專利名稱：一種肝素黃桿菌肝素酶i、ii、iii的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝素酶I、II、III的制備方法，尤其涉及一種由氯化鈣全程保護(hù)之下、并含肝素緩沖液洗脫的特殊層析分離技術(shù)制備肝素酶I、II、III的方法。
背景技術(shù)：
肝素酶是指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離出來的，其后，又陸續(xù)在一些微生物和動物組織中發(fā)現(xiàn)存在肝素酶。肝素酶的應(yīng)用十分廣泛，如清除血液中殘存肝素、防止凝血、生產(chǎn)低分子肝素、研究肝素的結(jié)構(gòu)。目前有學(xué)術(shù)論文報道的肝素酶大約有10多種，得到較為細(xì)致研究的只有來自肝素黃桿菌的3種酶，分別是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I、II、III分別是分子量大約 43、78、66kd的單體蛋白質(zhì)，其等電點均在9. 0左右，應(yīng)用和研究非常廣泛。肝素酶的純化工作有許多研究報道，但因肝素酶是一種很容易失活的酶，已報道的純化工藝中大都存在活性損失很大、收率低等缺點。Yang等人(J Biol Chem, 1985, 260(3) :1849-1857)用羥基磷灰石吸附/洗脫處理、QAE-葡聚糖柱層析、等電聚焦、凝膠過濾等四步純化，制得純肝素酶I，活性收率大約；Daniel等人(J Bio Chem, 1992, 267(34) =24347-24355)用羥基磷灰石吸附/洗脫處理、QAE-葡聚糖凝膠層析、羥基磷灰石 HPLC,Mono-S FPLC、GPC_HPLC等五步純化，最終獲得純的肝素酶I，活性回收率10. 8% ；馬小來等人(食品與藥品，2005，32 (5) =446-450)使用羥基磷灰石吸附/解吸、DEAE-kpharose 柱層析、CM-Cellose柱層析等三步純化法，純化得到肝素酶I，活性收率13. 4% ；Xiaolai Ma 等人(J Chrom B, 2006,843 (2) :209-215)通過硫酸銨沉淀、octyl-s印harose 柱層析、 CM-650柱層析、SP-650柱層析、s印hadex G-100柱層析等五步純化法獲得純化的肝素酶I， 收率達(dá)到17.8%，為所見的肝素酶I最高純化收率。馬小來等在2009年5月提交的“一種肝素黃桿菌肝素酶I制備方法”(專利申請?zhí)?200910039360. 1)中，建立了一種全新的純化制備工藝，使肝素酶I在純化過程中始終處于氯化鈣的保護(hù)之下，從而獲得高達(dá)30%的純酶活性收率，制備的肝素酶I比活高達(dá)223IU/ mg，與已有最高技術(shù)相比，比活增加了兩倍多，純化收率增加將近一倍。本發(fā)明給出一種同時制備純化出肝素酶I、II、III的方法，在氯化鈣保護(hù)之下、并含肝素緩沖液洗脫的多步層析分離技術(shù)，最終制備肝素酶I、II、III的方法。方法高效、可重復(fù)，所得酶純度極高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種肝素酶I、II、III的制備方法，該方法可同時純化出3種酶，制備的肝素酶I、III比活高達(dá)417和235IU/mg，肝素酶II比活為 15. 3IU/mg。與已報道方法相比，酶I、III比活增加兩倍，酶II比活接近最高報道。本發(fā)明包括下述步驟(1)肝素酶的粗酶液的發(fā)酵制備
將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環(huán)菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23°C， 150rpm，培養(yǎng)1天。然后按5 %接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，23°C，150rpm，培養(yǎng)2-3天。菌液 10000rpm，4°C離心15-30分鐘，收集沉淀，懸浮在100ml、50mM iTris-HCl@緩沖液中，冰浴超聲1小時(150W，5s，5s)。4°C，10000rpm，離心30min，向其中滴加0. 5g/ml的魚精蛋白8ml, 攪拌，4°C，IOOOOrpm,離心30min，上清即為粗酶液。(2)粗酶的SP柱分離將步驟⑴所得粗酶液上一根用10-50mM的Tris-HCl@平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，分別收集洗脫液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脫液，兩種酶呈兩個活性峰I和II ；將活性峰II (靠后的那個)洗脫液透析后上一根用50mM Tris-HCl @緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的TriS-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 2M洗脫，分別收集洗脫液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脫液，呈兩種酶呈兩個活性峰III和IV ；(3)肝素酶I的純化步驟( 活性峰III洗脫液透析后上一根用Tris-HCl 緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl③緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的組分，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶I。(4)肝素酶III的純化步驟( 活性峰IV洗脫液透析后上一根用Tris-HCl④緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl④緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的組分以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶III。(5)肝素酶II的純化步驟(2)活性峰I洗脫液透析后上一根用IOmM Tris-HCl⑤緩沖液平衡過的HEP 柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. IM洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸鈉緩沖液平衡過的HA 柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-1. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；然后上一根用Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl@緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管， 洗脫液合并、透析，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶II。其中，步驟⑴所述的種子培養(yǎng)基的組成為牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉 0. 5%, NaCl 為 0. 5%, pH7. 0。步驟(1)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)為肝素8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5， NH4Cl2. 0，MgCl2 0. 5，組氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素(NaMoO3, CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2, IX IO^4M) ο
步驟(1)、(2)、(3)、(4)所述Tris-HCl @②緩沖液含 IOmM CaCl2, ρΗ6· 5-8. 0，優(yōu)選 PH 范圍為 7. 0-7. 5。步驟(3)、(4)所述Tri s-HCl 緩沖液含氯化鈉5_75mM、含肝素0. 01-0. 5%，氯化鈉含量的優(yōu)選范圍為25-45mM，肝素含量的優(yōu)選范圍為0. 1-0. 2%，肝素的種類優(yōu)選為高
純度肝素。本發(fā)明還包括以下內(nèi)容(6)肝素酶活性測定在5ml石英比色皿中加入在30°C預(yù)熱過的2. 5ml肝素濃度為 lmg/ml 的 Tris-HCl@ (50mM，含 CaCl2 IOmM, ρΗ7· 0)緩沖液，移取 5-20 μ 1 酶液，搖勻后在232nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據(jù)摩爾消光系數(shù)計算單位時間產(chǎn)生的雙鍵的摩爾數(shù)，并由此計算酶液的單位活性(IU/ml)。(7)硫酸乙酰肝素酶活性測定在Iml石英比色皿中加入在30°C預(yù)熱過的0. 5ml 硫酸乙酰肝素濃度為lmg/ml的1Tris-HCl @ (50mM，含CaCl2 IOmM, pH7. 0)緩沖液，移取 5-20 μ 1酶液，搖勻后在232nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據(jù)摩爾消光系數(shù)計算單位時間產(chǎn)生的雙鍵的摩爾數(shù)，并由此計算酶液的單位活性(IU/ml)。(8)蛋白質(zhì)測定向5ml考馬斯亮藍(lán)溶液中加蛋白0. 1ml，搖勻，測定A595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算蛋白濃度本發(fā)明所述制備方法中，所有肝素酶I、III純化步驟都保證了保護(hù)劑CaCl2的存在，極大地保持了肝素酶I、III的穩(wěn)定。肝素酶I經(jīng)過純化最終得到比活高達(dá)416. 67IU/ ml的酶，整個過程活性收率為35%，提純了 73. 88倍，從IL發(fā)酵液的菌體中得到50IU的肝素酶I純酶。肝素酶III純化最終得到比活235IU/ml (硫酸類肝素底物)的酶，整個過程活性收率為4%，提純了 34. 36倍，從IL發(fā)酵液的菌體中得到7. 52IU的肝素酶III酶。肝素酶II純化最終得到比活15. 33IU/ml (肝素底物)的酶，整個過程活性收率為22%，提純了 2. 72倍。從IL發(fā)酵液的菌體中得到2. 76IU的肝素酶II較純酶。與已報道方法相比，酶I、III比活提高兩倍多，酶II比活接近最高報道。酶I、III 純化工藝活性收率也遠(yuǎn)高于已有報道的最高值。本發(fā)明所述制備方法，還具有工藝簡單、結(jié)果易重復(fù)的特點，可放大后用于工業(yè)大規(guī)模制備高純度肝素酶I、II、III。
具體實施例方式以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1 a、將肝素黃桿菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23°C，150rpm，培養(yǎng)1天；b、按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，23°C，150rpm，培養(yǎng)2-3天，4°C，10000rpm，離心 15-30分鐘，收集沉淀；C、沉淀懸浮在100ml、25mM的1^8-!1(1@緩沖溶液中，冰浴超聲1小時，4°C， lOOOOrpm，離心 30min，滴加 0. 5g/ml 的魚精蛋白 8ml，攪拌，4°C，lOOOOrpm，離心 30min，取上
清液；d、上一根用Tris-HCl@緩沖液平衡過的SP柱，以同樣的緩沖液平衡3個柱體積， 以Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性，呈兩個活性峰I、II分布的若干管；
e、活性峰II洗脫液透析后上一根用50mM Tris-HCl 緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 2M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的組分，呈兩個活性峰III、IV分布的若干管；f、活性峰III洗脫液透析后上一根用Tris-HClcg^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的組分，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶I。g、活性峰IV洗脫液透析后上一根用Tris-HCl 緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的組分以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶 III。h、活性峰I洗脫液透析后上一根用IOmM Tris-HCl @緩沖液平衡過的HEP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl⑤緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. IM洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸鈉緩沖液平衡過的HA柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-1. 5M洗脫，收集洗脫液若干管， 洗脫液合并、透析；然后上一根用Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl②緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶II。其中，所述的肝素黃桿菌肝素酶I、II、III的制備方法，其特征在于步驟a中所述種子培養(yǎng)基的組成為牛肉膏0. 5%、蛋白胨1%、酵母粉0. 5%, NaCl為0. 5%,pH7. 0。步驟b中所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為肝素8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5，NH4Cl 2. 0， MgCl2 0. 5，組氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素 NaMoOpCuClyi^eClyCoClyMnClyCaCh* IXlO-4M,單位為 g/L。所述Tris-HCl @②緩沖液含 IOmM CaCl2, ρΗ6· 5-8. 0。所述Tri s-HCl 緩沖液含氯化鈉5_75mM、含肝素0. 01-0. 5 %，肝素的種類為高純
