專利名稱:多系祖細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文涉及軟骨細(xì)胞，更具體而言，本文涉及將來自人臍帶血的多系祖細(xì)胞(MLPC) 分化為軟骨細(xì)胞，并從MLPC克隆系(clonal MLPC line)制備軟骨細(xì)胞克隆群。
背景
已在多個(gè)來源中鑒別到骨髓清除性治療后能造血重建的祖細(xì)胞，這些來源包括骨 髓、臍帶血和胎盤血，以及用干細(xì)胞動(dòng)員劑量的粒細(xì)胞集落刺激因子治療的對象的外周血。 這些細(xì)胞通常稱為造血干細(xì)胞(HSC)，它們是通過細(xì)胞表面糖蛋白如⑶34和⑶133的存在 而被鑒定的。作為“骨髓移植”的一部分，HSC僅占總細(xì)胞群中非常小的比例，并被認(rèn)為是該 治療中負(fù)責(zé)恢復(fù)接受清髓劑量的化療或放療的患者的造血功能的救命的治療部分。經(jīng)由骨 髓移植的干細(xì)胞治療已成為大量難治療的白血病和遺傳性血液疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療。
最近的研究提示，骨髓中存在能自我更新和分化成除血細(xì)胞以外的多種不 同組織類型的更原始的細(xì)胞群。發(fā)現(xiàn)這些多能細(xì)胞在成人骨髓的⑶34-塑性-黏附 細(xì)胞群中為微量組分，并被不同地稱為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC) (Pittenger等，Science 284 143-147(1999))、或多能成人祖細(xì)胞(MAPC) (Furcht, L. T.等，美國專利公開號(hào) 20040107453 Al)。MSC細(xì)胞不具有單一的特定鑒定標(biāo)記，但已顯示對多個(gè)標(biāo)記呈陽性，包括 ⑶29、⑶90、⑶105和⑶73，并對其它標(biāo)記呈陰性，包括⑶14、⑶3和⑶34。各個(gè)研究組已報(bào) 道，可將MSC細(xì)胞分化成肌細(xì)胞、神經(jīng)元、胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞和結(jié)締組織。其它研 究組(Wernet等，美國專利公開號(hào)20020164794Α1)已揭示了來自臍帶血內(nèi)CD457CD34—群 的具有多能性的未受限制的體干細(xì)胞(USSC)。

發(fā)明內(nèi)容
本文基于以下發(fā)現(xiàn)可通過誘導(dǎo)人胎血的多系祖細(xì)胞(MLPC)的分化而獲得軟骨 細(xì)胞。如本文所述，基于其免疫表型特征、基因表達(dá)特征、形態(tài)學(xué)和不同的生長模式，區(qū)分胎 血MLPC與來自骨髓的MSC、HSC和USSC。本文提供由個(gè)體細(xì)胞發(fā)育單型克隆細(xì)胞系的方法， 以及由這些克隆細(xì)胞系產(chǎn)生的軟骨細(xì)胞克隆群。本文還提供低溫保存MLPC(如，用于臍帶 血庫)和軟骨細(xì)胞的方法。
一方面，本文描述了一種組合物，該組合物含有純化的人胎血多系祖細(xì)胞(MLPC) 群或克隆的人胎血MLPC系和有效誘導(dǎo)所述MLPC分化成具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞的分化培 養(yǎng)基，其中，所述MLPC為⑶9陽性，⑶45陰性，⑶34陰性，SSEA-4陰性。所述MLPC還可以呈 CD13、CD29、CD44、CD73、CD90 和 CD105 陽性，且還可呈 CD10、CD41、Stro-I 和 SSEA-3 陰性。 在一些實(shí)施方式中，所述 MLPC 還呈 CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、 CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白 _A、干細(xì)胞因子和 HLA-DR 陰性。所述分化培養(yǎng)基可含有抗壞血酸、地塞米松、和轉(zhuǎn)化生長因子β 3(TGF-i3 3)。所述組合物還可含有生長基底。該生長基底可以包涂有膠原。例如，生長基底可以是膠原包涂的培 養(yǎng)設(shè)備或膠原包涂的三維支架(scaffold)。該三維支架可由磷酸三鈣或二氧化鈦形成。
本文還描述了一種制備具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞群的方法。該方法包括提供膠原 包涂的二維或三維生長基底，該基底容納純化的MLPC群或克隆的MLPC系；和用能有效誘導(dǎo) 所述MLPC分化成具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞的分化培養(yǎng)基培育所述純化的MLPC群或克隆的 MLPC系，其中，所述MLPC呈⑶9陽性、⑶45陰性、⑶34陰性和SSEA-4陰性。所述分化培養(yǎng) 基可含有抗壞血酸、地塞米松和TGF-β 3。該生長基底可以包涂有膠原。例如，生長基底可 以是膠原包涂的培養(yǎng)設(shè)備或膠原包涂的三維支架。該三維支架可由磷酸三鈣或二氧化鈦形 成。所述方法還可包括測試所述具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞的胞內(nèi)S0X9、胞內(nèi)II型膠原、胞 內(nèi)聚集蛋白聚糖(aggrecan)和TGF-β受體的細(xì)胞表面表達(dá)。
