Smad3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。所述的應(yīng)用是指通過RT-PCR反應(yīng)對尿路上皮組織樣本中的SMAD3基因的mRNA表達量與正常尿路上皮組織中的SMAD3基因的mRNA表達量進行對比，當樣本中SMAD3基因的mRNA表達量高于正常SMAD3基因的mRNA表達量時，該樣本為上尿路上皮癌樣本；也可以通過對樣本尿路上皮組織進行免疫組化測定，當樣本尿路上皮組織的染色指數(shù)≥5時，該樣本尿路上皮組織中SMAD3高表達，該樣本為上尿路上皮癌樣本。本發(fā)明具有為UTUC患者的診斷提供了一種新的診斷性指標，并且SMAD3基因能夠預(yù)測T2和T3患者生存差異的優(yōu)點。
【專利說明】SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]成年人腎癌包括起源于腎實質(zhì)和腎盂的惡性腫瘤。腎癌中最主要的類型是腎實質(zhì)癌而腎盂癌相對罕見(大約占10%)。幾乎所有的腎盂癌都是上尿路上皮癌(UTUC),UTUC大約占病理診斷腎癌的8.4%，大約占所有尿路上皮癌的5%。UTUC是一種起源于輸尿管口到腎盞的移行(尿路)上皮細胞的惡性腫瘤。人們對UTUC的認識不足，并且這些認識通?；诎螂滓菩屑毎?，這是因為人們認為他們有共同的危險因素，如吸煙和使用含有乙酰對氨基苯酹類鎮(zhèn)痛藥。我們從Lughezzani等人的文獻了解到:在過去的幾年中，一些與UTUC進程相關(guān)的分子標志物如細胞增殖(EFGR)、新生血管形成(如HIF-1 a )、細胞粘附(如鈣粘附素和(6-鏈蛋白)、細胞凋亡(如Bcl-2)和細胞周期控制(P53)等推動著UTUC的臨床實踐向前發(fā)展。但是多變量分析證明P53并不能作為獨立的預(yù)后指標。雖然腫瘤的分期以及腫瘤的病理學分級仍被認為是最可信的臨床結(jié)果預(yù)測指標。然而，其它一些腫瘤研究卻表明:用分子標志物判斷生存預(yù)后要比病理學分級更好。為了證明在預(yù)后生存方面分子標志物優(yōu)于病理學分級，在這項研究中，我們并不是簡單的選擇性的測試幾個基因序列而是以全基因組mRNA表達譜為基礎(chǔ)盡可能找出與預(yù)后有關(guān)的所有基因。
[0003]人們已經(jīng)證明:在確定腫瘤特異性標志物、亞型和預(yù)測治療結(jié)果方面，利用微陣列或第二代測序技術(shù)進行大規(guī)模的mRNA表達譜繪測的方法是有效的。這種方法使得同時對成千上萬的基因乃至整個基因組掃描的系列研究成為可能，因此這種方法可以促進對腫瘤的全面理解并有利于高敏感性和高特異性的生物標志物的發(fā)現(xiàn)。與微陣列技術(shù)相比，基于序列的分析不產(chǎn)生mRNA雜交序列并且避免重復(fù)性，它可以在無限的動態(tài)范圍中測量基因表達水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明通過基于序列的分析，我們揭示了在UTUC患者中SMAD3的表達上調(diào)，并確定SMAD3的蛋白表達可以作為UTUC患者重要的并且獨立的預(yù)后評價指標。雖然病理ITM 分期可以預(yù)測Tl和T2或Tl和T3生存差異，但是分子標記卻能夠預(yù)測T2和T3患者生存差異，這個不能通過?M分期來預(yù)測。本發(fā)明的結(jié)果不僅描述了 UTUC的分子特性，并且提供了 UTUC的潛在的預(yù)后標志物；更重要的是，為功能與臨床驗證提供了一個豐富的案例。
[0005]本發(fā)明的目的在于公開了 SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007]SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用。
[0008]上述技術(shù)方案所述的SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其中，SMAD3基因在上尿路上皮癌中表達上調(diào)。[0009]上述技術(shù)方案所述的SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，包括下述步驟:
[0010](I)、取樣本尿路上皮組織，提取尿路上皮組織的RNA ；
[0011](2)、對樣本的尿路上皮組織RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到樣本尿路上皮組織的cDNA ；
[0012](3)、以步驟⑵獲得的尿路上皮組織cDNA為模版，以引物對P為引物，進行 RT-PCR反應(yīng)，將樣本尿路上皮組織中的SMAD3基因的mRNA表達量與正常尿路上皮組織中的 SMAD3基因的mRNA表達量進行對比，當樣本中SMAD3基因的mRNA表達量高于正常SMAD3基 因的mRNA表達量時，該樣本為上尿路上皮癌樣本；其中引物對P為:
[0013]SMAD3 上游引物:5 ’ -CCCCACCACTCCAGCAGACCTT-3 ’，
[0014]SMAD3 下游引物:5 ’ -TGAACACGCACCTCCCAATCAGTA-3 ’。
[0015]上述技術(shù)方案所述的SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其中，所述 RT-PCR 的條件為:50°C 2 分鐘、95°C 2 分鐘，I 個循環(huán)；95°C 15 秒、55°C 30 秒、72°C 40 秒，40 個循環(huán)。
[0016]上述技術(shù)方案所述的SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其中，所述的應(yīng) 用是通過對樣本尿路上皮組織進行免疫組化測定，當樣本尿路上皮組織的染色指數(shù)> 5，該 樣本尿路上皮組織中SMAD3高表達，該樣本為上尿路上皮癌樣本。
