
核酸、核苷酸、多核苷酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)等用簡寫 符號的表示，符合"用于制作含有堿基序列或氨基酸序列的說明書等 的指南"(日本專利局編)及本技術(shù)領(lǐng)域的慣例。
本說明書中，所謂"CXCL1"(趨化因子(C-X-C基序)配體 1、 GRO-a、 GRO-1、黑素瘤生長刺激活性，a)蛋白質(zhì)，是指屬 于C - X - C趨化因子家族的由107個氨基酸殘基構(gòu)成的分子量約 1.1 kDa的蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)用作作為7-跨膜型受體的CXCR1及CXCR2 的配體，引起表達上述受體的嗜中性細胞、嗜堿細胞、肥大細胞等的 遷移(Richmond, A等、1988、 EMBOjoumal、第7巻、p.2025 - 712033 等)。另外，有報道指出此蛋白質(zhì)在人惡性黑素瘤中具有作為促細胞分裂因子的活性(Anisowicz， A等、1987、 Proceedings of the national Academy of Sciences, USA、第84巻、p.7188 — 7192)。
本說明書中，所謂"核酸"是指包括RNA及DNA中的任一種的核 酸。需要說明的是，上述DNA包括cDNA、基因組DNA及合成DNA中 的任一種。上述RNA包括總RNA、 mRNA、 rRNA、及合成RNA中的 任一種。另外，本說明書中核酸可以與多核苷酸互換使用。
在本說明書中，"cDNA"包括與基因表達生成的RNA互補的序列 的全長DNA鏈、及由其部分序列組成的DNA片段。cDNA可以通過以 RNA為模板，利用使用聚T引物的RT - PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)) 進行合成。
在本說明書中，"基因"不僅包括雙鏈DNA,還包括構(gòu)成雙鏈DNA 的正鏈(或有義鏈)或互補鏈(或反義鏈)等各單鏈DNA。另外，對 其長度無特別限定。所以，在本說明書中，在沒有特別說明的情況下， "基因，，是指包括人類基因組DNA在內(nèi)的雙鏈DNA、包括cDNA在內(nèi)的 單鏈DNA(正鏈)、具有與該正鏈互補的序列的單鏈DNA(互補鏈)、 及上述DNA的片段中的任一種。另外，該"基因，，不僅包括以特定的堿 基序列(或序列號)表示的"基因"，還包括編碼與由上述基因編碼的 蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能相同的蛋白質(zhì)的"基因，，，所述蛋白質(zhì)例如可以舉 出同源物(homolog)、剪接變體等變異體、及衍生物。作為編碼同 源物、變異體或衍生物的"基因"，具體可以舉出具有在后述的嚴格條 件下與序列號1所示堿基序列的互補序列雜交的堿基序列的"基因"。
例如，作為來自人的蛋白質(zhì)的同源物(homolog)或編碼該同源 物的基因，可以舉出與該蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的人基因?qū)?yīng)的來自 其它生物種的蛋白質(zhì)或基因，上述蛋白質(zhì)或基因同源物可以通過 HomoloGene ( http: 〃www.ncbi.nlm.nih.gov/homoloGene/)鑒定。具 體而言，可以將特定的人類氨基酸或石咸基序列代入BLAST程序 (BLAST program )( Karlin, S.等，Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A., 1993年，第90巻，p.5873 - 5877, http : 〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，得到一致(得分最高、E值為0且同一性顯示為100%)序列的登錄號(accession number )。作為BLAST 程序，已知有BLASTN (基因)、BLASTX (蛋白質(zhì))等。例如，進 行基因檢索時，將從上述BLAST檢索得到的登錄號輸入UniGene (http: 〃www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/), 4尋至'jUniGeneClusterlD( k乂 Hs.表示的編號)，將得到的UniGeneClusterID輸入HomoloGene。從 作為結(jié)果得到的表示其它生物種基因與人類基因的基因同源物的相 關(guān)性的列表中選擇其它生物種的基因作為與由特定堿基序列表示的 人類基因?qū)?yīng)的基因同源物。在該方法中，可以使用FASTA程序(http: 〃www,ddbj.nig.ac.jp/search/fasta - e,html)代替BLAST程序。
需要說明的是，對"基因"的功能區(qū)域沒有限定，例如可以包括表 達控制區(qū)域、編碼區(qū)域、外顯子或內(nèi)含子。
在本說明書中，"轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，，是指以基因的DNA序列為模板合成的 信使RNA(mRNA) 。 RNA聚合酶與位于基因上游的被稱為啟動子的 部位結(jié)合，使核糖核苷酸與3，末端結(jié)合，使其與DNA的堿基序列互補， 合成mRNA。該mRNA中不僅含有基因自身，還含有包括表達控制區(qū) 域、編碼區(qū)域、外顯子或內(nèi)含子在內(nèi)的從轉(zhuǎn)錄起點至聚A序列末端的 全長序列。
在本說明書中，"翻譯產(chǎn)物"表示無論轉(zhuǎn)錄合成的mRNA接受/不接 受剪接等修飾，都基于其信息而合成的蛋白質(zhì)。在mRNA的翻譯過程 中，首先，核糖體與信使RNA結(jié)合，然后，根據(jù)mRNA的堿基序列結(jié) 合氨基酸，從而合成蛋白質(zhì)。
本說明書中所謂"探針"包含為了特異性地檢測由基因表達生成 的RNA或來自該RNA的核酸而使用的核酸及/或與其互補的核酸。
在本說明書中，"引物"包括能特異性識別、擴增基因表達產(chǎn)生的 RNA或來自該RNA的核酸的連續(xù)核酸及/或與其互補的核酸。
此處，互補的核酸(互補鏈、反鏈)是指基于A: T(U) 、 G: C
其部分序列(此處，為了便于說明，將上述序列稱為正鏈)具有堿基 互補關(guān)系的核酸。其中，所述互補鏈不只限于與作為對象的正鏈的堿基序列完全互補的序列，也可以是具有能與作為對象的正鏈在嚴格條 件下雜交的互補性的序列。
在本說明書中，"嚴格條件"是指相對于探針與其它序列的雜交， 探針以可檢測性更大的程度(例如，比背景至少大2倍)與其靶序列 雜交的條件。嚴格條件具有序列依賴性，因進行雜交的環(huán)境的不同而 不同。通過控制雜交及/或清洗條件為嚴格條件，可以鑒定與探針I(yè)OO 0/o互補的耙序列。
在本說明書中，"變異體"為核酸時，是指起因于多態(tài)性、突變、 轉(zhuǎn)錄時的選擇剪接等的天然變異體、同源物、或以遺傳密碼的簡并為 基礎(chǔ)的變異體、或在序列號l表示的堿基序列或其部分序列中缺失、 置換、添加或插入l個以上、優(yōu)選l個或幾個堿基的變異體、或與該磁^
基序列或其部分序列具有約80 %以上、約85 %以上、優(yōu)選約90 %以上、 更優(yōu)選約95%以上、約97%以上、約98%以上、或約99%以上的同源
其部分序列的多核苷酸或寡核苷酸雜交的核酸，另一方面，變異體為 蛋白質(zhì)或肽時，是指在序列號2表示的氨基酸序列或其部分序列中缺 失、置換、添加或插入l個以上、優(yōu)選l個或幾個氨基酸的變異體、或 與該氨基酸序列或其部分序列具有約80%以上、約85%以上、優(yōu)選約 90%以上、更優(yōu)選約95%以上、約97%以上、約98%以上、或約99% 以上的同源性百分比的變異體。
在本說明書中，"數(shù)個"是指約IO、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3或2個以 下的整數(shù)。
在本說明書中，"同源性百分比，，可以使用諸如上述BLAST或 FASTA的蛋白質(zhì)或基因檢索系統(tǒng)，通過導(dǎo)入空位(gap)而進行確定 (Karlin, S.等,1993年，Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.,第90巻，p.5873 - 5877; Altschul， S.F.等，1990年，Journal of Molecular Biology,第215巻，p.403 —410; Pearson, W.R.等，1988年， Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.,第85巻，p.2444 —2448)。在本說明書中，"衍生物"為核酸時，是指通過熒光團、放射性同 位素等進行標記的衍生物、含有修飾核苷酸(例如，含有卣素、甲基 等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基團的核苷酸，生物素化 核苷酸，及進行了堿基的再構(gòu)建、雙鍵的飽和、脫氨基化、硫分子對 氧分子的取代等的核苷酸等)的衍生物等，另一方面，"衍生物"為蛋 白質(zhì)時，是指乙?；?、?；?、烷基化、磷酸化、硫酸化、糖基化、生 物素化/親和素化、標記化(例如酶、熒光團、發(fā)光物質(zhì)等標記的) 衍生物等化學(xué)修飾衍生物。
