預(yù)防和治療糖皮質(zhì)激素藥物引起的骨病的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及預(yù)防和治療糖皮質(zhì)激素藥物引起的骨病。具體地，本發(fā)明涉及Wnt信號(hào)通路在預(yù)防/治療糖皮質(zhì)激素藥物引起的骨病中的應(yīng)用。C/EBPalpha因子在BMP2誘導(dǎo)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2向成骨細(xì)胞分化的晚期表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)該因子會(huì)抑制成骨細(xì)胞的分化；導(dǎo)致C/EBPalpha表達(dá)下調(diào)的原因是其遠(yuǎn)端啟動(dòng)子(-1286bp/-1056bp)在成骨細(xì)胞分化晚期發(fā)生了高甲基化而沉默，甲基化過程被阻斷則促使C/EBPalpha高表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致成骨/成脂肪分化失衡。本發(fā)明人通過Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型，證實(shí)了Wnt/beta-catenin信號(hào)通路對(duì)C/EBPalpha在成骨細(xì)胞分化中表達(dá)及甲基化都有重要的調(diào)控作用，而該通路的激動(dòng)劑/激活劑能挽救Dex引起的成骨/成脂分化平衡。
【專利說明】預(yù)防和治療糖皮質(zhì)激素藥物引起的骨病

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)，組織干細(xì)胞分化控制和免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及 一種fct信號(hào)通路激動(dòng)劑以及CEBPalpha抑制劑在預(yù)防/治療糖皮質(zhì)激素藥物引起的骨病 中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 地塞米松（Dexamethasone, Dex)是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素類藥物，作為免疫 反應(yīng)抑制劑在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。然而長期使用會(huì)導(dǎo)致諸如骨丟失，骨密度降低等骨 質(zhì)疏松癥狀，目前尚無有效的治療方法。
[0003] 臨床上發(fā)現(xiàn)，長期使用地塞米松（Dex)不僅會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松，而且還伴隨 著骨髓脂肪化。由于成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞都來源于同一種多能成體干細(xì)胞：骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞（BMSCs)，而且二者的分化存在一種競(jìng)爭(zhēng)性的平衡，因而骨質(zhì)疏松病人骨髓中出現(xiàn)大量 的脂肪提示BMSCs轉(zhuǎn)向脂肪細(xì)胞分化而成骨分化受到抑制。但其中具體調(diào)控機(jī)理仍不清 楚。
[0004] BMSCs的分化方向受到轉(zhuǎn)錄因子的嚴(yán)格調(diào)控。Runx2以及Osteorix(Osx)是啟動(dòng) 成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而脂肪細(xì)胞分化則受其他因子的調(diào)控和影響，但其中很多 具體機(jī)制尚不明了。
[0005] 因此本領(lǐng)域迫切需要開展地塞米松以及相關(guān)的信號(hào)通路在糖皮質(zhì)激素類藥物引 起的骨病中的機(jī)制和作用，以便提供新的有效的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供Wnt信號(hào)通路在預(yù)防/治療糖皮質(zhì)激素藥物引起的骨 病中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的另一目的就是提供C/EBPalpha在預(yù)防/治療糖皮質(zhì)激素藥物引起的骨 病中的應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種Wnt信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑的用途，它用 于制備預(yù)防或治療糖皮質(zhì)激素引起的骨病的組合物；或用于制備抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSC)分化為脂肪細(xì)胞的組合物。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為藥物組合物。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還用于促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC)分化 為骨細(xì)胞。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的骨細(xì)胞為成骨細(xì)胞。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于抑制或下調(diào)CEBPalpha的表達(dá)。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的Wnt信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑選自下組：Wnt信號(hào)通路的 beta-catenin、Wnt3a、WntlOb、Wntl6、Wnt5a、Wnt7b、氯化鋰。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖皮質(zhì)激素選自下組：地塞米松、倍他米松、潑尼松、潑尼 松龍、甲潑尼龍、曲安西龍、氫化可的松和可的松。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖皮質(zhì)激素為地塞米松。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖皮質(zhì)激素引起的骨病選自下組：骨質(zhì)疏松、骨髓脂肪 化、和股骨頭壞死。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的骨病為骨質(zhì)疏松。
[0018] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種fct信號(hào)通路抑制劑的用途，它被用于制備調(diào) 節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平衡的組合物；或用于制備抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC)分化 為脂肪細(xì)胞的組合物。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的Wnt信號(hào)通路抑制劑選自下組：siRNA、抗體、shRNA、 RNAi, IWR-UDKKlo
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為藥物組合物。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于促進(jìn)或上調(diào)CEBPalpha的表達(dá)。