另一方面，本文描述了一種由人胎血制備具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞群的方法。該 方法包括使人胎血樣品與含有葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗體、抗CD15抗體和抗CD9抗體的 組合物接觸；使所述樣品分隔成黏附相和上清相；從上清相中回收細(xì)胞；通過與固體基底 黏附而從回收的細(xì)胞中純化MLPC，其中，所述MLPC呈⑶9陽性和⑶45陽性；培育所述MLPC， 使其獲得成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)；將具有成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)的MLPC或其后代加載到二維或 三維的膠原包涂的生長基底上，形成加載的生長基底；和用能有效誘導(dǎo)所述MLPC分化成具 有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述加載的生長基底。該方法還可包括，在加載 所述生長基底前，由具有成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)的所述MLPC制備克隆的MLPC系。
又一方面，本文描述了克隆的軟骨細(xì)胞群和含有這些克隆的群的組合物。在一個(gè) 實(shí)施例中，組合物含有克隆的成骨細(xì)胞群和培養(yǎng)基?？寺〉某晒羌?xì)胞群還可容納于三維支 架(如包涂膠原的三維支架)內(nèi)。所述三維支架可由磷酸三鈣或二氧化鈦形成。這些組合 物還可含有低溫保存劑(如二甲亞砜(DMSO)，例如1-10%的DMS0)。低溫保存劑可以是胎 牛血清、人血清、或者人血清白蛋白與一種或多種以下成分的組合DMS0、海藻糖和葡聚糖。 例如，低溫保存劑可以是人血清、DMSO和海藻糖，或者是胎牛血清和DMS0。
本文還描述了一種制品，該制品含有克隆的軟骨細(xì)胞群。該克隆群可容納于容器 (如小瓶或袋)內(nèi)。該容器還可含有低溫保存劑。該克隆群可以單層生長，并以懸浮方式低 溫保存，或者可容納于三維支架內(nèi)。該三維支架可容納于多孔板的孔內(nèi)。
除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員常規(guī)理解的含義相同。雖然可采用與本文所述的方法和材料類似或等價(jià)的 方法和材料實(shí)施本發(fā)明，但下文描述了合適的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申 請、專利和其它參考文獻(xiàn)的全文都以引用的方式納入本文。出現(xiàn)沖突時(shí)，以本說明書(包括 定義)為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)施例僅僅是闡述性的，而非限制性的。
依據(jù)下文詳細(xì)的描述以及權(quán)利要求
書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將更顯而易見。


圖1是從胎血純化MLPC的細(xì)胞分離程序的示意圖。
圖2A-2D是描述發(fā)育的MLPC的形態(tài)學(xué)的顯微照片。圖2A顯示從臍帶血分離的 MLPC的早期培養(yǎng)物，證明了所述細(xì)胞處于白細(xì)胞形態(tài)學(xué)期。圖2B顯示開始由白細(xì)胞形態(tài)
權(quán)利要求
軟骨細(xì)胞的克隆群。
2.一種組合物，該組合物含有權(quán)利要求
1所述的軟骨細(xì)胞克隆群和培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求
2所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有低溫保存劑。
4.如權(quán)利要求
3所述的組合物，其特征在于，所述低溫保存劑是二甲亞砜(DMS0)。
5.如權(quán)利要求
4所述的組合物，其特征在于，所述低溫保存劑是1-10%DMS0。
6.如權(quán)利要求
3所述的組合物，其特征在于，所述低溫保存劑是胎牛血清，人血清，或 人血清白蛋白與DMS0、海藻糖和葡聚糖中的一種或多種的組合。
7.如權(quán)利要求
3所述的組合物，其特征在于，所述低溫保存劑是人血清、DMS0和海藻 糖；或者是胎牛血清和DMS0。
8.如權(quán)利要求
3所述的組合物，其特征在于，所述軟骨細(xì)胞的克隆群容納于膠原包涂 的培養(yǎng)設(shè)備內(nèi)。
9.一種制品，其含有權(quán)利要求
1所述的克隆群。
10.如權(quán)利要求
9所述的制品，其特征在于，所述克隆群容納于容器內(nèi)。
11.如權(quán)利要求
10所述的制品，其特征在于，所述容器是小瓶或袋。
12.如權(quán)利要求
10所述的制品，其特征在于，所述容器還含有低溫保存劑。
13.如權(quán)利要求
9所述的制品，其特征在于，所述克隆群容納于膠原包涂的培養(yǎng)設(shè)備內(nèi)。