本說明書中，所謂"診斷(或檢測或確定)用試劑盒"，是指為 了診斷是否患有尿路上皮癌、患病程度或有無改善或改善程度，及為 了篩選對尿路上皮癌的預(yù)防、改善或治療有用的候選物質(zhì)，而直接或 間接使用的試劑盒。其中包含能夠特異性地識別、并結(jié)合下述基因的 核苷酸、寡核苷酸及多核苷酸，所述基因與尿路上皮癌的患病相關(guān)， 在生物體內(nèi)、特別是在尿路上皮組織內(nèi)的表達發(fā)生變化。上述寡核苷 酸及多核苷酸，基于上述性質(zhì)，可以有效地用作探針或引物，所述探 針用于檢測在生物體內(nèi)、組織或細胞內(nèi)等表達的上述基因，所述引物 用于擴增在生物體內(nèi)表達的上述基因。另外，其中還包含能夠檢測為 該基因翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的抗體。
本說明書中，所謂為檢測/診斷對象的"生物試樣"，是本發(fā)明的 蛋白質(zhì)及/或基因的表達隨尿路上皮癌的發(fā)展而發(fā)生變化的試樣(或 標本)，是從受試者采集的試樣。具體而言，該試樣包括尿路上皮組 織及其周邊淋巴結(jié)、還有懷疑發(fā)生轉(zhuǎn)移的其它臟器、血液、血清、血 漿、淋巴細胞培養(yǎng)上清液、尿、脊髓液、唾液、汗、腹水等體液、還 有細胞或臟器的提取物等。
本說明書中所謂"尿路上皮癌"，是指在腎盞、腎盂、尿管、膀 胱、尿道的移行上皮部發(fā)生的癌。作為尿路上皮癌的例子，例如可以 舉出膀胱癌、腎盂癌、尿管癌、尿道癌，本發(fā)明特別適用于膀胱癌的 檢測。
本說明書中所謂"受試者"，是指患有尿路上皮癌的動物，優(yōu)選哺乳動物，較優(yōu)選人。
本說明書中所謂"特異性"，是指只識別特定的蛋白質(zhì)或核酸、 或者僅與其結(jié)合或反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，能夠容易地且以較高可靠度地檢測尿路上皮癌。例 如，只需測定患者尿中的CXCLl濃度/肌酸肝濃度的比例，即可容易 地確定是否患有尿路上皮癌。本發(fā)明對浸潤性腫瘤的檢須'J特別有效。
本說明書包括為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請2005 -255370號說明書及/或附圖記載的內(nèi)容。


膀胱癌抹化細胞及正常尿路上皮細胞中CXCL1的通過RT -PCR測定的mRNA表達量比較。膀胱癌林化細胞及正常尿路上皮細胞的培養(yǎng)上清液中 CXCL1蛋白質(zhì)表達量。膀胱癌患者的尿中的CXCL1蛋白質(zhì)表達。膀胱癌患者的尿中的CXCL1蛋白質(zhì)表達量的測定。白圓圏表 示各數(shù)據(jù)的數(shù)值，平均值和標準差以+字表示。f表示危險率P〈 0.001,健康人(對照)和早期癌癥患者(Ta)之間有顯著差異。+ 表示危險率P〈0.01,早期癌癥患者和進行性癌癥患者(Tl以上)之 間有顯著差異。膀胱癌患者的組織中的CXCL1蛋白質(zhì)表達的免疫染色圖。進 行性癌(pT2G3)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中可見較強染色。與其相對，正常 尿路上皮組織(pTaGl)中未見染色。
具體實施例方式
本次，本發(fā)明人等通過細胞培養(yǎng)上清液的蛋白組分析(proteome analysis )篩選與正常尿路上皮細胞相比在來自膀胱癌患者的癌細胞中 表達增強的蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常尿路上皮細胞的培養(yǎng)上清液相 比在癌細胞的培養(yǎng)上清液中能夠較多地檢測出全長CXCL1蛋白質(zhì)。此處，所謂正常尿路上皮細胞，是指從未患有尿路上皮癌的腎切除患者 的正常尿管中獲得的上皮細胞。
另外，本發(fā)明人等采用免疫學(xué)方法測定膀胱癌患者在癌切除手術(shù) 前和手術(shù)后的血液及尿中CXCL1蛋白質(zhì)的量時，發(fā)現(xiàn)與膀胱癌切除后
相比在膀胱癌切除前的患者的血液及尿中能夠高度地檢測到CXCL1 蛋白質(zhì)。
進而，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，回收在來自膀胱癌患者的細胞和正常尿 路上皮細胞中表達的總RNA,采用DNA陣列法及定量PCR法測定編碼 該總RNA中的CXCL1基因的表達量，與正常細胞相比，在來自膀胱癌 患者的細胞中編碼CXCL1的mRNA量增加。
因此，本發(fā)明的方案之一，提供一種檢測尿路上皮癌的方法，所 述方法包括體外測定來自受試者的生物試樣中的CXCL1蛋白質(zhì)、或編 碼該蛋白質(zhì)的基因的表達。
一般情況下，本發(fā)明的方法中測定生物試樣中上述蛋白質(zhì)的存在 或存在量、或者上述基因的表達或表達量。此處，本發(fā)明的耙蛋白質(zhì) 或基因也包含由依賴受試者的種類(例如人種)或個體的多態(tài)性、剪 接變異等引起的變異體。上述蛋白質(zhì)的存在或量、或者基因的表達或 表達量可以使用能夠與該蛋白質(zhì)或基因特異性結(jié)合的物質(zhì)進行測定。 上述物質(zhì)包括如下所述的抗體、核酸探針等。
本發(fā)明中可以使用的抗體是識別CXCL1蛋白質(zhì)(優(yōu)選具有序列號 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì))并與其特異性結(jié)合的抗體或其片段或者化 學(xué)修飾衍生物(定義如上)?？贵w包括多克隆抗體、單克隆抗體、或 抗體片段、例如Fab、 Fab，、 F ( ab， ) 2、 Fv、 ScFv等。本發(fā)明的抗體 是針對由上述蛋白質(zhì)的至少5個、優(yōu)選至少8個氨基酸構(gòu)成的1或多個 表位的抗體。特異性的多克隆抗體可以通過如下方法制備，例如，使 CXCL1蛋白質(zhì)免疫的兔等的抗血清通過CXCL1蛋白質(zhì)與瓊脂糖等載 體結(jié)合的柱，回收與柱載體結(jié)合的IgG抗體。單克隆抗體可以通過下 述方法獲得。
本發(fā)明中可以使用的核酸探針包括由序列號1表示的堿基序列或其變異體序列構(gòu)成的核酸、由其互補序列構(gòu)成的核酸、與上述核酸 在嚴格條件下雜交的核酸、或含有上述核酸的15個以上連續(xù)堿基的片 段、或它們的化學(xué)修飾衍生物(定義如上)。
本發(fā)明的方法中，通過其實施方案，測定來自受試者的生物試樣 中的上述蛋白質(zhì)的存在量或上述基因的表達量。該蛋白質(zhì)的量或基因 的表達量與對照試樣中的量相比顯著增加時，可確定受試者患有尿路 上皮癌。此處，對照試樣是來自例如正?；蚪】档膫€體、或者無尿路 上皮癌的個體的對應(yīng)的試樣，例如血液、尿等體液，尿路上皮組織或 細胞等。特別是對于組織或細胞，利用常用方法從上述試樣中回收
mRNA，確定通過定量RT-PCR法生成、擴增的cDNA量(其與靶基 因的表達量對應(yīng)。)，或者培養(yǎng)該細胞，測定其培養(yǎng)上清液中的CXCL1 蛋白質(zhì)的濃度。
相對于對照試樣的增加率通常為2倍以上、優(yōu)選3倍以上、較優(yōu)選 4倍以上、最優(yōu)選5倍以上。增加率為3倍以上時可靠度升高。增加的
以某種校正物質(zhì)(例如肌酸酐等)的量為基準，根據(jù)與該基準的相對 值進行比較而確定。
作為尿路上皮癌，如上述定義所述，包括例如膀胱癌、腎盂癌、 尿管癌、尿道癌等。特別是在膀胱癌的檢測中，與淺表性腫瘤相比， 浸潤性胂瘤的癌檢測可靠性顯著升高。因此，可推測本發(fā)明對于尿路 上皮癌中易于發(fā)生轉(zhuǎn)移的浸潤性胂瘤的檢測也是有效的。
如上所述，本發(fā)明的尿路上皮癌的檢測方法包括使用引物或探 針測定試樣中來自編碼由尿路上皮癌細胞產(chǎn)生的CXCL1蛋白質(zhì)的基 因的核酸的表達量、或使用抗體采用免疫學(xué)方法測定由尿路上皮癌細 胞產(chǎn)生的、試樣中的CXCL1蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，不僅能夠確 定受試者是否患有尿路上皮癌，而且能夠區(qū)別尿路上皮癌患者和非尿 路上皮癌患者。并且，還可以根據(jù)本發(fā)明的方法，通過對試樣中來自 編碼CXCL1蛋白質(zhì)的基因的核酸的表達量或CXCL1蛋白質(zhì)進行定量， 也能夠確定尿路上皮癌的進展程度。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，本發(fā)明提供 一 種通過使用與上述CXCL 1 蛋白質(zhì)或其片段特異性結(jié)合的抗體或其片段，采用免疫學(xué)方法定量試