[0022] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的 載體和有效量的活性成分，其中所述的活性成分為fct信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑或Wnt信 號(hào)通路抑制劑。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥學(xué)上可接受的載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
[0024] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外非治療性的調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平 衡的方法，包括步驟：在fct信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑或Wnt信號(hào)通路抑制劑存在的條件 下，培養(yǎng)所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平衡。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為：成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì) 胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、或脂肪細(xì) 胞。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，在BMP2和Wnt信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑存在的條件下，培養(yǎng)所 述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從而使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨細(xì)胞。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，在BMP2和Wnt信號(hào)通路抑制劑存在的條件下，培養(yǎng)所述的骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞，從而使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。
[0029] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種CEBPalpha抑制劑的用途，它被用于制備預(yù)防 或治療糖皮質(zhì)激素引起的骨病的藥物組合物。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還用于促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC)分化 為骨細(xì)胞。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的骨細(xì)胞為成骨細(xì)胞。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖皮質(zhì)激素選自下組：地塞米松、倍他米松、潑尼松、潑尼 松龍、甲潑尼龍、曲安西龍、氫化可的松和可的松。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖皮質(zhì)激素引起的骨病選自下組：骨質(zhì)疏松、骨髓脂肪 化、股骨頭壞死。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的CEBPalpha抑制劑包括抑制CEBPalpha基因（CEBPA)轉(zhuǎn) 錄的RNAi，CEBPalpha基因的甲基化促進(jìn)劑、或抑制CEBPalpha蛋白功能的抑制劑。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的CEBPalpha抑制劑選自：抑制CEBPalpha基因轉(zhuǎn)錄的 shRNA、CEBPalpha基因的siRNA、CEBPalpha基因的甲基化促進(jìn)劑、樺木酸、或抗CEBPalpha 的抗體。
[0036] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種CEBPalpha或其促進(jìn)劑的用途，它被用于制備 調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平衡的組合物；或用于制備抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC)分 化為脂肪細(xì)胞的組合物。
[0037] 在本發(fā)明的第七方面，提供了一種體外非治療性的調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平 衡的方法，包括步驟：在CEBPalpha或其促進(jìn)劑存在的條件下，或在CEBPalpha抑制劑存在 的條件下培養(yǎng)所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平衡。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，在BMP2和CEBPalpha抑制劑存在的條件下，培養(yǎng)所述的骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞，從而使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨細(xì)胞。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，在BMP2和CEBPalpha或其促進(jìn)劑存在的條件下，培養(yǎng)所述的骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從而使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。
[0040] 在本發(fā)明的第八方面，提供了一種預(yù)防或治療糖皮質(zhì)激素引起的骨病或抑制骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC)分化為脂肪細(xì)胞的方法，包括步驟：給需要
[0041] 在CEBPalpha或其促進(jìn)劑存在的條件下，或在CEBPalpha抑制劑存在的條件下培 養(yǎng)所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平衡。
[0042] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的 本發(fā)明范圍。
[0044] 圖1顯示，Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠骨髓脂肪化；6周雄性C57BL6J小鼠經(jīng)Dex皮 下注射5周后，microCT檢測(cè)到小鼠股骨丟失（圖1A);骨密度（BMD)、骨量比值（BV/TV)、小 梁厚度（Tb.Th)、小梁數(shù)（Tb.N)下降，小梁間隙（Tb.Sp)增加（圖1B);組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Dex 小鼠股骨骨髓中出現(xiàn)大量脂肪顆粒（圖1C)。
[0045] 圖2顯示，Dex抑制成骨細(xì)胞分化，抑制脂肪細(xì)胞分化；圖2A顯示，Dex鼠及對(duì)照鼠 的BMSCs體外經(jīng)BMP2誘導(dǎo)分化不同時(shí)間點(diǎn)成骨相關(guān)基因（0sx、Collal及Ocn)與脂肪相關(guān) 基因（aP2及Glut4)的表達(dá)情況；圖2B顯示，Dex鼠及對(duì)照鼠的BMSCs經(jīng)BMP2誘導(dǎo)21天后 轉(zhuǎn)而成脂IFMD誘導(dǎo)8天，脂肪相關(guān)基因 aP2及Glut4在Dex鼠 BMSCs中仍高表達(dá)，油紅0染 色顯示Dex鼠 BMSCs大部分已轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞；圖2C顯示，Dex抑制BMP2對(duì)C3H10T1/2 的成骨誘導(dǎo)，促進(jìn)脂肪基因的高表達(dá)；圖2D顯示，不同濃度Dex處理的細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分 化能力的比較，油紅〇染色顯示10-6M Dex下大部分細(xì)胞已分化為脂肪細(xì)胞。
[0046] 圖3顯示，Dex抑制C/EBPalpha啟動(dòng)子的甲基化而促進(jìn)其表達(dá)；圖3A顯示，BMP2 誘導(dǎo)Dex鼠及對(duì)照鼠的BMSCs成骨分化過程中C/EBPalpha的mRNA及蛋白水平；圖3B顯示， C3H10T1/2細(xì)胞經(jīng)BMP2或BMP2與Dex同時(shí)處理不同時(shí)間點(diǎn)C/EBPalpha的mRNA及蛋白水 平；圖3C顯示，C/EBPalpha在Dex鼠及對(duì)照鼠股骨中的表達(dá)情況；圖3D顯示，兩組BMSCs經(jīng) BMP2誘導(dǎo)21天后C/EBPalpha啟動(dòng)子的甲基化水平，C3H10T1/2經(jīng)BMP2或BMP2及Dex處理 21天后C/EBPalpha啟動(dòng)子的甲基化水平的比較；圖3E顯示，C3H10T1/2細(xì)胞處理21天后 Dnmt3a/3b的蛋白水平；圖3F顯示，C3H10T1/2細(xì)胞處理21天后Dnmt3a/3b對(duì)C/EBPalpha 啟動(dòng)子的結(jié)合情況。
[0047] 圖4顯示shRNA沉默C/EBPalpha挽救了 Dex對(duì)BMSCs分化的影響；圖4A顯示， shRNA沉默效果檢測(cè)；圖4B顯示，Dex鼠 BMSCs中沉默C/EBPalpha后再進(jìn)行BMP2誘導(dǎo)到不 同時(shí)間點(diǎn)成骨及脂肪相關(guān)基因表達(dá)水平；圖4C，圖4D顯示Dex鼠 BMSCs中沉默C/EBPalpha 后的轉(zhuǎn)分化能力檢測(cè)。
[0048] 圖5顯示，Wnt通路被Dex抑制；圖5A顯示，Dex鼠與對(duì)照鼠骨組織中活性 beta-catenin水平；圖5B顯不，C3H10T1/2在不同處理下的活性beta-catenin水平；圖5C 顯示，C3H10T1/2在不同處理下Wnt靶基因 Axin2及CyclinDl，以及Wnt抑制劑DKK1的表 達(dá)水平；圖5D顯示，C3H10T1/2中以IWR-1抑制Wnt通路后BMP2再誘導(dǎo)21天后成骨及脂 肪相關(guān)基因的表達(dá)水平；圖5E顯示，C3H10T1/2中以IWR-1抑制Wnt通路后細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化 能力；圖5F顯示，C3H10T1/2中以IWR-1抑制Wnt通路后C/EBPalpha的甲基化水平。
[0049] 圖6顯示，LiCl激活Wnt通路挽救了 Dex的效應(yīng)；圖6A顯示，Dex鼠 BMSCs經(jīng)LiCl 處理不同的時(shí)間點(diǎn)成骨及脂肪相關(guān)基因的表達(dá)水平；圖6B顯示，Dex鼠 BMSCs經(jīng)LiCl處理 后的轉(zhuǎn)分化能力；圖6C顯示，C3H10T1/2處理后的成骨及脂肪相關(guān)基因的表達(dá)水平；圖6D 顯示，C3H10T1/2處理后的轉(zhuǎn)分化能力；圖6E顯示，Dex鼠 BMSCs及C3H10T1/2經(jīng)處理21天 后C/EBPalpha啟動(dòng)子甲基化水平；圖6F顯示，C3H10T1/2處理21天后Dnmt3a/3b的蛋白 水平；圖6G顯示，C3H10T1/2處理21天后Dnmt3a/3b對(duì)C/EBPalpha啟動(dòng)子的結(jié)合；圖6H 顯示，Dex誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松機(jī)制總結(jié)。

【具體實(shí)施方式】
[0050] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，在成功建立Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠模型的基 礎(chǔ)上，首次意外地發(fā)現(xiàn)該小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs)在BMP2的誘導(dǎo)下也更容易分化 為脂肪細(xì)胞，并且脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPalpha啟動(dòng)子甲基化被抑制，導(dǎo)致該因子在體 內(nèi)外高度表達(dá)。在骨質(zhì)疏松的BMSCs中沉默C/EBPalpha因子，能挽救其成骨分化能力，表 明Dex促進(jìn)脂肪分化而抑制成骨分化是通過抑制C/EBPalpha啟動(dòng)子的甲基化而促進(jìn)其表 達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)。發(fā)明人進(jìn)而發(fā)現(xiàn)fct/beta-catenin通路也參與到C/EBPalpha甲基化的調(diào) 節(jié)中。在骨質(zhì)疏松小鼠的BMSCs中激活Wnt/beta-catenin通路可以將C/EBPalpha啟動(dòng)子 重新甲基化而下調(diào)其表達(dá)水平，進(jìn)而挽救了 Dex導(dǎo)致的BMSCs分化失衡。本發(fā)明探明了 Dex 誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的機(jī)制以及fct信號(hào)通路在其中的作用，為該類疾病提供了新的有效的預(yù) 防/治療靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0051] 術(shù)語
[0052] 糖皮質(zhì)激素
[0053] 如本發(fā)明所用，術(shù)語"糖皮質(zhì)激素"，"Glucocorticoid"，"腎上腺皮質(zhì)激素"、或"糖 皮質(zhì)激素藥物"相同，可以互換使用。
[0054] 糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類留體激素，目前也可由化學(xué)方法人工合 成。糖皮質(zhì)激素可用于一般的抗生素或消炎藥所不及的病癥，如SARS、敗血癥等，具有調(diào)節(jié) 糖、脂肪、蛋白質(zhì)的生物合成和代謝的作用，還具有抗炎作用。
[0055] 糖皮質(zhì)激素的基本結(jié)構(gòu)特征包括，腎上腺皮質(zhì)激素所具有的C3的羰基、Λ 4和17 β 酮醇側(cè)鏈，以及糖皮質(zhì)激素獨(dú)有的17 α -0Η和11 β -0Η。代表性的糖皮質(zhì)激素例子包括（但 并不限于）：地塞米松、倍他米松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、曲安西龍、氫化可的松和可 的松。