14.一種組合物，其含有人胎血多系祖細(xì)胞(MLPC)的純化群或人胎血MLPC克隆系和有 效誘導(dǎo)所述MLPC分化成具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，其中所述MLPC呈CD9陽 性、CD45陰性、CD34陰性和SSEA-4陰性。
15.如權(quán)利要求
14所述的組合物，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基含有抗壞血酸、地塞米 松和 TGF-3 3。
16.如權(quán)利要求
14所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有生長基底。
17.如權(quán)利要求
16所述的組合物，其特征在于，所述生長基底包涂有膠原。
18.如權(quán)利要求
17所述的組合物，其特征在于，所述生長基底是膠原包涂的培養(yǎng)設(shè)備。
19.如權(quán)利要求
14所述的組合物，其特征在于，所述MLPC還呈⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、 CD90 和 CD105 陽性，和呈 CD10、CD41、Stro_l 和 SSEA-3 陰性。
20.如權(quán)利要求
19所述的組合物，其特征在于，所述MLPC還呈⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、 CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋 白-A、干細(xì)胞因子和HLA-DR陰性。
21.一種制備具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞群的方法，所述方法包括a)提供膠原包涂的 二維生長基底，該基底容納純化的MLPC群或MLPC克隆系；和用能有效誘導(dǎo)所述MLPC分化 成具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞的分化培養(yǎng)基培育所述純化的MLPC群或MLPC克隆系，其中，所 述MLPC呈CD9陽性、CD45陰性、CD34陰性和SSEA-4陰性。
22.如權(quán)利要求
21所述的方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基含有抗壞血酸、地塞米松 禾口 TGF-3 3。
23.如權(quán)利要求
21所述的方法，其特征在于，所述生長基底是膠原包涂的培養(yǎng)設(shè)備。
24.如權(quán)利要求
21所述的方法，其特征在于，所述方法還包括測試所述具有軟骨細(xì)胞 表型的細(xì)胞的胞內(nèi)聚集蛋白聚糖、胞內(nèi)II型膠原、胞內(nèi)S0X9或細(xì)胞表面的TGF-0受體。
25.如權(quán)利要求
21所述的方法，其特征在于，所述MLPC還呈⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、 CD90 和 CD105 陽性，和呈 CD10、CD41、Stro_l 和 SSEA-3 陰性。
26.如權(quán)利要求
25所述的方法，其特征在于，所述MLPC還呈⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、 CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋 白-A、干細(xì)胞因子和HLA-DR陰性。
27.一種從人胎血制備具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞群的方法，該方法包括a)使人胎血樣品與一組合物接觸，所述組合物含有i)葡聚糖；ii)抗血型糖蛋白A抗體；iii)抗CD15抗體；和iv)抗CD9抗體；b)使所述樣品分配成凝集相和上清相；c)從所述上清相中回收細(xì)胞；d)通過粘附到固相基底上而從回收的細(xì)胞中純化MLPC，其中，所述MLPC呈⑶9陽性和 CD45陽性；e)培養(yǎng)所述MLPC細(xì)胞，使其獲得成纖維細(xì)胞表型；f)將所述具有成纖維細(xì)胞表型的MLPC或其后代加載到二維膠原包涂的生長基底上， 形成加載的生長基底；和g)用能有效誘導(dǎo)所述MLPC分化成具有軟骨細(xì)胞表型的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述加載的生長基底。
28.如權(quán)利要求
27所述的方法，其特征在于，所述方法還包括，在加載所述生長基底 前，從所述具有成纖維細(xì)胞形態(tài)的MLPC中制備MLPC的克隆系。
專利摘要
本發(fā)明描述了具有廣譜跨分化能力的胎血多系祖細(xì)胞，以及將這些祖細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N5/077GKCN101835479SQ200880100283
公開日2010年9月15日 申請日期2008年7月25日
發(fā)明者D·P·柯林斯 申請人:佰歐益有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan