Aldh2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。所述的應(yīng)用是指通過RT-PCR反應(yīng)對尿路上皮組織樣本中的ALDH2基因的mRNA表達(dá)量與正常尿路上皮組織中的ALDH2基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行對比，當(dāng)樣本中ALDH2基因的mRNA表達(dá)量低于正常ALDH2基因的mRNA表達(dá)量時，該樣本為上尿路上皮癌樣本；也可以通過對樣本尿路上皮組織進(jìn)行免疫組化測定，當(dāng)樣本尿路上皮組織的染色指數(shù)≤4時，該樣本尿路上皮組織中ALDH2高表達(dá)，該樣本為上尿路上皮癌樣本。本發(fā)明具有為UTUC患者的診斷提供了一種新的診斷性指標(biāo)，并且ALDH2基因能夠預(yù)測T2和T3患者生存差異的優(yōu)點。
【專利說明】ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及ALDH2(乙醛脫氫酶2)基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]成年人腎癌包括起源于腎實質(zhì)和腎盂的惡性腫瘤。腎癌中最主要的類型是腎實質(zhì)癌而腎盂癌相對罕見(大約占10%)。幾乎所有的腎盂癌都是上尿路上皮癌(UTUC),UTUC大約占病理診斷腎癌的8.4%，大約占所有尿路上皮癌的5%。UTUC是一種起源于輸尿管口到腎盞的移行(尿路)上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。人們對UTUC的認(rèn)識不足，并且這些認(rèn)識通常基于膀胱移行細(xì)胞癌，這是因為人們認(rèn)為他們有共同的危險因素，如吸煙和使用含有乙酰對氨基苯酹類鎮(zhèn)痛藥。我們從Lughezzani等人的文獻(xiàn)了解到:在過去的幾年中，一些與UTUC進(jìn)程相關(guān)的分子標(biāo)志物如細(xì)胞增殖(EFGR)、新生血管形成(如HIF-1 α )、細(xì)胞粘附(如鈣粘附素和鏈蛋白)、細(xì)胞凋亡(如Bcl-2)和細(xì)胞周期控制(Ρ53)等推動著UTUC的臨床實踐向前發(fā)展。但是多變量分析證明P53并不能作為獨立的預(yù)后指標(biāo)。雖然腫瘤的分期以及腫瘤的病理學(xué)分級仍被認(rèn)為是最可信的臨床結(jié)果預(yù)測指標(biāo)。然而，其它一些腫瘤研究卻表明:用分子標(biāo)志物判斷生存預(yù)后要比病理學(xué)分級更好。為了證明在預(yù)后生存方面分子標(biāo)志物優(yōu)于病理學(xué)分級，在這項研究中，我們并不是簡單的選擇性的測試幾個基因序列，而是以全基因組mRNA表達(dá)譜為基礎(chǔ)盡可能找出與預(yù)后有關(guān)的所有基因。
[0003]人們已經(jīng)證明:在確定腫瘤特異性標(biāo)志物、亞型和預(yù)測治療結(jié)果方面，利用微陣列或第二代測序技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的mRNA表達(dá)譜繪測的方法是有效的。這種方法使得同時對成千上萬的基因乃至整個基因組掃描的系列研究成為可能，因此這種方法可以促進(jìn)對腫瘤的全面理解并有利于高敏感`性和高特異性的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。與微陣列技術(shù)相比，基于序列的分析不產(chǎn)生mRNA雜交序列并且避免重復(fù)性，它可以在無限的動態(tài)范圍中測量基因表達(dá)水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明通過基于序列的分析，揭示了在UTUC患者中ALDH2的表達(dá)下調(diào)，并確定ALDH2的蛋白表達(dá)可以作為UTUC患者重要的并且獨立的預(yù)后評價指標(biāo)。雖然病理--Μ分期可以預(yù)測Tl和T2或Tl和T3生存差異，但是分子標(biāo)記卻能夠預(yù)測T2和T3患者生存差異，這個不能通過!TM分期來預(yù)測。本發(fā)明的研究結(jié)果不僅描述了 UTUC的分子特性，并且提供了 UTUC的潛在的預(yù)后標(biāo)志物；更重要的是，為功能與臨床驗證提供了一個豐富的案例。
[0005]本發(fā)明的目的在于公開了 ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007]ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用。
[0008]上述技術(shù)方案所述的ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其中，ALDH2基因在上尿路上皮癌中表達(dá)下調(diào)。
[0009]上述技術(shù)方案所述的ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，包括下述步驟:
[0010](I)、取樣本尿路上皮組織，提取尿路上皮組織的RNA ；
[0011](2)、對樣本的尿路上皮組織RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到樣本尿路上皮組織的cDNA ；
[0012](3)、以步驟⑵獲得的尿路上皮組織cDNA為模版，以引物對P為引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，將樣本尿路上皮組織中的ALDH2基因的mRNA表達(dá)量與正常尿路上皮組織中的ALDH2基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行對比，當(dāng)樣本中ALDH2基因的mRNA表達(dá)量低于正常ALDH2基因的mRNA表達(dá)量時，該樣本為上尿路上皮癌樣本；其中引物對P為:
[0013]ALDH2 上游引物:5 ’ -CCAACCAGCAGCCCGAGGTC-3 ’，
[0014]ALDH2 下游引物:5’ -AAGGCCTTGTCCCCTTCAGCTACC-3’。
[0015]上述技術(shù)方案所述的ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其中，所述RT-PCR 的條件為:50°C 2 分鐘、95°C 2 分鐘，I 個循環(huán)；95°C 15 秒、55°C 30 秒、72°C 40 秒，40個循環(huán)。
[0016]上述技術(shù)方案所述的ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其中，所述的應(yīng)用是通過對樣本的尿路上皮組織進(jìn)行免疫組化測定，當(dāng)樣本尿路上皮組織的染色指數(shù)< 4，該樣本尿路上皮組織中ALDH2低表達(dá)，該樣本為上尿路上皮癌樣本。
[0017]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0018]1、本發(fā)明通過實驗揭示了 ALDH2基因在上尿路上皮癌中低表達(dá)，為UTUC患者的診斷提供了一種新的診斷性指標(biāo)。
[0019]2、本發(fā)明的ALDH2基因能夠預(yù)測T2和T3患者生存差異，而--Μ分期卻不能用來預(yù)測T2和T3生存差異。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]1、圖1為ALDH2的mRNA的表達(dá)在UTUC患者的腫瘤組織和正常對照組織之間的對比結(jié)果圖。
[0021]2、圖2為運用免疫組化染色顯示ALDH2在腫瘤組織中和正常組織中的不同顯色效果圖。
[0022]3、圖3為ALDH2的低表達(dá)與病人的預(yù)后的關(guān)系，其中Low為ALDH2低表達(dá)，High為ALDH2聞表達(dá)。
[0023]4、圖4為ALDH2作為預(yù)后指標(biāo)分子標(biāo)記物與了匪分期的對比試驗結(jié)果圖，其中Low為ALDH2低表達(dá)，High為ALDH2高表達(dá)。
【具體實施方式】:
[0024]為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗例對ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用作進(jìn)一步的說明。
[0025]一、樣本與試劑:
[0026](一)、樣本:
[0027]1、所有患者在 術(shù)前都未經(jīng)放療或化療；2、患者都是由中山腫瘤中心進(jìn)行病理診斷和臨床診斷后確診的；3、年齡大于18歲；4、腫瘤組織是術(shù)中通過電切或全切獲得的；5、樣本組織都是新鮮組織，切下后30分鐘內(nèi)放入RNAlater中，并在4°C冷藏過夜，其后_80°C低溫儲存；6、經(jīng)HE染色，腫瘤細(xì)胞超過80%的腫瘤組織；7、正常腎組織在病理學(xué)檢查中顯示正常的腎小管和腎小球且無腫瘤細(xì)胞污染。
[0028]手術(shù)切除的新鮮組織立即沉浸在RNAlater (Qiagen公司；德國)中，并4°C冷藏過夜以便溶液深入浸潤組織，其后_80°C低溫儲存。另一方面，蘇木精-伊紅(HE)染色檢測腫瘤細(xì)胞的百分比，篩選出腫瘤細(xì)胞超過80%的腫瘤組織作進(jìn)一步的研究。正常腎組織的病理學(xué)檢查顯示正常的腎小管和腎小球且無腫瘤細(xì)胞污染。根據(jù)2002美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)分期系統(tǒng)，對每名患者的腫瘤進(jìn)行分期或重新分期。
[0029](二)、試劑:
[0030](I) ,RNAlater ；
[0031](2)、DNase I (RNase Free,美國，Promega)；
[0032](3)、Trizol 試劑溶液(Invitrogen ；Carlsbad,美國)；
[0033](4) > oligo (dT) 18beads (Invitrogen,美國)；
[0034](5)、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) (Fermentas ;美國);
[0035](6)、RT-PCR儀(ABI7000)美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
[0036]本發(fā)明中涉及到上述試劑的使用均按照試劑使用說明中的步驟進(jìn)行操作。
[0037]試駘例1:RT-PCR檢測ALDH2基因的mRNA在上尿路上皮癌中表達(dá)下調(diào):
[0038](一 )、樣本信息:
[0039]10例患者的信息如表1所示:
[0040]表1樣本信息
[0041]
【權(quán)利要求】
1.ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其特征在于:ALDH2基因在上尿路上皮癌中表達(dá)下調(diào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，包括下述步驟: (1)、取樣本尿路上皮組織，提取尿路上皮組織的RNA； (2)、對樣本的尿路上皮組織RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到樣本尿路上皮組織的cDNA； (3)、以步驟(2)獲得的尿路上皮組織cDNA為模版，以引物對P為引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，將樣本尿路上皮組織中的ALDH2基因的mRNA表達(dá)量與正常尿路上皮組織中的ALDH2基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行對比，當(dāng)樣本中ALDH2基因的mRNA表達(dá)量低于正常ALDH2基因的mRNA表達(dá)量時,該樣本為上尿路上 皮癌樣本；其中引物對P為:
ALDH2 上游引物:5’ - CCAACCAGCAGCCCGAGGTC-3’，
ALDH2 下游引物:5’ - AAGGCCTTGTCCCCTTCAGCTACC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ALDH2基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其特征在于，所述RT-PCR的條件為:50°C 2分鐘、95°C 2分鐘，I個循環(huán)；95°C 15秒、55°C 30秒、72°C 40秒,40個循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ALDH2基因在檢測腎透明細(xì)胞癌中的應(yīng)用，其特征在于:所述的應(yīng)用是通過對樣本的尿路上皮組織進(jìn)行免疫組化測定，當(dāng)樣本尿路上皮組織的染色指數(shù)< 4，該樣本尿路上皮組織中ALDH2低表達(dá)，該樣本為上尿路上皮癌樣本。
【文檔編號】G01N33/574GK103558383SQ201310516711
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】蔡志明, 吳松, 楊坤, 蔣濤濤 申請人:深圳市第二人民醫(yī)院