[0056] 糖皮質(zhì)激素的藥理作用主要有：抗炎作用，免疫抑制作用，抗毒素作用，抗休克作 用，影響造血系統(tǒng)，中樞興奮作用，促進(jìn)胃酸分泌，抑制松果體褪黑素的分泌，減少甲狀腺對(duì) 碘離子的攝取清除和轉(zhuǎn)化等。
[0057] 然而，一類與使用糖皮質(zhì)激素藥物相關(guān)的常見副作用是會(huì)導(dǎo)致不利的骨病，其中 包括（但并不限于）：骨質(zhì)疏松、骨髓脂肪化、股骨頭壞死。
[0058] 地塞米松
[0059] 如本發(fā)明所用，術(shù)語"地塞米松"，"Dexamethasone"，"氟美松"，"氟甲強(qiáng)地松龍"， "德沙美松"，以及"DEX"含義相同，可以互換使用。
[0060] 地塞米松是一種人工合成的腎上腺皮質(zhì)激素，其衍生物有氫化可地松、潑尼松等， 具有抗炎、抗內(nèi)毒素、抑制免疫、抗休克及增強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)等藥理作用，廣泛應(yīng)用于各科治療 多種疾病，如自身免疫性疾病，過敏，炎癥，哮喘，及皮膚科、眼科疾病。
[0061] 地塞米松的藥理作用主要包括：抗炎作用和免疫抑制作用?？寡鬃饔帽憩F(xiàn)在，減輕 和防止組織對(duì)炎癥的反應(yīng)，抑制巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞在炎癥部位的集聚，抑制吞噬作用、溶酶 體酶的釋放以及炎癥化學(xué)中介物的合成和釋放，減輕和防止組織對(duì)炎癥的反應(yīng)，從而減輕 炎癥的表現(xiàn)。其免疫抑制作用表現(xiàn)在：防止或抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，延遲性的過敏反 應(yīng)，減少T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞的數(shù)目，降低免疫球蛋白與細(xì)胞表面受體的結(jié) 合能力，抑制白介素的合成與釋放，降低T淋巴細(xì)胞向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并輕原發(fā)免疫反應(yīng) 的擴(kuò)展；可降低免疫復(fù)合物通過基底膜，并能減少補(bǔ)體成份及免疫球蛋白的濃度。
[0062] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其分化
[0063] 如本發(fā)明所用，術(shù)語"骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞"，"bone marrow stem cell"，以及 "BMSC"含義相同，因此可以互換使用。
[0064] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種存在于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有定向或多向分化的 潛能。BMSC源于中胚層，存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，其中以骨髓中含量最為豐富， 是骨髓中的非造血干細(xì)胞，同時(shí)它也是骨髓中的造血結(jié)構(gòu)性和功能性支持細(xì)胞，因此又被 稱為骨髓基質(zhì)細(xì)胞。BMSC在骨髓中含量極少，僅占骨髓細(xì)胞比例的1/100-1/10000。BMSC 外觀呈梭形、漩渦狀生長，具有很強(qiáng)的自我復(fù)制和橫向分化潛能，在體外特定的誘導(dǎo)條件下 可分化為骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪、肌肉及肝等多種功能細(xì)胞，對(duì)間質(zhì)組織如骨、軟骨、肌鍵、月旨 肪和骨髓基質(zhì)的再生也有重要作用。
[0065] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性，可以多向分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪 細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，及肝細(xì)胞等間葉細(xì)胞和其他胚層細(xì)胞。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員可以使用常規(guī)的通用方法對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行不同方向的分化處理。一種優(yōu)選的 實(shí)施方式為：用抗氧化劑作誘導(dǎo)劑，如：2_琉基乙醇（2-ME)、2%二甲基亞礬（DMS0)、硫代甘 油。另一種優(yōu)選的實(shí)施方式是用生長因子作誘導(dǎo)劑，如：血小板衍生生長因子（PDGF)，表皮 生長因子，肝細(xì)胞生長因子（PGF)和胰導(dǎo)素樣生長因子。在地塞米松處理的條件下BMSC可 轉(zhuǎn)化為骨、軟骨和脂肪細(xì)胞。
[0066] Wnt信號(hào)通路
[0067] Wnt是一個(gè)富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白家族，包括多個(gè)家族成員，如Wnt3a、 Wntl0b、Wntl6、Wnt5a、Wnt7b等。Wnt分子在多種組織中都有表達(dá)，并對(duì)細(xì)胞分裂、分化、組 織發(fā)育及腫瘤發(fā)生都具有重要的調(diào)控作用。fct信號(hào)通路可分為經(jīng)典途徑與非經(jīng)典途徑。 其中經(jīng)典Wnt通路為Wnt - Fzl/LRP5/5 - β -catenin - TCF/LEF ;非經(jīng)典通路主要有兩條， 分別為 fct/Ca2+通路，即 Wnt - Fzl-G 蛋白一Ca2+- PKC/CaMK II /CaN - NFAT ;以及影響細(xì) 胞形狀與極性的Wnt/RhoA通路[22]。
[0068] Wnt信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑
[0069] 小分子化合物如氯化鋰（LiCl)能抑制Wnt負(fù)調(diào)控蛋白GSK_3beta而激活Wnt通 路。該藥物最早用于治療狂躁和抑郁交替發(fā)作的雙相情感性精神障礙。后來發(fā)現(xiàn)該藥物對(duì) Wnt經(jīng)典通路（Wnt/beta-catenin通路）有較強(qiáng)的激活作用。此外Wnt激活劑/激動(dòng)劑還 有經(jīng)典通路的Wnt小分子蛋白如Wnt3a、Wntl0b，通過和Wnt受體結(jié)合而激活該通路。過表 達(dá)Wnt通路中的效應(yīng)分子beta-catenin能不通過Wnt通路上游信號(hào)的傳遞而直接發(fā)揮Wnt 通路的效應(yīng)。
[0070] Wnt信號(hào)通路抑制劑
[0071] 在本發(fā)明中，Wnt信號(hào)通路抑制劑包括各種能抑制Wnt經(jīng)典通路（Wnt/ beta-catenin通路）的小分子化合物、重組蛋白、單抗及RNAi制品，其祀點(diǎn)可以是Wnt分泌 蛋白，信號(hào)通路中間分子，效應(yīng)蛋白等。
[0072] 小分子化合物IWR-1作用于Wnt受體FZD，阻止Wnt信號(hào)的傳遞；細(xì)胞分泌的小分 子蛋白DKK1與Wnt競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體而抑制Wnt通路；針對(duì)Wnt小分子蛋白（Wnt3a、Wntl0b 等）的單抗能拮抗Wnt分子與受體的結(jié)合；促進(jìn)GSK_3beta的化合物導(dǎo)致beta-catenin降 解；針對(duì) beta-catenin 的 siRNA、shRNA 及 microRNA 等降低 beta-catenin 的蛋白水平，都 能有效抑制Wnt通路。
[0073] 藥物組合物
[0074] 本發(fā)明提供了一種藥物組合物，，包括藥學(xué)上可接受的載體和有效量的活性成分， 其中所述的活性成分為fct信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑或Wnt信號(hào)通路抑制劑。
[0075] 如本文所用，術(shù)語"有效量"或"有效劑量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活 性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。
[0076] 如本文所用，"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良 副反應(yīng)（如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)）的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語"藥學(xué)上 可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0077] 本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明的活性成分以及藥學(xué)上可接受的 載體。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。載 體的選擇應(yīng)與給藥方式相匹配，這些都是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。
[0078] 通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物的劑型為注射劑、口服 制劑（片劑、膠囊、口服液）、透皮劑、緩釋劑。例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的 水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。
[0079] 本發(fā)明所述的活性成分的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等 而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定（例如通 過臨床試驗(yàn)）。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利 用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給 藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的活性成分每天以約0. 00001mg-50mg/kg動(dòng)物體重（較佳的 0. 0001mg-10mg/kg動(dòng)物體重）的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫 切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。
[0080] 應(yīng)用
[0081] 本發(fā)明還提供了體外非治療性的調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平衡的方法，在fct 信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑或fct信號(hào)通路抑制劑存在的條件下，培養(yǎng)所述的骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平衡。
[0082] 優(yōu)選地，所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特定分化為：成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心 肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，肝細(xì)胞等。
[0083] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0084] (1)本發(fā)明在小鼠中建立了 Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型，模型鼠中BMSCs在體外成骨 誘導(dǎo)中確實(shí)更容易分化為脂肪細(xì)胞；
[0085] (2)C/EBPalpha因子在模型中高表達(dá)，且在成骨分化誘導(dǎo)晚期其啟動(dòng)子也維持著 低甲基化的水平；
[0086] (3)Wnt/beta_catenin信號(hào)通路對(duì)C/EBPalpha在成骨細(xì)胞分化中表達(dá)及甲基化 都有重要的調(diào)控作用；
[0087] (4)Wnt/beta_catenin信號(hào)通路的激活劑LiCl能挽救Dex引起的成骨/成脂分化 平衡。
[0088] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)。
[0089] 實(shí)施例1
[0090] Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型的建立
[0091] 為探索Dex導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松的機(jī)制，在本實(shí)施例中，發(fā)明人首先建立了 Dex誘導(dǎo)的 小鼠骨質(zhì)疏松模型。6-8周小鼠經(jīng)Dex皮下給藥5周后，股骨用于microCT的分析。
[0092] 結(jié)果顯示，經(jīng)Dex處理的小鼠骨密度及骨量降低，骨小梁減少，呈明顯的骨丟失表 型（圖1A，圖1B)。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)和對(duì)照鼠相比，Dex給藥的小鼠不僅骨小梁密度降低， 骨髓中出現(xiàn)大量脂肪（圖1C)，與臨床表型一致。
[0093] 實(shí)施例2
[0094] Dex抑制成骨細(xì)胞分化，并提高BMSCs向脂肪細(xì)胞分化的潛能
[0095] 為檢測(cè)Dex處理小鼠的BMSCs分化能力是否發(fā)生改變，本發(fā)明人從Dex鼠及對(duì)照 鼠中分離了原代BMSCs，并在體外培養(yǎng)進(jìn)行BMP2誘導(dǎo)的成骨分化能力檢測(cè)。兩組BMSCs經(jīng) BMP2誘導(dǎo)，在不同的時(shí)間點(diǎn)（3天、7天、14天、21天）檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)情況來 判斷成骨分化的能力。
[0096] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dex鼠的BMSCs在BMP2誘導(dǎo)的不同時(shí)間點(diǎn)，成骨分化的marker基因 Osteorix(Osx)，I 型膠原（Collagen type I，Collal)及骨|丐素（Osteocalcin, Ocn)都低 表達(dá)，而在正常的BMSCs中這些基因都隨著BMP2的誘導(dǎo)表達(dá)上升（圖2A)。相反的，脂肪細(xì) 胞分化的相關(guān)基因 aP2和Glut4在Dex鼠 BMSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中都高度表達(dá)（圖 2A)。結(jié)果說明，與正常BMSCs相比，Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠的BMSCs成骨分化受到抑制， 而轉(zhuǎn)向脂肪細(xì)胞分化。
[0097] 為進(jìn)一步驗(yàn)證Dex小鼠的BMSCs的分化潛能已被改變，本發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了轉(zhuǎn) 分化實(shí)驗(yàn)。兩組BMSCs經(jīng)BMP2成骨誘導(dǎo)21天后，轉(zhuǎn)向IFMD誘導(dǎo)的脂肪分化。正常的BMSCs 在BMP2下誘導(dǎo)21天后，成脂誘導(dǎo)液IFMD下脂肪相關(guān)基因 aP2與Glut4也低表達(dá)，細(xì)胞不 會(huì)轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞。而Dex小鼠的BMSCs在BMP2誘導(dǎo)21天后，IFMD仍能誘導(dǎo)脂肪相關(guān) 基因高水平的表達(dá)，且大部分細(xì)胞都轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞（圖2B)，說明成骨/成脂肪分化平 衡已經(jīng)被破壞。
[0098] 進(jìn)一步地，本發(fā)明人用小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。 C3H10Tl/2(小鼠胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞系，購自美國ATCC)在BMP2誘導(dǎo)下能分化為成骨細(xì)胞， 成骨相關(guān)基因都高表達(dá)；而與De X(l(T6M)同時(shí)作用時(shí)，BMP2對(duì)成骨相關(guān)基因的誘導(dǎo)性下降， 導(dǎo)致這些基因一直地水平表達(dá)。同時(shí)，與Dex小鼠的BMSCs類似，Dex作用下脂肪細(xì)胞相關(guān) 基因 aP2與Glut4高表達(dá)（圖2C)。另外，Dex與BMP2同時(shí)處理的C3H10T1/2細(xì)胞在成骨 分化晚期時(shí)也能被IFMD誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞，且這種脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力隨Dex濃度的增加 而提高，相比之下BMP2單獨(dú)處理的細(xì)胞則不能（圖2D)。上述結(jié)果與原代BMSCs類似，說明 長期高濃度的Dex抑制了成骨細(xì)胞的分化，將BMSCs轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞，導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)量 下降，成骨能力減弱，而脂肪細(xì)胞數(shù)量增加。
[0099] 實(shí)施例3
[0100] 在Dex處理下，C/EBPalpha因子高表達(dá)
[0101] 前期發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPalpha在成骨細(xì)胞分化中表達(dá)下 調(diào)，它的過表達(dá)能破壞成骨/成脂的分化平衡。在骨質(zhì)疏松模型中發(fā)現(xiàn)，BMSCs成骨/成脂 分化平衡已經(jīng)被Dex破壞，本實(shí)施例用于檢測(cè)C/EBPalpha表達(dá)水平的改變情況。
[0102] 首先，發(fā)明人在原代BMSCs及C3H10T1/2細(xì)胞中都對(duì)C/EBPalpha的水平進(jìn)行檢 測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C/EBPalpha因子的mRNA及蛋白水平在Dex鼠的BMSCs中（圖3A)以及Dex 處理的C3H10T1/2中（圖3B)都明顯高于對(duì)照，且在21天的成骨分化中都維持著這種高水 平。免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Dex小鼠體內(nèi)骨髓腔中C/EBPalpha的蛋白水平也明顯比正常小鼠 商（圖3C)。
[0103] 由于DNA甲基化是調(diào)控C/EBPalpha表達(dá)的主要分子機(jī)制，前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該因 子在成骨分化晚期由于啟動(dòng)子高甲基化而沉默，因而模型中檢測(cè)到的高水平的C/EBPalpha 表面其啟動(dòng)子甲基化被抑制。
[0104] 進(jìn)一步地，發(fā)明人在Dex鼠及對(duì)照鼠的BMSCs中檢測(cè)了 C/EBPalpha的啟動(dòng)子甲基 化水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照BMSCs中的高甲基化水平相比，Dex鼠 BMSCs在BMP2誘導(dǎo)21天后C/ EBPalpha啟動(dòng)子幾乎不甲基化，與其高表達(dá)水平一直。在C3H10T1/2的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，Dex 抑制了 BMP2誘導(dǎo)的C/EBPalpha啟動(dòng)子甲基化（圖3D)。
[0105] 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Dex并不影響DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a及3b的蛋白水平（圖3E)，但 能抑制其對(duì)C/EBPalpha啟動(dòng)子的結(jié)合（圖3F)，因而抑制了后者的甲基化。
[0106] 實(shí)施例4
[0107] 沉默C/EBPalpha能夠挽救Dex對(duì)BMSCs的分化改變
[0108] 為進(jìn)一步探索高表達(dá)的C/EBPalpha在Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松中的作用，發(fā)明人用 shRNA(短發(fā)卡 RNA，5' -TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3' SEQ ID NO. : 1)將其在 Dex 鼠的 BMSCs 中沉默。Western blot證實(shí)了 shRNA的沉默效果后（圖4A)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BMSCs進(jìn)行BMP2 誘導(dǎo)的成骨分化檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C/EBPalpha沉默后，成骨相關(guān)基因表達(dá)有所上升，而脂肪 相關(guān)基因表達(dá)受到抑制（圖4B)，同時(shí)BMSCs經(jīng)BMP2誘導(dǎo)后不再向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，即Dex 鼠BMSCs分化潛能得到了恢復(fù)（圖4C，圖4D)。
[0109] 結(jié)果說明，Dex轉(zhuǎn)變BMSCs向成骨/成脂的分化平衡是通過提高C/EBPalpha的表 達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)。
[0110] 實(shí)施例5
[0111] Wnt/beta-catenin信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)C/EBPalpha的甲基化沉默
[0112] Wnt/beta-catenin信號(hào)通路是成骨細(xì)胞分化中最重要的調(diào)節(jié)信號(hào)之一。在本實(shí)施 例中，發(fā)明人在Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型中檢測(cè)了該通路的活性。
[0113] 免疫組化結(jié)果顯示，Dex小鼠的股骨腔內(nèi)活性beta-catenin水平明顯低于對(duì)照鼠 (圖5A);而在體外培養(yǎng)的C3H10T1/2中，Dex也顯著下調(diào)活性beta-catenin的蛋白水平 (圖5B)，以及Wnt靶基因Axin2及CyclinDl，而促進(jìn)Wnt抑制因子DKK1的高表達(dá)（圖5C)。 這些結(jié)果說明fct/beta-catenin信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松模型中被Dex嚴(yán)重抑制。
[0114] 接下來以Wnt通路的小分子抑制劑IWR-1處理C3H10T1/2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)將Wnt/ beta-catenin通路抑制后，BMP2下成骨相關(guān)基因也維持低表達(dá)水平，而脂肪相關(guān)基因包 括C/EBPalpha則高表達(dá)（圖;同時(shí)細(xì)胞也能夠轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞（圖5E)，而且C/ EBPalpha啟動(dòng)子甲基化也被抑制（圖5F)，與Dex處理的細(xì)胞類似。
[0115] 這些結(jié)果說明，該通路是BMP2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，建立成骨/成脂分化平衡及C/ EBPalpha啟動(dòng)子甲基化過程中不可缺少的，而Dex通過上調(diào)C/EBPalpha的表達(dá)而改變?cè)撈?衡，是通過抑制fct/beta-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
[0116] 實(shí)施例6
[0117] Wnt激活劑LiCl能挽救Dex的效應(yīng)
[0118] 上述實(shí)施例的結(jié)果說明，Wnt/beta-catenin信號(hào)通路在Dex下游作用，而Dex通 過抑制該通路來破壞成骨/成脂分化的平衡。
[0119] 在本實(shí)施例中，用LiCl處理Dex鼠的BMSCs及Dex處理的C3H10T1/2,檢測(cè)Dex的 效應(yīng)是否能被挽救。20mM LiCl與BMP2同時(shí)處理Dex鼠的BMSCs，發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因表達(dá) 得到了部分上調(diào)，特別是〇sx及〇cn;而脂肪相關(guān)基因的高表達(dá)則被顯著抑制（圖6A);處 理21天后的細(xì)胞不會(huì)再被IFMD誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞（圖6B);更重要的是C/EBPalpha 啟動(dòng)子甲基化得到了恢復(fù)（圖6E)。C3H10T1/2細(xì)胞中的結(jié)果類似，LiCl能逆轉(zhuǎn)Dex下低 表達(dá)的成骨基因及高表達(dá)的脂肪基因（圖6C)，抑制細(xì)胞易向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力（圖 6D)，并挽救了 C/EBPalpha啟動(dòng)子的甲基化水平（圖6E)。同樣，LiCl在不改變Dnmt3a/3b 的蛋白水平（圖6F)，但能恢復(fù)二者對(duì)C/EBPalpha啟動(dòng)子的結(jié)合（圖6G)，因而也恢復(fù)了 C/ EBPalpha啟動(dòng)子的甲基化水平。
[0120] 討論
[0121] 目前的研究發(fā)現(xiàn)Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制如下：（l)DeX能抑制成骨細(xì)胞的 增殖并促使其凋亡；（2) Dex促進(jìn)破骨細(xì)胞的數(shù)量并促進(jìn)骨吸收。但現(xiàn)在仍不知道骨髓中出 現(xiàn)的大量脂肪的具體機(jī)制。
[0122] 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的BMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)更容易分化為脂肪細(xì)胞而非成骨細(xì) 胞，提示Dex同樣可能抑制BMSCs向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)其成脂分化，因而降低了成骨細(xì)胞 的數(shù)量而導(dǎo)致大量的骨髓脂肪出現(xiàn)。
[0123] 在本發(fā)明的小鼠模型中，也同樣觀察到了骨丟失及骨髓脂肪的增加。體外培養(yǎng)的 BMSCs也高表達(dá)脂肪相關(guān)基因，且更容易分化為脂肪細(xì)胞，這些結(jié)果說明，長期接受Dex而 造成骨質(zhì)疏松的小鼠的BMSCs向成骨/成脂的分化平衡已經(jīng)被改變，更傾向于脂肪細(xì)胞分 化。
[0124] 成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞來源于同一種干細(xì)胞，而其分化命運(yùn)選擇及決定的機(jī)制一直 都是研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)在對(duì)表觀遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞分化命運(yùn)的決定是基于全基因組 范圍內(nèi)的表觀修飾狀態(tài)，而在起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子的基因上的表觀修飾則更加重 要。前期研究發(fā)現(xiàn)，C/EBPalpha啟動(dòng)子甲基化沉默是BMSCs向成骨細(xì)胞不可逆分化的先決 條件之一。一旦甲基化模式建立，成骨細(xì)胞則不會(huì)再轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞。本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn) Dex誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠的BMSCs中C/EBPalpha高度表達(dá)，且在BMP2誘導(dǎo)成骨分化晚期其 啟動(dòng)子也一直不甲基化，導(dǎo)致該因子的持續(xù)高表達(dá)。以shRNA沉默C/EBPalpha后能重新建 立Dex鼠 BMSCs向成骨/成脂的分化平衡，更進(jìn)一步的說明該因子在BMSCs分化命運(yùn)決定 及成骨細(xì)胞不可逆分化中的作用。
[0125] 低濃度糖皮質(zhì)激素在體內(nèi)外都對(duì)成骨細(xì)胞分化有益，1(Γ9Μ?10_8M的Dex更是對(duì) 體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化必須。而C3H10T1/2的轉(zhuǎn)分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度De X(10_6M?10_7M) 處理的細(xì)胞有更高的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化能力，而低濃度Dex處理的細(xì)胞則不容易向脂肪細(xì)胞 轉(zhuǎn)分化。且Dex對(duì)成骨相關(guān)基因的抑制及C/EBPalpha的表達(dá)促進(jìn)在早期（3天）不明顯， 而是隨著處理時(shí)間的延長才越來越明顯，說明Dex的計(jì)量及時(shí)間效應(yīng)。
[0126] 本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，Dex通過以下機(jī)制抑制Wnt/beta-catenin通路：（1)激活 GSK3-beta 而促進(jìn) beta-catenin 的降解；（2)上調(diào) Wnt 抑制劑 DKK1 及 SFRP ; (3)抑制 Wnt 轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF的激活。本發(fā)明的骨質(zhì)疏松模型證實(shí)，該通路在體內(nèi)外都被Dex抑制。由 于該通路能抑制脂肪細(xì)胞分化，Dex下上調(diào)的脂肪細(xì)胞相關(guān)基因包括C/EBPalpha的表達(dá)也 可能是這條通路被抑制了。發(fā)明人在BMP2誘導(dǎo)的C3H10T1/2成骨分化中抑制了 Wnt通路， 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的表型與Dex處理類似，包括C/EBPalpha啟動(dòng)子甲基化的抑制，說明該通路在成 骨/成脂分化平衡中的重要調(diào)控作用，是BMP2下成骨細(xì)胞命運(yùn)決定及不可逆分化中所必須 的。以LiCl激活Wnt信號(hào)后可以恢復(fù)C/EBPalpha啟動(dòng)子甲基化水平而抑制其高表達(dá)，從 而挽救Dex鼠 BMSCs以及Dex處理的C3H10T1/2的分化能力，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，重新建立 成骨/成脂的分化平衡，提示該信號(hào)通路可以作為治療此類骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)，抑制長期使 用Dex而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)BMSCs的成脂分化潛能而促進(jìn)其成骨能力，提高骨形成。
[0127] 因此，綜上所述（圖6H)，本發(fā)明人認(rèn)為，Dex誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的新機(jī)制為：Dex打破 了 BMSCs向成骨/成脂分化的平衡，促進(jìn)成脂肪的分化而抑制成骨分化，導(dǎo)致骨髓脂肪化 而成骨能力減弱；由于C/EBPalpha啟動(dòng)子在BMP2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化晚期高度甲基化是 成骨細(xì)胞不可逆分化的先決條件之一，Dex通過抑制Wnt/beta-catenin通路而干擾了 C/ EBPalpha啟動(dòng)子的甲基化，導(dǎo)致該因子在成骨細(xì)胞分化中高水平表達(dá)，使原本應(yīng)分化為成 骨細(xì)胞的BMSCs轉(zhuǎn)而分化為脂肪細(xì)胞。本發(fā)明結(jié)果表明，重新激活Wnt通路，在高濃度Dex 下建立C/EBPalpha啟動(dòng)子高甲基化水平而下調(diào)其表達(dá)水平，或以C/EBPalpha的抑制劑如 shRNA、siRNA、樺木酸（參見：ChemBioChem，13 卷 302-307 頁）等抑制 C/EBPalpha 的表達(dá) 或活性，可能成為治療此類骨質(zhì)疏松的新思路。
[0128] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
[0001] 序列表 <110、中R科學(xué)院上海牛命科學(xué)研究院 <120〉預(yù)防和治療糖皮質(zhì)激素藥物引起的骨病 <130> P2013-0202 <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> miscfeature <223>寡核ff酸 <400> 1 ttctccgaac gtgtcacgtt. tc 22
【權(quán)利要求】
1. 一種Wnt信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療糖皮質(zhì) 激素引起的骨病的組合物；或用于制備抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC)分化為脂肪細(xì)胞的 組合物； 較佳地，所述的組合物為藥物組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖皮質(zhì)激素選自下組：地塞米松、倍 他米松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、曲安西龍、氫化可的松和可的松。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖皮質(zhì)激素引起的骨病選自下組：骨 質(zhì)疏松、骨髓脂肪化、股骨頭壞死。
4. 一種Wnt信號(hào)通路抑制劑的用途，其特征在于，用于制備調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分 化平衡的組合物；或用于制備抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC)分化為脂肪細(xì)胞的組合物。
5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Wnt信號(hào)通路抑制劑選自下組： siRNA、抗體、shRNA、RNAi、IWR-1、DKK1。
6. -種藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體和有效量的活性成分，其中 所述的活性成分為fct信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑或Wnt信號(hào)通路抑制劑。
7. -種體外非治療性的調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平衡的方法，其特征在于，包括步 驟：在Wnt信號(hào)通路激活劑/激動(dòng)劑或Wnt信號(hào)通路抑制劑存在的條件下，培養(yǎng)所述的骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化平衡。
8. -種CEBPalpha抑制劑的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療糖皮質(zhì)激素引起 的骨病的藥物組合物； 較佳地，所述的糖皮質(zhì)激素引起的骨病選自下組：骨質(zhì)疏松、骨髓脂肪化、股骨頭壞死。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的CEBPalpha抑制劑包括抑制 CEBPalpha基因（CEBPA)轉(zhuǎn)錄的RNAi，CEBPalpha基因的甲基化促進(jìn)劑、或抑制CEBPalpha 蛋白功能的抑制劑。
10. -種CEBPalpha或其促進(jìn)劑的用途，其特征在于，用于制備調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 分化平衡的組合物；或用于制備抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC)分化為脂肪細(xì)胞的組合物。
【文檔編號(hào)】A61P19/08GK104096233SQ201310116616
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月3日
【發(fā)明者】張曉玲, 李姣 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院