樣中的CXCL1蛋白質(zhì)，來檢測以膀胱癌為代表的尿路上皮癌的方法。 或者，根據(jù)其它實施方案，本發(fā)明提供一種使用由編碼CXCL1蛋 白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成的核酸、由與其互補的序列構(gòu)成的核酸、與上述 核酸在嚴格條件下雜交的核酸、或者上述核酸的15個堿基以上的片 段，測定試樣中編碼CXCL1蛋白質(zhì)的基因的表達量，由此檢測以膀胱 癌為代表的尿路上皮癌的方法。 〈CXCL1基因的檢測〉
本發(fā)明中，作為尿路上皮癌的檢測方法之一，可以舉出使用核酸 作為引物或探針，測定試樣中編碼由尿路上皮癌細胞產(chǎn)生的CXCL1 蛋白質(zhì)的基因的表達量的方法。
本發(fā)明中，可用于確定尿路上皮癌的存在及/或不存在、或者可 用于診斷尿路上皮癌的核酸，能夠定性地及/或定量地測定來自人的 CXCL1基因、其同源物、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或cDNA、或者其變異體或衍生 物的存在、表達水平或存在量。
CXCL1基因，與非癌組織相比在尿路上皮癌組織中其表達水平顯 著增加。因此，本發(fā)明的組合物能夠有效地用于測定、比較非癌組織 和尿路上皮癌組織中CXCL1基因的表達水平。
可以用于本發(fā)明的核酸包含選自下述核酸中的1種或多種核酸的
組合，所述核酸有在患有尿路上皮癌的患者的生物組織中含有序列 號1表示的堿基序列的核酸及其互補核酸；與DNA在嚴格條件下分別 雜交的核酸及其互補核酸，所述DNA由與上述堿基序列互補的堿基序 列構(gòu)成；及含有上述核酸組的堿基序列中15個以上連續(xù)堿基的核酸組。
上述多核苷酸的片段可以含有各核酸的堿基序列中的例如下述 范圍的連續(xù)堿基數(shù)，但并不限定于此，所述范圍包括15 序列的全部 堿基數(shù)、15~ 300個堿基、15~ 250個堿基、15~ 200個堿基、15 ~ 150 個堿基、15~140個堿基、15~130個堿基、15~120個堿基、15 ~ 110個堿基、15~100個堿基、15~90個堿基、15~80個堿基、15~70個 堿基、15~60個堿基、15~50個堿基、15~40個堿基、15~30個堿基 或15 25堿基；25 序列的全部堿基數(shù)、25~ 300個堿基、25 ~ 250個 堿基、25~ 200個石威基、25 150個石威基、25 140個石咸基、25~130個 堿基、25~120個堿基、25~110個堿基、25~100個堿基、25 ~ 90個 堿基、25~80個堿基、25~70個堿基、25~60個堿基、25 ~ 50個堿基 或25 40個石威基；50 序歹'J的全部石威基凄史、50~ 300個石威基、50 — 250 個堿基、50~ 200個堿基、50~150個堿基、50~140個堿基、50-130 個堿基、50~120個堿基、50~110個堿基、50~100個堿基、50 ~ 90 個堿基、50~80個堿基、50~70個堿基或50~60個堿基；60 序歹'J的 全部堿基數(shù)、60~ 300個堿基、60~ 250個堿基、60~200個堿基、60 ~ 150個石咸基、60- 140個石威基、60~130個石咸基、60 120個》威基、60 ~ l齡堿基、60~100個堿基、60~90個堿基、60~ 80個堿基或60~ 70 個堿基等。
本發(fā)明中使用的上迷核酸或其片段均可為DNA,也可以為RNA。 在本發(fā)明的組合物中使用的核酸可以使用DNA重組技術(shù)、PCR
DNA重組技術(shù)及PCR法可以使用例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, US ( 1993 ); Sambrook等,Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US ( 1989)等中記載的技術(shù)。
另外，本發(fā)明還提供一種尿路上皮癌診斷(檢測)用試劑盒，所 述試劑盒包含上述方法中可以用作探針(及、根據(jù)情況用作引物) 的核酸、其變異體及/或其片段中的l種或多種。
本發(fā)明的試劑盒，優(yōu)選含有選自上述記載的核酸中的l種或多種 核酸或其片段。
本發(fā)明的試劑盒可以包含含有序列號1表示的堿基序列的核酸、 含有其互補序列的核酸、與上述核酸在嚴格條件下雜交的核酸、或上 述核酸的片段中的至少l種。優(yōu)選實施方案中，上述核酸為由序列號l所示的堿基序列構(gòu)成的 核酸、由其互補序列構(gòu)成的核酸、與上述核酸在嚴格條件下雜交的核 酸、或含有上述核酸的15個以上連續(xù)堿基的片段。
優(yōu)選實施方案中，上述片段可以為含有15個以上、優(yōu)選30個以上、 優(yōu)選50個以上、優(yōu)選60個以上、例如50~ 100個連續(xù)i咸基的核酸。
構(gòu)成本發(fā)明試劑盒的上述組合舉例給出的僅為例示，其它多種可 能的組合全部包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明的試劑盒中所含的核酸、其變異體或其片段可以單獨地或 以任意組合被包裝在不同的容器中。
本發(fā)明的試劑盒中所含的作為探針的核酸，可以與固相載體結(jié) 合。載體可以包括例如DNA微陣列、DNA芯片等基板。即、含有上述 核酸的DNA微陣列或DNA芯片均屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
能一皮固定化的核酸是如上所述的本發(fā)明的全部核酸。例如，上述 核酸可以含有以下l個或多個核酸或其片段。
由序列號l所示的堿基序列構(gòu)成的核酸、其變異體、或含有15 個以上連續(xù)堿基的上述核酸的片段。
含有序列號l所示堿基序列的核酸。
.與下述DNA在嚴格條件下雜交的核酸、或含有15個以上連續(xù)堿 基的片段，所述DNA由與序列號1所示堿基序列互補的堿基序列構(gòu)成。
與由序列號1所示堿基序列構(gòu)成的DN A在嚴格條件下雜交的核 酸、或含有15個以上連續(xù)堿基的片段。
連續(xù)堿基的核酸。
本發(fā)明中，固定化的核酸可以為基因組DNA、 cDNA、 RNA、合 成DNA、合成RNA中的任一種，可以為單鏈或雙鏈。
作為能夠檢測、測定靶基因、RNA或cDNA的表達水平的DNA芯 片的例子，可以舉出Affymetrix7>司的Gene Chip Human Genome Ul33 Plus 2.0 Array, Agilent公司的Whole human genome oligo microarray、 Takara Bio乂/^司的IntelliGene ( R) HS Human Expression CHIP等。DNA微陣列的制備例如可以使用在固相表面固定預(yù)先制備的探
針的方法。在固相表面固定預(yù)先制備的核酸探針的方法如下合成導(dǎo) 入了官能團的核酸，在經(jīng)過表面處理的固相載體表面上點樣寡核香酸 或多核苷酸，使其共價4建合(例如、J.B丄amture等、Nucleic. Acids. Research、 1994年，第22巻，p.2121 - 2125, Z.Guo等、Nucleic. Acids. Research, 1994年，第22巻，p.5456 - 5465 )。核酸通常通過間隔臂 (spacer)或交聯(lián)劑(crosslinker )與經(jīng)過表面處理的固相載體共<介4建 合。還已知使聚丙烯酰胺凝膠的微小片排列在玻璃表面上，使合成核 酸與其共價鍵合的方法(G.Yershov等、Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.、 1996年，第94巻，p.4913)。還已知下述方 法在二氧化硅微陣列上制作微電極的陣列，在電極上設(shè)置含有鏈霉 抗生物素蛋白的瓊脂糖的滲透層，形成反應(yīng)部位，通過^^該部位帶正 電，固定生物素化多核苷酸，通過控制該部位的電荷，能高速且嚴格 地進行雜交(R.G.Sosnowski等、Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.、 1997年，第94巻，p.l 119 - 1123 )。
作為DNA芯片的基板，只要是能夠?qū)NA固定化的基板即可，沒 有特別限定，可以舉出載玻片、硅制芯片、聚合物制芯片及尼龍膜等。 另外，可以對上述基板進行聚L-賴氨酸涂布或?qū)氚被?、羧基等官?團等的表面處理。