[0017]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0018]1、本發(fā)明通過實驗揭示了 SMAD3基因在上尿路上皮癌中高表達，為UTUC患者的診 斷提供了 一種新的診斷性指標。
[0019]2、本發(fā)明的SMAD3基因能夠預(yù)測T2和T3患者生存差異，而ITM分期卻不能用來 預(yù)測T2和T3生存差異。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]1、圖1為SMAD3的mRNA的表達在UTUC患者的腫瘤組織和正常對照組織之間的對 比結(jié)果圖。
[0021]2、圖2為運用免疫組化染色顯示SMAD3在腫瘤組織中和正常組織中的不同顯色效 果圖。
[0022]3、圖3為SMAD3的高表達與病人的預(yù)后的關(guān)系，其中Low為SMAD3低表達，High為 SMAD3高表達。
[0023]4、圖4為SMAD3作為預(yù)后指標分子標記物與ITM分期的對比試驗結(jié)果圖，其中Low 為SMAD3低表達，High為SMAD3高表達。
【具體實施方式】:
[0024]為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗例對SMAD3基因在檢測上尿 路上皮癌中的應(yīng)用作進一步的說明。
[0025]一、樣本與試劑:
[0026](一)、樣本:
[0027]1、所有患者在術(shù)前都未經(jīng)放療或化療；2、患者都是由中山腫瘤中心進行病理診斷 和臨床診斷后確診的；3、年齡大于18歲；4、腫瘤組織是術(shù)中通過電切或全切獲得的；5、樣 本組織都是新鮮組織，切下后30分鐘內(nèi)放入RNAlater中，并在4°C冷藏過夜，其后_80°C低溫儲存；6、經(jīng)HE染色，腫瘤細胞超過80%的腫瘤組織；7、正常腎組織在病理學檢查中顯示正常的腎小管和腎小球且無腫瘤細胞污染。
[0028]手術(shù)切除的新鮮組織立即沉浸在RNAlater (Qiagen公司；德國)中，并4°C冷藏過夜以便溶液深入浸潤組織，其后_80°C低溫儲存。另一方面，蘇木精-伊紅(HE)染色檢測腫瘤細胞的百分比，篩選出腫瘤細胞超過80%的腫瘤組織作進一步的研究。正常腎組織的病理學檢查顯示正常的腎小管和腎小球且無腫瘤細胞污染。根據(jù)2002美國癌癥聯(lián)合委員會 (AJCC)分期系統(tǒng)，對每名患者的腫瘤進行分期或重新分期。
[0029](二)、試劑:
[0030](I) ,RNAlater ；
[0031](2)、DNase I (RNase Free,美國，Promega)；
[0032](3)、Trizol 試劑溶液(Invitrogen ；Carlsbad,美國)；
[0033](4) > oligo (dT) 18beads (Invitrogen,美國)；
[0034](5)、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) (Fermentas ;美國);
[0035](6)、RT-PCR儀(ABI7000)美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
[0036]本發(fā)明中涉及到上述試劑的使用均按照試劑使用說明中的步驟進行操作。
[0037]試駘例1:RT-PCR檢測SMAD3基因的mRNA在上尿路上皮癌中表達上調(diào):
[0038](一 )、樣本信息:
[0039]10例患者的信息如表1所示:
[0040]表1樣本信息
[0041]
【權(quán)利要求】
1.SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其特征在于: SMAD3基因在上尿路上皮癌中表達上調(diào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，包括下述步驟:(1)、取樣本尿路上皮組織，提取尿路上皮組織的RNA；(2)、對樣本的尿路上皮組織RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到樣本尿路上皮組織的cDNA；(3)、以步驟(2)獲得的尿路上皮組織cDNA為模版，以引物對P為引物，進行RT-PCR反 應(yīng)，將樣本尿路上皮組織中的SMAD3基因的mRNA表達量與正常尿路上皮組織中的SMAD3基 因的mRNA表達量進行對比，當樣本中SMAD3基因的mRNA表達量高于正常SMAD3基因的mRNA 表達量時,該樣本為上尿路上皮癌樣本；其中引物對P為:SMAD3 上游引物:5’ - CCCCACCACTCCAGCAGACCTT -3’，SMAD3 下游引物:5’ - TGAACACGCACCTCCCAATCAGTA -3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其特征在于，所 述RT-PCR的條件為:50°C 2分鐘、95°C 2分鐘，I個循環(huán)；95°C 15秒、55°C 30秒、72°C 40 秒,40個循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的SMAD3基因在檢測上尿路上皮癌中的應(yīng)用，其特征在于: 所述的應(yīng)用是通過對樣本尿路上皮組織進行免疫組化測定，當樣本尿路上皮組織的染色指 數(shù)> 5，該樣本尿路上皮組織中SMAD3高表達，該樣本為上尿路上皮癌樣本。
【文檔編號】G01N33/574GK103558395SQ201310516248
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】吳松, 何穎穎, 楊澤雨, 蔡志明, 楊雷 申請人:深圳市第二人民醫(yī)院