度肝素。所述Tris-HCl 緩沖液含氯化鈉5_75mM、含肝素0. 1-0. 5%，肝素的種類為高純度肝素。
權(quán)利要求
1.一種肝素黃桿菌肝素酶的制備方法，所述方法包括下述步驟(1)肝素酶的粗酶液的發(fā)酵制備將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環(huán)菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23°C，150rpm，培養(yǎng)1天，然后按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，230C，150rpm,培養(yǎng)2-3天。菌液lOOOOrpm，4°C 離心15-30分鐘，收集沉淀，懸浮在100ml、50mM Tris-HCl①緩沖液中，冰浴超聲1小時； 40C，lOOOOrpm,離心30min,向其中滴加0. 5g/ml的魚精蛋白8ml，攪拌，4°C，lOOOOrpm,離心 30min，上清即為粗酶液；(2)粗酶的SP柱分離將步驟⑴所得粗酶液上一根用10-50mM的Tris-HCli1^衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，分別收集洗脫液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脫液，兩種酶呈兩個活性峰I和II ；將活性峰II洗脫液透析后上一根用50mM Tris-HClt^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 2M洗脫，分別收集洗脫液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脫液，呈兩種酶呈兩個活性峰 III 禾口 IV ；(3)肝素酶I的純化步驟( 活性峰III洗脫液透析后上一根用Tris-HClcg^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有肝素酶活性的組分，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶I ；(4)肝素酶III的純化步驟( 活性峰IV洗脫液透析后上一根用Tris-HCl④緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl 緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的Tris-HCl緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的組分以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶 III ；(5)肝素酶II的純化步驟⑵活性峰I洗脫液透析后上一根用IOmM Tris-HClcs^沖液平衡過的HEP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，Tris-HCl⑤緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. IM洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸鈉緩沖液平衡過的HA柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-1. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析；然后上一根用Tris-HClc^l沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡 3個柱體積，Tris-HCl@緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，得到肝素酶II。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述種子培養(yǎng)基的組成為牛肉膏0. 5%、蛋白胨1%、酵母粉0. 5%, NaCl為0. 5%,pH7. 0。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為肝素 8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5，NH4Cl 2. 0，MgCl2 0. 5，組氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素 NaMo03、CuCl2, FeCl2, CoCl2^MnCl2, CaCl2 共 1 X 1(Γ4Μ，單位為 g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述Tris-HClsx^l沖液含IOmMCaCl2, pH6. 5-8. O0
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述Tris-HClc^l沖液含氯化鈉 5-75mM、含肝素0. 01-0. 5%，肝素的種類為高純度肝素。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述Tris-HCl 緩沖液含氯化鈉 5-75mM、含肝素0. 1-0. 5 %，肝素的種類為高純度肝素。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于肝素酶I、III純化步驟都有保護(hù)劑 CaCl2的存在。
全文摘要
本發(fā)明提供肝素黃桿菌肝素酶I、II、III的制備方法，以肝素黃桿菌為原料，將肝素黃桿菌接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)、再接到發(fā)酵培養(yǎng)基、離心收集沉淀、沉淀超聲破碎、離心得到肝素黃桿菌肝素酶I、II、III的粗酶液，先將粗酶液通過一次SP-Sepharose FF層析分離為酶II和酶I、III，再將酶I、III再次過SP-Sepharose FF分離為肝素酶I和肝素酶III；將得到的酶I和酶III分別各再過SP-Sepharose FF兩次，純化得到高純度的肝素酶I和III；將得到的酶II分別過HEP-Sepharose 4B、HA-Ultrogel、SP-Sepharose FF，得到高純度的肝素酶II。
文檔編號C12N9/42GK102286448SQ201110241260
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者史紹鵬, 李鋰, 馬小來 申請人:深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司