另外，固定化法只要是通常使用的方法即可，沒有特別限定，可 以舉出以下方法使用被稱為點樣器(spotter )或陣列點樣儀(array er ) 的高密度分液器點樣DNA的方法、或使用通過壓電元件等從噴嘴噴射 微量的液滴的裝置(噴墨)將DNA噴射到基板上的方法、或在基板上 依次進行核苷酸合成的方法。使用高密度分液器時，例如如下進行固 定化在具有多個孔的平板的各孔中裝入不同的基因溶液，用針取出 該溶液，然后依次點到基板上。使用噴墨法時，如下進行固定化從 噴嘴噴射基因，將基因高速地排列在基板上。在基板上合成DNA時， 如下進行固定化用能在光的作用下離去的官能團保護與基板結(jié)合的 堿基，通過使用掩模只對特定部位的堿基曝光，使官能團離去。然后，反復(fù)進行向反應(yīng)液中加入堿基、使其與基板上的堿基偶聯(lián)的步驟。
雜交條件沒有限定，例如，包括在30。C 5(TC下，在3 4xSSC、 0.1 0.5。/oSDS中雜交l 24小時，較優(yōu)選在40。C 45。C下，在3.4xSSC、 0.3WSDS中雜交1 24小時，然后進行清洗。作為清洗條件，例如可以 舉出利用含有2xSSC禾口0.1 。/oSDS的溶液、及l(fā)xSSC溶液、0.2xSSC溶 液在室溫下連續(xù)清洗等的條件。此處，lxSSC是含有150mM氯化鈉及 15mM檸檬酸鈉的水溶液(pH7.2)?；パa鏈優(yōu)選為即使在上述條件下 進行清洗仍能保持與作為對象的正鏈雜交的狀態(tài)的鏈。作為上述互補 鏈，具體可以舉出由與作為對象的正鏈的堿基序列具有完全互補關(guān)系 的堿基序列組成的鏈、以及由與該鏈具有至少80 %同源性的堿基序列 組成的鏈。
作為以本發(fā)明試劑盒的多核苷酸片段為引物進行PCR時的嚴格的 雜交條件的例子，例如可以舉出使用組成為10mM Tris - HCL (pH8.3) 、 50mMKCl、 1 2mMMgCl2等的PCR緩沖液，在由該引物 序列計算的熔解溫度(Tm) - 5 10。C下處理15秒 l分鐘左右等。作 為上述Tm的計算方法，可以舉出Tm-2x (腺嘌呤殘基數(shù)+胸腺嘧啶 殘基數(shù))+4x (鳥嘌呤殘基數(shù)+胞嘧啶殘基數(shù))等。
上述雜交的"嚴才各條件"的其它例子，記載于例如Sambrook， J.& Russel， D.著，Molecular Cloning， A LABORATORY MANUAL、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 2001年1月15日出版，第1巻7.42 7.45， 第2巻8.9 8.17等中，可以在本發(fā)明中使用。
〈CXCLl蛋白質(zhì)的^r測〉
作為本發(fā)明涉及的尿^各上皮癌的其它4全測方法，可以舉出^f吏用抗 體，測定試樣中由尿路上皮癌細胞產(chǎn)生的CXCL1蛋白質(zhì)的存在或量的 方法。
本發(fā)明中，可用于確定尿路上皮癌的存在及/或不存在、或者可 用于診斷尿路上皮癌的抗體，可以定性地及/或定量地測定來自人的 CXCL1基因的翻譯產(chǎn)物、其同源物、或者其變異體或衍生物的表達水平或存在量。
作為本發(fā)明中能夠使用的抗體，只要為能夠與CXCL1蛋白質(zhì)或其 片段特異性結(jié)合的抗體即可，沒有特殊的限定，可以使用單克隆抗體 或多克隆抗體，但優(yōu)選使用單克隆抗體。本發(fā)明的抗體的球蛋白類型，
只要是具有上述特征的類型即可，沒有特殊的限定，可以為IgG、 IgM、 IgA、 IgE、 IgD中的任一種，優(yōu)選IgG及IgM。例如，作為單克隆抗體， 可以使用20326.1 ( abl0375、 Abcam社)等，多克隆抗體也可以從Abcam 社等購買。另外，與CXCL1蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體，也可以根據(jù)下 述方法制備。
免疫原的制備
本發(fā)明中制備抗體時，制備用于作為免疫原(抗原)的蛋白質(zhì)。 使用CXCL1蛋白質(zhì)或其片段作為免疫原蛋白質(zhì)。本發(fā)明中可以作為免 疫原使用的CXCL1蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列號2)及編碼該蛋白質(zhì) 的cDNA序列(序列號l),在GenBank中分別以登錄號NP — 001502、 NM-001511公開。所以，可以利用7〉開的氨基酸序列信息，通過本 技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法、例如固相肽合成法等，合成用于用作免疫原 的CXCL1蛋白質(zhì)片段。作為免疫原使用CXCL1蛋白質(zhì)片段時，優(yōu)選使 其與KLH、 BSA等載體蛋白質(zhì)連接進行使用。
另夕卜，CXCL1蛋白質(zhì)能夠使用編碼CXCL1蛋白質(zhì)的cDNA的信息、 利用公知的DNA重組技術(shù)獲得。編碼CXCL1蛋白質(zhì)的cDNA可以采用 cDNA克隆法制備。從表達本發(fā)明中作為靶標的CXCL1基因的單核細 胞、黑素瘤細胞、呼吸道上皮細胞、角質(zhì)形成細胞、肺泡巨噬細胞等 生物組織中提取總RNA,將所得的總RNA用寡dT纖維素柱處理得到聚 A ( + ) RNA,采用RT-PCR法由所得的聚A ( + ) RNA制備cDNA 文庫，通過雜交篩選、表達篩選、抗體篩選等篩選方法，可以從此文 庫中得到目的cDNA克隆。必要時，也可以采用PCR法擴增cDNA克隆。 探針或引物可以以序列號1所示的堿基序列為基礎(chǔ)，從15 ~ 1 OO個連續(xù) 堿基的序列中選擇、合成。cDNA克隆技術(shù)，記載于例如Sambrook， J. &Russel, D.著，Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 2001年1月15日發(fā)4亍的第1巻7.42 ~ 7.45、第2巻8.9~8.17。
CXCL1蛋白質(zhì)可以如下獲得，例如將如上所述得到的cDNA克隆 整合到表達載體中，通過培養(yǎng)由該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主 細胞，從該細胞或培養(yǎng)上清液得到CXCL1蛋白質(zhì)。作為表達載體，可 以舉出來自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如pET21a、 pGEX4T、 pC118、 pC119、 pC18、 pC19等)、來自枯草桿菌的質(zhì)粒(例如pUB110、 pTP5等)、 來自酵母的質(zhì)粒(例如YEpl3、 YEp24、 YCp50等)等，作為噬菌體 DNA,可以舉出X噬菌體(X gtll、 XZAP等)。并且，也可以使用痘 苗病毒等動物病毒載體、桿狀病毒等昆蟲病毒載體。載體及表達體系
可以從Novagen社、寶酒造、第一化學(xué)藥品、Qiagen社、Stratagene社、 Promega社、Roche Diagnositics社、Invitrogen社、Genetics Institute社、 Amersham Bioscience社等購入。
為了將CXCLl的cDNA插入載體中，可以采用首先將純化的DNA 用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛?，插入到適當(dāng)載體的限制酶切位點或多克隆位點 中，與載體連接的方法等。載體中除編碼該蛋白質(zhì)的DNA之外，還包 含調(diào)節(jié)元件，例如啟動子、增強子、聚腺苷酸化信號、核糖體結(jié)合部 位、復(fù)制起點、終止子、選擇標記物等。另外，為了容易進行多肽的 純化，可以將多肽制成在多肽的C末端或N末端結(jié)合了標記肽的融合 多肽。作為代表性的標記肽，可以舉出6~10個殘基的組氨酸重復(fù)序列、 FLAG、 myc肽、GFP蛋白質(zhì)等，但標記肽并不限定于此。另外，DNA 重組技術(shù)記載于Sambrook， J.&Russel, D.(上述)。為了連接DNA 片段和載體片段，使用公知的DNA連接酶。
作為宿主細胞，可以使用細菌等原核細胞(例如大腸桿菌、枯草 桿菌)、酵母(例如釀酒酵母)、昆蟲細胞(例如Sf細胞)、哺乳動 物細胞(例如COS、 CHO、 BHK)等。向宿主細胞中導(dǎo)入重組載體的 方法，只要是向各宿主中導(dǎo)入DNA的方法即可，沒有特殊的限定，例 如可以舉出使用4丐離子的方法、使用脂質(zhì)體的方法、電穿孔法、微注
23射法等。
作為培養(yǎng)以大腸桿菌或酵母菌等微生物作為宿主得到的轉(zhuǎn)化體 的培養(yǎng)基，只要為含有微生物能同化的碳源、氮源、無機鹽類等、并 且能夠有效地進行轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可，可以為天然培養(yǎng)基、合 成培養(yǎng)基中的任一種。通常情況下在振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等需氧
