專利名稱：利用Runx2和Osterix促進成骨細胞分化的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及Runx2和Osterix在制備用于預防或治療與成骨細胞分化相關的疾病的藥物組合物中的應用，在所述藥物組合物中，Runx2蛋白的含量小于Osterix蛋白的含量，優(yōu)選地，Runx2蛋白含量與Osterix蛋白含量的比例為I : N，其中N大于I，例如I : 2、I : 3、至I : 4甚至更低比例，更優(yōu)選的比例為I : 4。具體地，本發(fā)明通過以Runx2表達(或活性)水平小于Osterix的表達(或活性)水平的方式共表達Runx2和Osterix來加速誘導非成骨細胞定向成骨細胞分化或增強成骨細胞的功能。而且根據(jù)改變Runx2表達(或活性)水平與Osterix的表達(或活性)水平的比例從而引起成骨細胞分化與功能的變化來有目的地篩選骨病預防或治療的新藥物。
背景技術：
骨疾病有多種。其中骨質疏松就是一個全球性醫(yī)學難題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界每年大約發(fā)生二百五十萬起因為骨質疏松引起的嚴重骨折，而且這一數(shù)字將隨著包括我國在內的各國社會的老齡化發(fā)展而進一步上升。骨質疏松不僅給人帶來痛苦，還給各國社會帶來沉重財政負擔，因此各國都投入大量人力物力針對骨質疏松預防和治療進行基礎和應用研究。骨質疏松通常在難以察覺的情況下發(fā)生，是由于成骨細胞(負責骨形成)和破骨細胞(負責骨吸收)之間的功能性平衡被打破，骨吸收遠遠超過骨形成而引起的。雖然人們已經能夠開發(fā)出以抑制骨吸收為目的的骨質疏松治療藥物和方法，但是促進骨形成的有效藥物和方法至今只有EliLilly公司開發(fā)的，于2002年11月末被美國FDA批準的甲狀旁腺激素(parathyroid hormone)(以下簡稱PTH)注射劑Forteo ,用于治療嚴重的骨質疏松。人們?yōu)榱藢ふ腋嗪透行А⒎奖愕闹委煼椒?，迫切需要對成骨細胞分化及其功能的分子機制有充分的了解(Goltzman, 2002 ;Harada and Rodan, 2003 ；Lian and Stein,2003)。臨床上修復骨損傷、促進骨折愈合的醫(yī)療以及骨組織工程研究開發(fā)仍然存在許多理論和實踐難題。其中主要問題之一就是受限于不能從其它供體細胞，包括各種干細胞，獲得大量的、能強力成骨的細胞來源。因此組織器官工程極為關注成骨細胞的定向誘導、細胞表型穩(wěn)定、大規(guī)模體外擴增和組織工程骨規(guī)?；w外構建等的研究內容。但是這種問題沒有得到根本的解決。在本領域內，骨形成蛋白(簡稱BMPs)已經在臨床上開展了應用并受到廣泛的關注。BMP能夠促進非成骨細胞的成骨作用。然而，應用BMP不僅需要使用很大的劑量；也可能對非骨組織的細胞產生不利影響?？傊谶@一領域要有所突破，還需要對成骨細胞分化及其功能的分子機制有充分的了解(Phillips and Garcia，2008)。目前，在開發(fā)破骨細胞所參與的骨吸收抑制的許多研究都取得了顯著進展，迄今為止人們開發(fā)了和臨床上獲準使用的破骨細胞所參與的骨吸收抑制劑。盡管BMPs和PTH(1-34)都被認為是骨形成的促進劑，而且有人篩選到statins這類小分子來誘導BMP的表達從而增強骨形成(Mundy et al.，1999)，但迄今為止臨床上還沒有找到其它的小分子藥物。
成骨細胞分化的細胞途徑從多潛能的間充質干細胞開始，經由不成熟的或早期成骨細胞階段，分化到成熟的功能性的成骨細胞，成骨細胞成熟后被自身分泌的骨基質包埋并進一步轉化為骨細胞。成骨細胞分化是受到體內外各種作用的結果，其中，控制分化的關鍵轉錄因子起到決定或維持作用(劉文廣,等,2003 ;Nakashima and de Crombrugghe,2003)，各種表觀遺傳機制等進一步調控轉錄因子引發(fā)的細胞分化的分子事件(Schroeder，et al.，2005)。研究表明，核心結合因子α I (Core binding factor α I,Cbfal)是一種關鍵的轉錄因子，控制間充質干細胞向成骨細胞分化(Komori，et al.，1997)。在老鼠中剔除Cbfal，成骨細胞分化會受到阻抑，骨不能形成。Cbfal調控著許多骨基質蛋白基因表達。許多促進骨發(fā)育的因素(包括激素，生長因子，骨形成蛋白等)可能通過Cbfal及其所指導的成骨細胞分化途徑發(fā)揮作用(Yamaguchi, et al. , 2000)。因此,Cbfal被認為是控制骨形成和發(fā)育白勺“主基因 ” (master gene)。2000 年以后,Cbfal 又被重命名為 Runx2 (Runt related gene
2)。前面提到的PTH和BMPs促進或誘導骨形成最終作用點被認為就是Runx2 (Krishnan, etal. , 2003 ；Ito and Miyazono, 2003)。Runx2能夠在一定的環(huán)境下誘導皮膚成纖維細胞定 向成骨分化和強力的骨化作用(Phillips and Garcia, 2008),而且Runx2能明顯促進BMPs的誘導成骨作用(Ito and Miyazono, 2003)。Osterix是于2002年I月發(fā)現(xiàn)的，在Runx2下游，控制成骨細胞分化和骨形成的又一關鍵轉錄因子(Nakashima, et al. ,2002)。在老鼠中剔除Osterix,成骨細胞分化就會受到阻抑，骨也不能形成。但Osterix的表達離不開Runx2，并在其下游的分化途徑中發(fā)揮關鍵作用。Runx2和Osterix的活性都與其它因子相互作用而受到影響(Koga,et al. ,2005;Schroeder, et al. ,2005)。最新研究進展表明，關鍵轉錄因子組合對干細胞領域的細胞編程和重編程起著極為重要的作用。在最近的干細胞研究領域，從體細胞誘導出多潛能的干細胞特性，即體細胞的重編程，的研究獲得了許多令人矚目的突破性的成果。誘導性多能干細胞(iPS)的遺傳信息重編程的過程可以通過表達四種轉錄因子如0CT3/4，S0X2, Klf4，和c_Myc即可達到。iPS同胚胎干細胞非常相似，以至于能通過germline transmission和胚胎發(fā)育過程成為個體(Okita’et al. , 2007 ；Takahashi, et al. ,2007)。這一系列的 iPS 的研究工作充分突出了轉錄因子或其組合在建立和維持或重塑細胞表型上(細胞的編程和重編程)能夠發(fā)揮多么巨大的威力。我們同時也注意到，誘導干細胞產生所需的四種基因是通過逆病毒載體按I : I : I : I比例侵染體細胞的情況。其實，在近幾年干細胞研究領域，利用轉錄因子的組合已經可以成功地使干細胞定向分化。例如有研究者將三種Sox基因按I : I : I比例轉入軟骨細胞的前體細胞，成功誘導出了軟骨組織并維持其永久軟骨的特性(Ikeda，etal. ,2004)。針對上述關于轉錄因子的組合的研究進展，我們進一步猜測轉錄因子之間的不同比率也可能在干細胞定向分化的過程中發(fā)揮重要作用，我們隨后發(fā)現(xiàn)，Runx2和Osterix這兩個控制成骨細胞分化的關鍵轉錄因子之間的表達水平的比例也深刻影響間充質干細胞定向成骨細胞分化的程度。我們進一步推測，在骨發(fā)育過程中，不同類型或不同發(fā)育階段的成骨細胞的形成很可能也是通過在成骨細胞內建立不同的Runx2和Osterix基因間的表達或活性比例來實現(xiàn)的。
申請人在日本的小守壽文博士指導下于2001年10月發(fā)表論文(Liu, etal.,J. Cell Biol. 155 :157-166, 2001)。我們通過轉基因鼠研究發(fā)現(xiàn)，Runx2在成骨細胞中過度表達會嚴重抑制該細胞成熟(Liu，et al.，2001)。其主要表現(xiàn)為比較成熟的成骨細胞和由成骨細胞進一步轉化而來的骨細胞在轉基因骨中急劇減少，而比較不成熟的成骨細胞明顯增加，以致骨發(fā)育不良。我們因此認為，Runx2在分化途徑中主要是促進早期成骨細胞分化，抑制向骨細胞的轉化，并且在功能性的、比較成熟的成骨細胞中，其表達量或其轉錄活性必須維持在相對較低的水平。Runx2轉基因鼠，雖未能促進骨形成，卻促進早期成骨細胞分化和數(shù)量，因此，我們在提出利用Runx2促進骨形成的假說(Liu，et al.，2001)。這個假說就是建議在成骨細胞分化早期提高Runx2的表達或活性，在成熟的成骨細胞分化階段降低Runx2的表達或活性。而許多體外的研究表明，Runx2能夠在一定的環(huán)境下誘導成骨細胞分化和骨形成作用。這種體內和體外的矛盾表明，人們還不能有效利用Runx2來促進成骨細胞分化和骨形成。本發(fā)明人通過實驗證明不同Runx2和Osterix相對表達/活性比例對于成骨細胞分化有不同影響，發(fā)現(xiàn)了一種特殊Runx2和Osterix的蛋白表達比例能加速促進成骨細胞的分化，從而促進骨形成，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及Runx2和Osterix在制備用于預防或治療與成骨細胞分化相關的疾病的藥物組合物中的應用，在所述藥物組合物中，Runx2蛋白的含量小于Osterix蛋白的含量，優(yōu)選地，Runx2蛋白含量與Osterix蛋白含量的比例為I : N，其中N大于1，例如從I : 2、1 : 3、至I : 4甚至更低比例，更優(yōu)選的比例為I : 4。具體地，本發(fā)明通過以一種Runx2表達(或活性)水平小于Osterix的表達(或活性)水平的方式共表達Runx2和Osterix來加速誘導非成骨細胞定向成骨細胞分化或增強成骨細胞的功能。而且根據(jù)改變Runx2表達(或活性)水平與Osterix的表達(或活性)水平的比例從而引起成骨細胞分化與功能的變化來有目的地篩選骨病預防或治療的新藥物。技術問題本發(fā)明一個目的是通過按照特定比例的Runx2和Osterix共表達于間充質干細胞或其它非成骨細胞來加速促進成骨細胞分化。該方法可以促進骨形成并有助于治療多種骨病，例如骨質疏松，骨折，成骨不全等。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預防或治療與成骨細胞分化相關的疾病的藥物組合物，其包含Runx2蛋白和Osterix蛋白，并且其中Runx2蛋白的含量小于Osterix蛋白的含量，優(yōu)選地Runx2蛋白含量與Osterix蛋白含量的比例可以是在以下比例范圍內的任何一種比例即I N，其中N大于1，例如，I 2、1 : 3、至I : 4甚至更低比例。優(yōu)選地，所述藥物組合物還包含藥用載體。本發(fā)明的另一個目的是提供Runx2蛋白和Osterix蛋白在制備用于預防或治療與成骨細胞分化相關的疾病的藥物組合物中的應用，在所述藥物組合物中，Runx2蛋白的含量小于Osterix蛋白的含量。優(yōu)選地，在所述藥物組合物中，Runx2蛋白含量與Osterix蛋白含量的比例可以是在以下比例范圍內的任何一種比例即I N，其中N大于1，例如，I 2、I : 3、至I : 4甚至更低比例。
其中所述與成骨細胞分化相關的疾病選自骨質疏松、骨折、成骨不全、或牙周病
坐寸O本發(fā)明的另一個目的是提供Runx2基因和Osterix基因在制備用于促進成骨細胞分化的試劑盒中的應用，所述試劑盒包含Runx2基因的重組構建體和Osterix基因的重組構建體。在使用所述試劑盒時，用所述Runx2基因的重組構建體和Osterix基因的重組構建體分別轉染適宜的逆轉錄病毒生產細胞，分別收集逆病毒上清液，將含有Runx2基因的逆病毒上清液和含有Osterix基因的逆病毒上清液以I : M的比例(其中M大于1，例如，I : 2、1 : 3、至I : 4甚至更低比例)混合，共同侵染間充質干細胞或其它非成骨細胞，從而使Runx2蛋白含量與Osterix蛋白含量的比例達到以下比例范圍內的任何一種比例即I N，其中N大于1，例如，I 2、1 3、至I : 4甚至更低比例。其中，M和N為大于I的任何數(shù)，本領域技術人員可以確定適宜的數(shù)值。所述試劑盒可以用于組織工程骨的生產和與成骨細胞分化相關疾病的基因治療。 本發(fā)明還有一個目的是提供一種篩選促進骨形成的藥物的方法，其包括下述步驟(I)分別構建Runx2基因的重組構建體和Osterix基因的重組構建體；(2)利用適宜的逆轉錄病毒，用步驟(I)中的Runx2基因的重組構建體和Osterix基因的重組構建體侵染細胞，篩選下述三種單克隆重組細胞(i)其中Runx2蛋白表達水平小于Osterix蛋白表達水平，(ii)其中Runx2蛋白表達水平等于Osterix蛋白表達水平，和(iii)其中Runx2蛋白表達水平大于Osterix蛋白表達水平；和(3)將步驟(2)篩選得到的每種細胞單獨接受或不接受待選化合物的作用，觀察Runx2蛋白表達水平和Osterix蛋白表達水平比例的變化,并結合所述比例的變化觀察分析成骨細胞分化或功能的增強或減弱，從而完成促進骨形成的藥物的篩選；其中步驟(2)中所用的細胞選自間充質干細胞或其他非成骨細胞，例如，骨髓干細胞，皮膚細胞、脂肪細胞等。本發(fā)明所述的Runx2基因和Osterix基因可以來源于任何哺乳動物物種，優(yōu)選來源于小鼠和人，更優(yōu)選來源于人。本發(fā)明還提供用于篩選促進骨形成的藥物的篩選系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括下述三種單克隆重組細胞(i)其中Runx2蛋白表達水平小于Osterix蛋白表達水平(R < O)的單克隆重組細胞，(ii)其中Runx2蛋白表達水平等于Osterix蛋白表達水平(R = O)的單克隆重組細胞，和(iii)其中Runx2蛋白表達水平大于Osterix蛋白表達水平(R > O)的單克隆重組細胞。在所述篩選系統(tǒng)中所用的細胞可以選自間充質干細胞或其他非成骨細胞，例如，骨髓干細胞，皮膚細胞、脂肪細胞等。技術解決方案本發(fā)明提供了通過Runx2表達(或活性)水平小于Osterix的表達(或活性)水平的方式共表達Runx2和Osterix于間充質干細胞或其它非成骨細胞中，從而加速誘導成骨細胞分化的方法。Runx2和Osterix都是決定成骨細胞分化的關鍵轉錄因子，在骨的形成和發(fā)育的過程中，離開任何其中的一種因子都會導致骨形成不能發(fā)生。二者均調控骨特異的基因的表達，而且許多研究表明，在體外的培養(yǎng)的細胞中，誘導表達二者之一，即可使這些細胞均表達出多種骨特異的基因，從而引發(fā)成骨細胞的分化特征。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，以相同的蛋白質水平分別單獨表達Runx2或Osterix于C3H10T1/2間充質多功能干細胞中并沒有導致相似的成骨分化水平，Osterix無論是在堿性磷酸酶活性水平，鈣化水平以及誘導多種骨特異的基因的表達的能力都顯著弱于Runx2。但是當將二者以不同比例的蛋白質表達水平共同表達于同一種的多功能干細胞時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當Runx2比Osterix的蛋白質表達水平低時，共同表達Runx2和Osterix能夠極其顯著地誘導成骨細胞分化的重要標志-鈣化。當Runx2與Osterix的蛋白質表達水平相近時，與Runx2比Osterix的蛋白質水平低時相比較，鈣化效果顯著降低，但是與Runx2比Osterix的蛋白質表達水平高時相比仍然有明顯的提高。Runx2比Osterix的蛋白質水平高時與只表達Runx2時相比,I丐化效果 沒有變化，盡管這兩種情況下Runx2的蛋白質水平沒有明顯差異。無論以何種比例蛋白水平共同表達Runx2和Osterix均未進一步在單獨表達Runx2的基礎上誘導早期成骨細胞分化的重要標志-堿性磷酸酶的活性。通過RT-PCR分析表明，在誘導多種骨特異的基因的表達的能力上，例如I型膠原蛋白，骨I丐蛋白(Osteocalcin),骨涎蛋白(Bonesialoprotein)這些成熟成骨細胞的標志基因，與Runx2比Osterix的蛋白質水平高時相比，以Runx2比Osterix的蛋白質水平低的方式共同表達Runx2和Osterix能夠極其顯著地誘導這些基因的表達。不僅如此，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，Runx2比Osterix的蛋白質水平低時,共同表達Runx2和Osterix還能夠更早地誘導I丐化，而在同一時刻，當Runx2與Osterix的蛋白質水平相近時、Runx2比Osterix的蛋白質水平高時、或只表達Runx2時,I丐化效果都沒有出現(xiàn)。為了獲得Runx2比Osterix的蛋白質水平低的、共表達二者于同一細胞的效果，可以通過將含有Runx2基因的逆病毒上清液和含有Osterix基因的逆病毒顆粒上清液以I 4的比例混合共同侵染C3H10T1/2細胞。許多小分子化合物可能促進誘導成骨細胞的分化或骨的形成，例如TSA( S卩，曲古霉素)。然而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TSA處理沒有進一步促進以不同比例的蛋白質表達水平共同表達Runx2和Osterix或者只表達Runx2的C3H10T1/2間充質多功能干細胞的鈣化水平，相反卻降低了這些種細胞的鈣化水平?？紤]到成骨細胞必然同時含有Runx2和Osterix，也許由于不同的細胞內外的環(huán)境，不同的成骨細胞的Runx2和Osterix的mRNA、蛋白或者活性水平也不同，本發(fā)明人認為，TSA處理對于成骨細胞的影響有負面的作用。這提示本發(fā)明人考慮可以利用本發(fā)明所提供的建立不同細胞的方法來評價各種小分子化合物的促進和影響骨形成的能力和效果，也可以直接用作骨病治療的藥物篩選的方法。由于Runx2和Osterix的高度保守性,本發(fā)明所用的Runx2和Osterix可以來源于任何哺乳動物物種，優(yōu)選地來源于小鼠或人，最優(yōu)選來源于人。在本發(fā)明的一個實施方案中，Runx2和Osterix來源于小鼠。小鼠Runx2同人Runx2相比,在氨基酸序列的同源性為92%;在核酸序列的同源性為92% -96%。小鼠Osterix同人Osterix相比，在氨基酸序列的同源性為95% ;在核酸序列的同源性為89%。在一個方面中，可以直接給患有與成骨細胞分化相關的骨病的受試者服用本發(fā)明所述的包含Runx2蛋白和Osterix蛋白的藥物,在所述藥物中Runx2蛋白含量低于Osterix蛋白含量。例如，可以通過口服、肌肉注射或靜脈內注射和在治療處局部注射施用等等。本領域技術人員應該理解，可以有很多種常規(guī)方法達到施用的目的。
除了蛋白質水平，以一定的比例存在Runx2和Osterix基因及其表達載體也可以作為一種藥物活性成分，與其相應的蛋白質類似。本領域技術人員已知存在多種載體可以轉運這兩種基因，或存在多種表達其的表達載體。同樣地，也可以通過注射或局部施用，按照Runx2蛋白表達水平小于Osterix蛋白表達水平的比例，將Runx2基因重組構建體和Osterix基因重組構建體施用到體內或相關的病灶內。也可以制備表達Runx2蛋白水平比Osterix蛋白水平低的間充質干細胞(如,骨髓干細胞)或其它非成骨細胞(如，自體皮膚或脂肪細胞等)，這樣的重組細胞可以通過下述步驟制備分別構建Runx2基因的重組構建體和Osterix基因的重組構建體，分別用這兩種重組構建體轉染適宜的逆轉錄病毒生產細胞，分別收集逆病毒上清液，將含有Runx2基因的逆病毒上清液和含有Osterix基因的逆病毒上清液以I : M的比例混合,共同侵染間充質干細胞或其它非成骨細胞，其中M大于1，例如，I : 2、1 : 3、至I : 4甚至更低比例，從而使Runx2蛋白含量與Osterix蛋白含量的比例達到以下比例范圍內的任何一種比例即I : N，其中N大于1，例如，I 2、1 3、至I : 4甚至更低比例。本領域技術人員應該理解，在本領域中獲得這樣的重組細胞的方法有很多，例如，通過腺病毒或逆轉錄病毒 的方式，也可以通過非病毒的方式，例如，利用各種適合治療的轉染試劑進行轉染?？梢酝ㄟ^注射或局部施用的方式將上述制備的表達Runx2蛋白水平比Osterix蛋白水平低的間充質干細胞或其它非成骨細胞施用到受試者體內或病灶內來治療骨病。優(yōu)選地，所述受試者是哺乳動物，并且所述Runx2基因和Osterix基因來源于所述待治療的受試者。優(yōu)選地，所述受試者是小鼠或人，更優(yōu)選地是人。因此，當用于人受試者時，所述Runx2基因和Osterix基因優(yōu)選地來源于人。本發(fā)明所獲得的表達Runx2蛋白水平比Osterix蛋白水平低的間充質干細胞或其它非成骨細胞的方法也可以適用于組織工程骨的生產。利用本發(fā)明的方法可以加速促進組織工程骨生產。


從下面結合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中圖I是照片，顯示以相同的蛋白質水平單獨表達Runx2或Osterix于C3H10T1/2細胞中對堿性磷酸酶活性水平和鈣化水平的作用。圖IA顯示蛋白表達情況，圖IB顯示堿性磷酸酶活性的情況，圖IC顯示鈣化水平的情況。圖2是照片，顯示將Runx2和Osterix以不同比例的蛋白質表達水平共同表達于C3H10T1/2細胞中對堿性磷酸酶活性水平和鈣化水平的作用。圖2A顯示蛋白表達情況，圖2B顯示堿性磷酸酶活性的情況，圖2C顯示鈣化水平的情況。圖3是照片，顯示含有Runx2基因的逆病毒上清液和含有Osteix基因的逆病毒上情液以I : 4的比例混合共同侵染C3H10T1/2細胞后，Runx2比Osterix的蛋白質水平的比例。圖4是照片，顯示TSA處理對表達不同比例蛋白質水平的Runx2和Osterix的C3H10T1/2細胞的鈣化水平的影響。序列表說明
權利要求
1.Runx2蛋白和Osterix蛋白在制備用于預防或治療與成骨細胞分化相關的疾病的藥物組合物中的應用，在所述藥物組合物中，Runx2蛋白的含量小于Osterix蛋白的含量。
2.權利要求I所述的應用， 其中Runx2蛋白含量與Osterix蛋白含量的比例可以是在以下比例范圍內的任何一種比例即I N，其中N大于1，例如，I 2、1 3、至I : 4甚至更低比例。
3.權利要求I所述的應用，其中所述Runx2蛋白和Osterix蛋白來源于哺乳動物,優(yōu)選地來源于小鼠或人。
4.權利要求I所述的應用，其中所述與成骨細胞分化相關的疾病選自骨質疏松、骨折、成骨不全、或牙周病。
5.一種用于預防或治療與成骨細胞分化相關的疾病的藥物組合物，其包含Runx2蛋白和Osterix蛋白，并且其中Runx2蛋白的含量小于Osterix蛋白的含量,優(yōu)選地Runx2蛋白含量與Osterix蛋白含量的比例可以是在以下比例范圍內的任何一種比例S卩I N，其中N大于1，例如，I 2、1 3、至I : 4甚至更低比例。
6.Runx2基因和Osterix基因在制備用于促進成骨細胞分化的試劑盒中的應用，所述試劑盒包含Runx2基因的重組構建體和Osterix基因的重組構建體。
7.權利要求6所述的應用，其中在使用時，用所述Runx2基因的重組構建體和Osterix基因的重組構建體分別轉染適宜的逆轉錄病毒生產細胞，分別收集逆病毒上清液，將含有Runx2基因的逆病毒上清液和含有Osterix基因的逆病毒上清液以I : M的比例混合，共同侵染間充質干細胞或其它非成骨細胞，其中M大于1，例如，I : 2、1 : 3、至I : 4甚至更低比例，從而使Runx2蛋白含量與Osterix蛋白含量的比例達到以下比例范圍內的任何一種比例即I N，其中N大于1，例如，I 2、1 3、至I : 4甚至更低比例。
8.權利要求6所述的應用，其用于組織工程骨的生產和與成骨細胞分化相關疾病的基因治療。
9.一種篩選促進骨形成的藥物的方法，其包括下述步驟 (1)分別構建Runx2基因的重組構建體和Osterix基因的重組構建體； (2)利用適宜的逆轉錄病毒，用步驟(I)中的Runx2基因的重組構建體和Osterix基因的重組構建體侵染細胞，篩選下述三種單克隆重組細胞(i)其中Runx2蛋白表達水平小于Osterix蛋白表達水平，(ii)其中Runx2蛋白表達水平等于Osterix蛋白表達水平,和(iii)其中Runx2蛋白表達水平大于Osterix蛋白表達水平；和 (3)將步驟(2)篩選得到的每種細胞單獨接受或不接受待選化合物的作用，觀察Runx2蛋白表達水平和Osterix蛋白表達水平比例的變化，并結合所述比例的變化觀察分析成骨細胞分化或功能的增強或減弱，從而完成促進骨形成的藥物的篩選； 其中步驟(2)中所用的細胞選自間充質干細胞或其他非成骨細胞。
10.權利要求9所述的方法，其中所述Runx2基因和Osterix基因來源于哺乳動物，優(yōu)選來源于小鼠和人，更優(yōu)選來源于人。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過以Runx2表達水平小于Osterix的表達水平的特殊方式共表達Runx2和Osterix于間充質干細胞或其它非成骨細胞中，從而加速誘導成骨細胞的分化。本發(fā)明提供一種用于預防或治療與成骨細胞分化相關的疾病的藥物組合物，其包含Runx2蛋白和Osterix蛋白，并且其中Runx2蛋白的含量小于Osterix蛋白的含量。本發(fā)明還提供Runx2蛋白和Osterix蛋白在制備用于預防或治療與成骨細胞分化相關的疾病的藥物組合物中的應用，在所述藥物組合物中，Runx2蛋白的含量小于Osterix蛋白的含量。本發(fā)明的藥物組合物以及共表達Runx2和Osterix的特殊方式可用于治療骨質疏松、成骨不全、牙周病、骨折等骨病，也可用于組織工程骨的研發(fā)和生產。本發(fā)明還提供篩選用于骨病預防和治療的藥物的方法。
文檔編號C12Q1/02GK102895652SQ20111021120
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權日2011年7月27日
發(fā)明者劉文廣, 孟令儀, 張忠麗, 曾憲錄 申請人:東北師范大學