條件下、在37。C下培養(yǎng)6 24小時。培養(yǎng)期間，pH保持在中性左右。 pH的調(diào)整使用無機或有機酸、堿溶液等進行。培養(yǎng)中，根據(jù)需要可以 向培養(yǎng)基中添加氨千青霉素或四環(huán)素等抗生素。培養(yǎng)哺乳動物細胞等 的轉(zhuǎn)化體時，在適合各細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，回收在培養(yǎng)上清液或 細胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。此時，培養(yǎng)基中可以含有血清，也可以不含， 但在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)較理想。在菌體內(nèi)或細胞內(nèi)產(chǎn)生CXCL1蛋白 質(zhì)時，通過破碎菌體或細胞提取蛋白質(zhì)。另外，在菌體外或細胞外產(chǎn) 生CXCL1蛋白質(zhì)時，可以直接使用培養(yǎng)液，或通過離心分離等除去菌 體或細胞。
在不結(jié)合標記肽的狀態(tài)下制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，作為其純化方 法，例如可以舉出超濾、鹽析、凝膠過濾、離子交換色譜法等方法。 除此之外，也可以采用組合親和色譜、HPLC、疏水性色譜、等電點 色譜等的方法。另 一方面，在該蛋白質(zhì)上結(jié)合組氨酸重復(fù)序列、FLAG、 myc、 GFP等標記肽時，可以舉出適合通常使用的各種標記肽的親和 色語法?？梢詷?gòu)建能容易分離、純化的表達載體。特別是構(gòu)建能以多 肽和標記肽的融合蛋白質(zhì)的狀態(tài)進行表達的表達載體，利用基因工程 技術(shù)制備該蛋白質(zhì)時，也可容易地進行分離、精制?？梢酝ㄟ^SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等確認是否得到CXCL1蛋白質(zhì)。
識別如上所述得到的蛋白質(zhì)的抗體，能夠通過抗體的抗原結(jié)合部 位，與該蛋白質(zhì)特異地結(jié)合。具體而言，CXCL1蛋白質(zhì)或其片段、其 變異體蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)等可以分別用作免疫原，所述免疫原用于 產(chǎn)生具有免疫反應(yīng)性的抗體。
更具體而言，蛋白質(zhì)、片段、變異體、融合蛋白質(zhì)等含有促使抗
體形成的抗原決定簇或表位，上述抗原決定簇或表位可以是直鏈，也可以是較高級結(jié)構(gòu)(斷開)。需要說明的是，該抗原決定簇或表位可 以通過本領(lǐng)域公知的所有方法進行鑒定。
通過本發(fā)明的蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)產(chǎn)生所有狀態(tài)的抗體。如果分離該蛋 白質(zhì)的全部或 一部分或表位，那么使用常規(guī)技術(shù)即可制備多克隆抗體
及單克隆抗體中的任一種。方法例如包括Kennet等(主編)，Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, 1980中舉出的方法。
接下來，將所得的蛋白質(zhì)溶解于緩沖液中制備免疫原。需要說明 的是，必要時，為了有效地進行免疫可以添加佐劑。作為佐劑，可以 舉出市售的完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、氫氧化鋁(明礬)、胞 壁酰肽等，也可以將上述佐劑混合使用。
單克隆抗體的制備
(1 )免疫及抗體產(chǎn)生細胞的采集
對哺乳動物例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/c)、兔等給 予上述所得的免疫原。免疫原的1次給藥量可以根據(jù)免疫動物種類、 給藥途徑等適當(dāng)確定，每1只動物給藥約50~200嗎。主要通過在皮下、 腹腔內(nèi)注入免疫原進行免疫。另外，免疫的間隔沒有特別限定，初次 免疫后，間隔數(shù)日至數(shù)周，優(yōu)選間隔1 4周，進行2 10次、優(yōu)選3 4 次加強免疫。初次免疫后，利用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)法等反 復(fù)測定免疫動物血清中的抗體值，抗體值達到平臺時，向靜脈內(nèi)或腹 腔內(nèi)注射免疫原，進行最終免疫。從最終免疫日起2 5日后，優(yōu)選3日 后，采集抗體產(chǎn)生細胞。作為抗體產(chǎn)生細胞，可以舉出脾細胞、淋巴 結(jié)細胞、外周血細胞等，優(yōu)選脾細胞或局部淋巴結(jié)細胞。
(2)纟田月包融合
另外，根據(jù)本發(fā)明，還能夠提供一種可產(chǎn)生對各蛋白質(zhì)特異性的 單克隆抗體的雜交瘤細胞抹。該雜交瘤可以通過常規(guī)技術(shù)進行生產(chǎn)并 鑒定。用于生產(chǎn)該雜交瘤細胞林的方法之一包括用本發(fā)明的蛋白質(zhì)免 疫動物，從被免疫的動物中采集脾細胞，使該脾細胞與骨髓瘤細胞株融合，由此生成雜交瘤細胞，鑒定能夠產(chǎn)生與該酶結(jié)合的單克隆抗體 的雜交瘤細胞抹。作為與抗體產(chǎn)生細胞融合的骨髓瘤細胞抹，可以使 用通常能購買到的小鼠等動物的細胞抹。作為使用的細胞抹，優(yōu)選具 有下述性質(zhì)的細胞林，即具有藥劑選擇性，并具有在未融合狀態(tài)下在 HAT選擇培養(yǎng)基(含有次黃噤呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)中不能存活， 只有在與抗體產(chǎn)生細胞融合的狀態(tài)下能存活的性質(zhì)。細胞抹優(yōu)選來自 與免疫動物同種系的動物的細胞。作為骨髓瘤細胞林的具體例子，可
以舉出來自BALB/c小鼠的次黃。票呤 鳥嘌呤 磷酸核糖基.轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT)缺陷細胞抹P3X63-Ag.8林(ATCC TIB9 )等。
接下來使上述骨髓瘤細胞抹與抗體產(chǎn)生細胞進行細胞融合。細胞 融合如下進行在不含有血清的DMEM、 RPMI- 1640培養(yǎng)基等動物 細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，以約1: 1 20: 1的比例混合抗體產(chǎn)生細胞和 骨髓瘤細胞抹，在細胞融合促進劑的存在下進行融合反應(yīng)。作為細胞 融合促進劑，可以使用濃度約為10 80%、平均分子量為1500 4000 道爾頓的聚乙二醇等。另外，視情況的不同，為了提高融合效率，可 以并用二甲基亞砜等輔助劑。還可以使用利用電刺激(例如電穿孔)
的市售的細胞融合裝置使抗體產(chǎn)生細胞和骨髓瘤細胞株融合。 (3)雜交瘤的篩選及克隆
從細胞融合處理后的細胞中篩選目標雜交瘤。作為篩選方法，使 用例如含有胎牛血清的RPMI - 1640培養(yǎng)基等適當(dāng)稀釋細胞懸浮液 后，以約200萬個細胞/孔接種到微孔板上，向各孔中加入選擇培養(yǎng)基， 并在以后適當(dāng)更換選擇培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為20 40。C、優(yōu) 選為約37。C。骨髓瘤細胞是HGPRT缺陷抹或胸苷激酶缺陷抹時，通過 使用含有次黃嘌呤 氨基蝶呤 胸腺嘧啶核苷的選擇培養(yǎng)基(HAT培 養(yǎng)基)，能夠僅選擇性培養(yǎng)、增殖具有抗體產(chǎn)生能力的細胞與骨髓瘤 細胞抹的雜交瘤。結(jié)果在用選擇性培養(yǎng)基開始培養(yǎng)后，生長約14天左 右的細胞可以作為雜交瘤被得到。
接下來，在進行了增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清液中對是否存在目標 抗體進行篩選。雜交瘤的篩選可以按照常規(guī)方法進行，沒有特別限定。例如，采集作為雜交瘤培養(yǎng)的包含在孔中的培養(yǎng)上清液的一部分，通
過酶免疫測定法(EIA: Enzyme Immuno Assay、及ELISA )、》文射免 疫測定法(RIA: Radio Immuno Assay)等進行篩選。融合細胞的克 隆通過極限稀釋法等進行，從而最終確立產(chǎn)生單克隆抗體的細胞即雜 交瘤。本發(fā)明的雜交瘤如后所述，在RPMI- 1640、 DMEM等基本培 養(yǎng)基中的培養(yǎng)穩(wěn)定，并能產(chǎn)生、分泌與來自尿路上皮癌的CXCL1蛋白 質(zhì)特異性反應(yīng)的單克隆抗體。 (4)抗體的回收
單克隆抗體可以利用常規(guī)技術(shù)進行回收。即，作為從確立的雜交 瘤中采集單克隆抗體的方法，可以采用通常的細胞培養(yǎng)法或腹水形成
法等。采用細胞培養(yǎng)法時，在通常的培養(yǎng)條件(例如，37°C、 5%C02 濃度)下，在含有10。/。胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基 或無血清培養(yǎng)基等動物細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤2 10日，從該培養(yǎng)上 清液中獲得抗體。采用腹水形成法的情況下，向與提供骨髓瘤細胞的 哺乳動物同種系的動物的腹腔內(nèi)給予約1 OOO萬個雜交瘤，^f吏雜交瘤大 量增殖。并在1 2周后采集腹水或血清。
對于上述抗體的采集方法，在需要純化抗體的情況下，可以通過 適當(dāng)選擇硫酸銨鹽析法、離子交換色譜法、親和色譜法、凝膠色譜法 等公知的方法，或組合使用上述方法，得到純化的本發(fā)明的單克隆抗 體。
本發(fā)明的單克隆抗體包括嵌合抗體，例如小鼠單克隆抗體的人源 化類型。另外，根據(jù)本發(fā)明，也可以提供上述抗體的抗原結(jié)合片段。 可采用常用技術(shù)產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段的例子包括Fab及F ( ab') 2片段， 但并不限定于此。本發(fā)明還提供了可采用基因工程學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的抗體 片段及衍生物。本發(fā)明的抗體可以采用體外及體內(nèi)任一種方式在用于 檢測本發(fā)明多肽或其(多)肽片段的存在的分析中使用。另外，本發(fā) 明的抗體可以用于采用免疫親和層析法純化蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。 多克隆抗體的制備
制備多克隆抗體時，與上述相同地免疫動物，從最終免疫曰起6 60天后，利用酶免疫測定法(EIA及ELISA )、放射免疫測定法(RIA ) 等測定抗體值，在顯示最大抗體值的當(dāng)天采血，得到抗血清。然后， 利用ELISA法等測定抗血清中的多克隆抗體的反應(yīng)性。
<斗全測法〉
測定法、或測定編碼CXCL1蛋白質(zhì)的基因的表達量的方法中的任一種 方法。
作為免疫學(xué)測定法，例如可以舉出酶免疫測定法(ELISA、 EIA)、 熒光免疫測定法、放射免疫測定法(RIA)、發(fā)光免疫測定法、免疫 比濁法、乳膠凝集反應(yīng)、乳膠比濁法、紅血球凝集反應(yīng)、粒子凝集反 應(yīng)或蛋白質(zhì)印跡法。
作為測定來自基因的核酸的表達量的方法，可以舉出定量RT -PCR法、DNA陣列法、RNA印跡法、RNA雜交法、DNA印跡法、DNA 雜交法等。
作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)檢測方法中成為被檢對象的試樣，只要是可 能含有來自尿路上皮癌的CXCL1蛋白質(zhì)、或含有來自編碼該蛋白質(zhì)的 基因的核酸的生物試樣即可，沒有特殊的限定。特別指出的是，尿、 血液、血漿、血清之類的體液試樣中得到的CXCL1蛋白質(zhì)的測定值， 作為尿路上皮癌的指標是有用的。如上所述，本發(fā)明的尿路上皮癌的 才企測方法，不僅可以在癌組織中#企測尿路上皮癌，也可以在血液或尿 中檢測尿路上皮癌，因此作為簡便的檢測法非常有用。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)檢測方法通過酶免疫測定法、熒光免疫測定法、 放射免疫測定法或發(fā)光免疫測定法等使用標記的免疫測定法實施時， 優(yōu)選將本發(fā)明的抗體固定化、或?qū)⒃嚇又械某煞止潭ɑ?，進行其免疫 學(xué)反應(yīng)。
作為固相載體，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基曱苯、 聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚曱基丙烯酸酯、乳膠、明膠、 瓊脂糖、纖維素、瓊脂糖凝膠、玻璃、金屬、陶瓷或磁性體等材料組
28成的微珠、微量培養(yǎng)板、試管、棒(stick)或試驗片等形狀的不溶性 載體。
可以通過物理吸附法、化學(xué)結(jié)合法或并用兩種方法等7>知的方 法，使固相載體和本發(fā)明的抗體或試樣成分結(jié)合，進行固定化。
本發(fā)明中，為了容易地檢測本發(fā)明的抗體與試樣中的來自尿路上
皮癌細胞的CXCL1蛋白質(zhì)的反應(yīng)，通過標記本發(fā)明的抗體直接檢測該 反應(yīng)，或通過4吏用標記二抗間4妻;險測該反應(yīng)。本發(fā)明的4企測方法，乂人 靈敏度方面考慮，優(yōu)選使用后者的間接檢測(例如，夾心法等)。
作為標記物質(zhì)，使用酶免疫測定法時，可以使用過氧化物酶 (POD)、堿性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄 糖氧化酶、乳酸脫氫酶、淀粉酶或生物素-抗生物素蛋白復(fù)合體等； 使用熒光免疫測定法時，可以使用異硫氰酸熒光素、四甲基羅丹明異 硫氰酸鹽、取代異硫氰酸羅丹明、二氯三嗪異硫氰酸鹽、Alexa或 AlexaFluoro等； -使用放射免疫測定法時，可以^吏用氚、石典125或石典131 等。另外，使用發(fā)光免疫測定法時，可以使用NADH-、 FMNH2-、 螢光素酶類、魯米諾-過氧化氫-POD類、吖啶酯類或二氧雜環(huán)丁烷 化合物類等。
作為標記物質(zhì)和抗體的結(jié)合方法，在使用酶免疫測定法時，可以 使用戊二醛法、馬來酰亞胺法、吡啶基二硫化物法或高碘酸法等公知 方法；在使用放射免疫測定法時，可以4吏用氯胺T法、Bolton-Hunter 法等7>知方法。測定才喿作方法可以通過7>知的方法(Current protocols in Protein Sciences 、 1995年,John Wiley & Sons Inc.、 Current protocols in Immunology、 2001年，John Wiley & Sons Inc.)進4亍。例如，直4妄標^己 本發(fā)明的抗體時，將試樣中的成分固定化，4吏其與標記的本發(fā)明的抗 體接觸，形成CXCL1蛋白質(zhì)-本發(fā)明的抗體的復(fù)合體。然后將未結(jié)合 的標記抗體洗滌分離，可以由結(jié)合的標記抗體的量或未結(jié)合的標記抗 體的量測定試樣中的CXCL1蛋白質(zhì)的量。
另外，使用例如標記二抗時，使本發(fā)明的抗體與試樣反應(yīng)(一次 反應(yīng))，再與標記二抗反應(yīng)(二次反應(yīng))。 一次反應(yīng)和二次反應(yīng)可以以相反的順序進行，也可以同時進行，還可以錯開時間進行。通過一
次反應(yīng)及二次反應(yīng)，形成固定化的CXCL1蛋白質(zhì)-本發(fā)明的抗體-標 記二抗的復(fù)合體、或固定化的本發(fā)明的抗體-CXCLl蛋白質(zhì)-標記二
抗的復(fù)合體。然后洗滌分離未結(jié)合的標記二抗，可以通過結(jié)合的標記
二抗的量或未結(jié)合的標記二抗的量測定試樣中的CXCL1蛋白質(zhì)的量。 具體而言，使用酶免疫測定法時，在標記酶的最適條件下使其與 底物反應(yīng)，通過光學(xué)方法等測定反應(yīng)生成物的量。使用熒光免疫測定 法時，測定由熒光物質(zhì)標記產(chǎn)生的熒光強度，使用放射免疫測定法時， 測定由放射性物質(zhì)標記產(chǎn)生的放射能量。使用發(fā)光免疫測定法時，測 定由發(fā)光反應(yīng)體系產(chǎn)生的發(fā)光量。
本發(fā)明的方法中，通過采用光學(xué)方法測定或者肉眼觀測其透射光 或散射光的測定方法來測定免疫比濁法、乳膠凝聚反應(yīng)、乳膠比濁法、 紅細胞凝集反應(yīng)或粒子凝集反應(yīng)等中免疫復(fù)合體凝集物的生成，此 時，作為溶劑可以使用磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris緩沖液或 Good，s緩沖液等，還可以在反應(yīng)體系中含有聚乙二醇等反應(yīng)促進劑或 非特異性反應(yīng)抑制劑。
以下，說明本發(fā)明的檢測法的優(yōu)選實施方案的 一例。 首先，將本發(fā)明的抗體作為第一抗體固定在不溶性載體上。然后， 優(yōu)選通過與抗原無關(guān)的蛋白質(zhì)(胎牛血清、牛血清白蛋白、明膠等) 封閉未吸附抗原的固相表面。接下來，使固定化的第一抗體和受試試 樣接觸。然后，和在與上述第一抗體不同的部位與CXCL1蛋白質(zhì)反應(yīng) 的標記二抗接觸，檢測來自該標記的信號。此處，使用的"在與第一 抗體不同的部位與CXCL1蛋白質(zhì)反應(yīng)的第二抗體"，只要是能夠識別 第 一抗體與CXCL1蛋白質(zhì)結(jié)合部位以外的部位的抗體即可，沒有特殊 的限制，無論免疫原的種類如何，可以為多克隆抗體、抗血清、單克 隆抗體中的任一種，另外，也可以使用上述抗體的片段(Fab、 F(ab') 2、 Fab、 Fv、 ScFv等)。進而，作為第二抗體，也可以使用多種單克 隆抗體。
另外，與上述相反，也可以對本發(fā)明的抗體進行標記，成為第二抗體，在與本發(fā)明的抗體不同的部位將與CXCL1蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體作
為第 一抗體固定在不溶性載體上，使此固定化的第 一抗體和受試試樣 接觸，然后，使其與作為第二抗體的標記的本發(fā)明抗體接觸，檢測來 自上述標記的信號。
另外，如上所述，由于本發(fā)明的抗體能夠特異地與來自尿路上皮
癌細胞的CXCL1蛋白質(zhì)反應(yīng)，所以能夠作為癌癥診斷劑使用。本發(fā)明 的診斷劑是含有本發(fā)明的抗體的藥劑，所以，使用本發(fā)明的診斷劑， 檢測從懷疑患有尿路上皮癌的個體采集的試樣中所含的來自尿路上 皮癌細胞的CXCL1蛋白質(zhì)，由此能夠診斷該個體是否患有尿路上皮癌。
另外，本發(fā)明的診斷劑可用于任一種方法，只要所述方法是用于 進行免疫學(xué)測定的方法，通過與該技術(shù)領(lǐng)域中公知的免疫層析用試紙 條等簡便手段組合使用，能夠更加簡便且迅速地診斷癌癥。所謂免疫 層析用試紙條由下述部分構(gòu)成，例如，由易于吸收試樣的材料構(gòu)成的 試樣接受部、含有本發(fā)明診斷劑的試劑部、試樣和診斷劑的反應(yīng)產(chǎn)物 移動的展開部、將逐漸展開的反應(yīng)產(chǎn)物著色的標記部、-陂著色的反應(yīng) 產(chǎn)物逐漸展開的展示部等，可以為與妊娠診斷劑相同的形態(tài)。首先， 將試樣加至試樣接受部時，試樣接受部吸收試樣，使試樣到達至試劑 部。然后，在試劑部中，試樣中的來自尿路上皮癌細胞的CXCL1蛋白 質(zhì)和本發(fā)明抗體發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)的復(fù)合體移動到展開部，到達標記部。 在標記部中，上述反應(yīng)復(fù)合體和標記二抗發(fā)生反應(yīng)，與上述標記二抗 的反應(yīng)產(chǎn)物展開至展示部時，確認著色。上述免疫層析用試紙條，是 絲毫不會給使用者帶來由試劑使用導(dǎo)致的痛苦或危險性的用品，因 此，可以用于家庭監(jiān)測，由各醫(yī)療機構(gòu)對其結(jié)果進行徹底^r查、治療 (外科切除等)，能夠預(yù)防轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。目前此試紙條可以通過例如 特開平10 - 54830號公報所述的制造方法廉價地大量生產(chǎn)。另外，通 過將本發(fā)明的診斷劑和用于已知的尿路上皮癌的腫瘤標記物的診斷 劑組合使用，能夠可靠性更高地進行診斷。
所以，本發(fā)明還涉及一種尿路上皮癌診斷用試劑盒，所述試劑盒含有與CXCL1蛋白質(zhì)或其片段特異地反應(yīng)的抗體或其片段。本發(fā)明的 試劑盒中的抗體可以與上述固相載體結(jié)合。并且，本發(fā)明的試劑盒還 可以含有標記二抗、載體、洗滌緩沖液、試樣稀釋液、酶底物、反應(yīng)
終止液、作為純化的標準物質(zhì)的CXCL1蛋白質(zhì)等。
以下，通過實施例，更加具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并 不限定于此。
實施例
(1 )正常尿路上皮細胞培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
正常尿路上皮細胞由來自腎切除患者的正常尿管獲得。將從正常 尿管提取的尿路上皮細胞在1 Ocm的培養(yǎng)皿內(nèi)采用Defined KSFM培養(yǎng) 基進行培養(yǎng)(Scriven, S.D.等，1997年,Journal of Urology,第158巻， p.1147 - 1152 )。在4個直徑10cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的尿路上皮細胞90 %匯合時，用PBS (-)洗滌3次，然后，用不含血清的RPMI1640培 養(yǎng)基進行培養(yǎng)基交換，培養(yǎng)24小時，回收培養(yǎng)上清液。將此培養(yǎng)上清 液進行超離心(150，000g、 30分鐘、4。C)處理，除去沉渣后，通過4吏 用Amicon Ultra- 15 ( Millipore社)的離心處理將離心上清液濃縮
(4，000g、 20分鐘、4°C )。結(jié)果從40mL培養(yǎng)細胞上清液中提取到lmg 蛋白質(zhì)。
將200ng提取的蛋白質(zhì)用ProteomeLabTM PF2D System ( Beckman Coulter社)反相層析分離成26鎦分，胰蛋白酶消化后，用Q - TOF Ultima (Micromass社)徹底地進行蛋白質(zhì)鑒定。結(jié)果鑒定出約600種 蛋白質(zhì)，推測其中約20種具有生長因子活性。 (2)表達基因的分析
膀胱癌林化細胞(RT112、 5637、 T24、 EJ)用含有10%胎牛血清 的RPMI1640進行培養(yǎng)，正常尿路上皮細胞用defined - KSFM進行培養(yǎng)。 4吏用TrizoH式劑(Invitrogenit)及RNeasy Mini試劑盒(Qiagen) , 4安 照該社推薦的流程，分別由上述細胞制備總RNA。使用第一鏈cDNA 合成"i式劑盒 (First — Strand cDNA sysnthesis kit ) ( AmershamBiosciences),由總RNA 3嗎合成cDNA。以上述cDNA為模板，分別 針對作為由蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)的生長因子之一的CXCL1及作為其 受體的CXCR2設(shè)計引物，通過RT-PCR法分析基因表達，以分子量 為指標，通過瓊脂糖凝膠電泳確認有無表達(圖l )。作為分子量標 記物，使用Hi - Lo DNA Marker ( BIONEXUS )。
在作為來自浸潤性膀胱癌的細胞^f朱的5637、 T24中，CXCL1的 mRNA高度表達。在正常組織中雖能夠檢測到表達，但與來自浸潤性 癌的細胞抹相比其程度較低。
(3) 培養(yǎng)上清液中的CXCL1濃度測定
膀胱癌抹化細胞(5637、 T24)用含有10 %胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)，正常尿路上皮細胞用defined-KSFM進行培養(yǎng)。將各細胞在96 孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)24小時，在幾乎完全匯合的狀態(tài)下交換培養(yǎng)液。再培 養(yǎng)24小時后，回收培養(yǎng)上清液。使用Human GRO alpha / CXCLl Quantikine ELISA試劑盒(R&D Systems社)測定各培養(yǎng)上清液中的 CXCL1蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果正常尿路上皮細胞的培養(yǎng)上清液中未檢測到 CXCL1，而在作為來自浸潤性癌的細胞抹的5637、 T24的培養(yǎng)上清液 中檢測到約5 20ng/mL以上的高濃度的CXCLl (圖2)。
(4) 膀胱癌患者尿中的CXCL1濃度測定
從3名浸潤性的膀胱癌患者及1名健康對照者獲取尿樣，使用 Human GRO alpha / CXCLl Quantikine ELISA試劑盒(R&D Systems 社)測定尿中的CXCL1蛋白質(zhì)濃度。使用尿中肌酸酐濃度，對各樣品 進行CXCL1蛋白質(zhì)濃度的校正時，與健康對照者相比，可檢測到膀胱 癌患者的尿中CXCL1蛋白質(zhì)濃度的值較高(圖3)。
(5 )進展程度不同的膀胱癌患者尿中的CXCL1濃度測定
從32名早期(Ta)的膀胱癌患者、35名進行性(Tl以上)的膀胱 癌患者及40名健康對照者獲取尿樣，使用Human GRO alpha/ CXCLl Quantikine ELISA試劑盒(R&D Systems社),測定尿中的 CXCL1蛋白質(zhì)濃度。與健康對照者相比，可檢測到早期及進行性膀胱 癌患者的尿中CXCL1蛋白質(zhì)濃度的值較高(圖4)。(6 )正常尿路上皮組織及膀胱癌中的CXCL1表達的測定 將正常尿路上皮組織及膀胱癌組織用10 %中性福爾馬林固定，用 石蠟包埋。將此石蠟塊切成5pm厚的切片，脫石蠟化和濕潤化，固定 在載玻片上。通過過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化酶活性。將載玻片用PBS 洗滌后，用含有l(wèi)。/o兔血清的PBS處理30分鐘。將抗CXCL1抗體(Gro a(C-15): SC1374、 Santa Cruz Biotechnology社)稀釋至l: 150, 用作第一抗體，在4。C下靜置一晚。進而使用Histofine Simple Stain MAX - PO (抹式會社Nichirei Biosciences,日本)，在二氨基聯(lián)苯胺 作用下顯色。進而，用蘇木精將切片輕度染色。腫瘤細胞的細胞質(zhì)的 10 %以上被染色時確定為CXCL1陽性。
正常尿路上皮組織不被染色，可確認無CXCL1表達，但在進行性 (pT2G3)膀胱癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中可見強染色，表明CXCL1較 強地表達(圖5)。
因此，根據(jù)本發(fā)明，使用上述抗體或核酸探針，測定尿路上皮組 織或細胞等中的CXCL1基因的表達或表達量，通過與對照比較，以檢 測到該基因表達或表達量的增加為指標，能夠有效地檢測早期或進行 性膀胱癌等尿路上皮癌。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
根據(jù)本發(fā)明，能夠采用簡易且廉價的方法有效地檢測尿路上皮 癌，因此，能夠早期發(fā)現(xiàn)、診斷及治療尿路上皮癌。另外，根據(jù)本發(fā) 明的方法，能夠使用患者的尿，非侵襲性地檢測尿路上皮癌，因此能 夠簡4更且迅速地檢測尿路上皮癌。
本說明書中引用的全部刊行物、專利及專利申請直接作為參考記 入本"i兌明書。
權(quán)利要求
1、一種檢測尿路上皮癌的方法，所述方法包括體外測定來自受試者的生物試樣中的CXCL1蛋白質(zhì)、或編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，所述方法測定所述蛋白質(zhì)的量或所 述基因的表達量。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，以所述蛋白質(zhì)的量或所述基 因的表達量與對照試樣的量相比顯著增加為指標。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述增加為2倍以上。
5、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述增加為3倍以上。
6、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述測定是通過免疫學(xué)方法 進4亍的測定。
7、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述測定是通過雜交進行的 測定。
8、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述測定使用能夠與所述蛋 白質(zhì)或所述基因結(jié)合的物質(zhì)進行。
9、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中，能夠與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的物 質(zhì)為抗體或其片段。
10、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中，能夠與所述基因結(jié)合的物 質(zhì)為核酸探針。
11、 如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述核酸探針由下述成分 構(gòu)成由序列號l所示的堿基序列或其變異體構(gòu)成的核酸、由其互補 序列構(gòu)成的核酸、與所述核酸在嚴格條件下雜交的核酸、或含有所述 核酸的15個以上連續(xù)堿基的片段。
12、 如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中，所述抗體或核酸探針 一皮才示"i己。
13、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，使用與所述蛋白質(zhì)或其片 段特異性結(jié)合的抗體或其片段，采用免疫學(xué)方法測定試樣中的該蛋白 質(zhì)，以與對照試樣的量相比該蛋白質(zhì)的量的增加為指標，檢測尿路上皮癌。
14、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，使用下述探針測定試樣中 所述基因的表達量，以與對照試樣的量相比該表達量的增加為指標，檢測尿路上皮癌，所述探針由下述成分構(gòu)成由序列號l所示的堿基序列或其變異體構(gòu)成的核酸、由其互補序列構(gòu)成的核酸、與所述核酸在嚴格條件下雜交的核酸、或含有所述核酸的15個以上連續(xù)堿基的片段。
15、 如權(quán)利要求l所述的方法 癌、腎盂癌、尿管癌及尿道癌。
16、 如權(quán)利要求l所述的方法 血清或尿。
17、 如權(quán)利要求l所述的方法 或纟田月包。
18、 如權(quán)利要求l所述的方法， 示的氨基酸序列或其變異體序列。
19、 如權(quán)利要求l所述的方法， 的堿基序列或其變異體序列。
20、 一種尿路上皮癌診斷用試劑盒，其中含有與CXCL1蛋白質(zhì)或 其片段特異性結(jié)合的抗體或其片段或它們的化學(xué)修飾衍生物。
21、 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中，所述蛋白質(zhì)具有序列號 2所示的氨基酸序列或其變異體序列。
22、 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中，所述蛋白質(zhì)的片段含有 由至少8個氨基酸構(gòu)成的表位。
23、 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中，所述尿路上皮癌選自膀 胱癌、腎孟癌、尿管癌及尿道癌。
24、 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中，所述抗體或其片段與固 相載體結(jié)合。
25、 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中，還含有能夠與所述抗體 或其片段結(jié)合的標記第二抗體。,其中，所述尿路上皮癌選自膀胱 ，其中，所述試樣為血液、血漿、 ，其中，所述試樣為尿路上皮組織 其中，所述蛋白質(zhì)具有序列號2所 其中，所述基因具有序列號l所示
26、 如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中，所述第二抗體的標記為 酶、熒光或放射性標記。
27、 一種尿路上皮癌診斷用試劑盒，其中含有由序列號l所示的 堿基序列或其變異體序列構(gòu)成的核酸、由其互補序列構(gòu)成的核酸、與 所述核酸在嚴格條件下雜交的核酸、或含有所述核酸的15個以上連續(xù) 堿基的片段、或它們的化學(xué)修飾衍生物。
28、 如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中，所述核酸含有序列號l 所示的堿基序列或其變異體序列。
29、 如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中，所述尿路上皮癌選自膀 胱癌、腎盂癌、尿管癌及尿道癌。
30、 如權(quán)利要求27- 29中任一項所述的試劑盒，其中，所述核酸 與固相載體結(jié)合。
31、 如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中，所述固相載體為DNA芯 片或微陣列基板。
32、 權(quán)利要求20或27所述的試劑盒的使用方法，用于體外檢測受 試者的尿路上皮癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測尿路上皮癌的方法，所述方法包括體外測定來自受試者的生物試樣中的CXCL1蛋白質(zhì)、或編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達，本發(fā)明還涉及一種尿路上皮癌診斷用試劑盒，所述試劑盒包含能夠與該蛋白質(zhì)或基因特異性結(jié)合的抗體或核酸探針。
文檔編號G01N37/00GK101297046SQ200680039458
公開日2008年10月29日 申請日期2006年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者信正均, 小園聰子, 小川修, 田中祥德, 秋山英雄, 高橋毅 申請人:東麗株式會社;國立大學(xué)法人京都大學(xué)