專利名稱：調(diào)控酸脅迫抑制維生素c發(fā)酵菌株產(chǎn)酸的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵制備維生素C的基礎(chǔ)研究及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及酸脅迫過程中發(fā)酵菌株細胞內(nèi)調(diào)控維生素C產(chǎn)量降低的關(guān)鍵基因。
背景技術(shù)：
維生素C，又稱抗壞血酸，是人體必需的一種維生素和抗氧化劑。我國自行開發(fā)并具有自主知識產(chǎn)權(quán)的維生素C兩步發(fā)酵工藝，是目前唯一成功應(yīng)用于維生素C工業(yè)生產(chǎn)的微生物轉(zhuǎn)化法。維生素C的“二步發(fā)酵”工藝如下第一步是將 D-山梨醇氧化為L-山梨糖，俗稱醇糖轉(zhuǎn)化，第二步是將L-山梨糖進一步氧化為維生素C 的前體2-酮基-L-古龍酸Q-keto-L-gulonic acid, 2-KLG)，俗稱糖酸轉(zhuǎn)化。其中第二步是在由普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonicigenium vulgare，俗稱小菌)和巨大芽胞桿菌 (Bacillus megaterium，俗稱大菌)組成的混合菌系的作用下完成的普通生酮基古龍酸菌為產(chǎn)酸菌，負責(zé)將L-山梨糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-KLG，其單獨培養(yǎng)時生長微弱，產(chǎn)酸較少；巨大芽孢桿菌為伴生菌，不直接參與L-山梨糖向2-KLG的轉(zhuǎn)化，但能在混菌體系中顯著促進普通生酮基古龍酸菌生長和2-KLG的積累。酸脅迫是二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C過程中經(jīng)常遭遇的逆境條件，影響維生素C產(chǎn)量的穩(wěn)定性。維生素C的混菌發(fā)酵過程的最適PH為6. 7 7. 0，在實際生產(chǎn)中，為了維持培養(yǎng)液中PH處于該最適PH范圍內(nèi)，通常在培養(yǎng)液中流加一定的中和劑，如Na0H、CaC03等。 然而，中和劑的流加一方面導(dǎo)致發(fā)酵液中滲透壓升高，使微生物遭遇高滲脅迫；另一方面引入的Na+等金屬離子增加后續(xù)提取工藝的復(fù)雜度和成本。由此看來，若能夠提高發(fā)酵菌株對低PH的耐受力，從而實現(xiàn)發(fā)酵菌株在較低pH環(huán)境下發(fā)酵產(chǎn)酸，是具有重要的實際意義的。 代謝工程技術(shù)是目前獲得具有理想性狀工業(yè)微生物的重要手段。然而，不了解微生物對逆境條件的響應(yīng)機制，就不能制定出合理有針對性的代謝工程策略。因此，確定生產(chǎn)菌株中調(diào)控酸脅迫誘導(dǎo)2-KLG產(chǎn)量降低的關(guān)鍵基因是首先要解決的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測混合培養(yǎng)微生物基因表達水平的方法，該方法不需要混合培養(yǎng)的微生物的分離純化。該方法利用基因芯片技術(shù)實現(xiàn)混合培養(yǎng)微生物的基因表達水平的特異性檢測，其中目的微生物特異的表達譜芯片通過利用目的微生物基因組序列設(shè)計的特異性探針制成。該方法包括將經(jīng)特定條件處理和未經(jīng)處理的混合培養(yǎng)的微生物進行總 RNA的抽提純化，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并進行熒光標(biāo)記后，與目的微生物的表達譜芯片進行雜交， 最后根據(jù)不同處理的微生物樣本的雜交信號的強弱即可獲得目的微生物中受處理條件影響的基因表達水平的變化差異。本發(fā)明提供了一種用于篩選混合發(fā)酵培養(yǎng)的目的微生物中涉及環(huán)境因子減弱其發(fā)酵能力的基因的方法，以及提供了通過該方法獲得的關(guān)鍵基因。本發(fā)明中目的微生物單獨培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酸能力微弱，但混合培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酸能力旺盛。該方法包括在目的微生物單獨培養(yǎng)與混合培養(yǎng)，以及混合培養(yǎng)的微生物經(jīng)環(huán)境因子處理和未經(jīng)處理的情況下，測定目的微生物在不同培養(yǎng)條件下的基因表達水平。目的微生物混合培養(yǎng)時基因表達水平較單獨培養(yǎng)時顯著地增高或者降低，則鑒定這些基因與混合培養(yǎng)的目的微生物發(fā)酵產(chǎn)酸密切相關(guān)。 若在環(huán)境因子處理后混合培養(yǎng)的目的微生物中這些基因的表達水平較未經(jīng)處理時顯著降低或者增高，則鑒定這些基因與環(huán)境因子減弱混菌發(fā)酵產(chǎn)酸密切相關(guān)。比較與混合培養(yǎng)的目的微生物發(fā)酵產(chǎn)酸密切相關(guān)的基因和與環(huán)境因子減弱混菌發(fā)酵產(chǎn)酸密切相關(guān)的基因，獲得參與環(huán)境因子抑制混菌發(fā)酵產(chǎn)酸的關(guān)鍵基因?；虻谋磉_水平利用表達譜芯片技術(shù)測定。本發(fā)明涉及膜轉(zhuǎn)運蛋白基因的在酸脅迫處理前后的表達差異，與酸脅迫誘導(dǎo) 2-KLG產(chǎn)量降低密切相關(guān)的關(guān)鍵基因為鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白基因。本發(fā)明人實驗室已經(jīng)完成了普通生酮基古龍酸菌的全基因組測序以及基因組注釋工作，結(jié)果表明普通生酮基古龍酸菌的膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)異常發(fā)達該菌基因組共有3060個基因，其中膜轉(zhuǎn)運蛋白基因有361個，占總基因組的11%。另外，通過基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通生酮基古龍酸菌缺失部分營養(yǎng)代謝途徑，如糖酵解、氨基酸和維生素代謝途徑。而轉(zhuǎn)運蛋白具有轉(zhuǎn)運離子、氨基酸、核苷酸、多糖、 多肽、甚至蛋白質(zhì)的生理功能。亦有許多研究表明，各種膜轉(zhuǎn)運蛋白亦是微生物抵御各種脅迫的重要組分。本發(fā)明中確定與酸脅迫誘導(dǎo)2-KLG產(chǎn)量降低密切相關(guān)的關(guān)鍵基因為鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白基因。
具體實施例方式1.菌株本專利所用2-KLG發(fā)酵菌株為普通生酮基古龍酸菌(Ketoguloncigenium vulgare)和巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)組成的混合菌體系。2.培養(yǎng)基種子/斜面培養(yǎng)基(g.L—1) =L-山梨糖20，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏3，玉米漿 1. 5，尿素1，碳酸鈣1，硫酸鎂0. 2，磷酸二氫鉀1，瓊脂20 (脅迫培養(yǎng)基)。用2mol. L4NaOH 溶液調(diào)起始pH為6. 7 7. 0，121°C滅菌15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g.L—1) :L-山梨糖80，玉米漿5，尿素12，碳酸鈣5，硫酸鎂0.1，磷酸二氫鉀1。用2mol. I^1NaOH溶液調(diào)起始pH為6. 7 7. 0，121°C滅菌15min。3.菌株培養(yǎng)⑴種子培養(yǎng)從新鮮斜面上接一環(huán)菌入種子培養(yǎng)基(75ml/750ml錐形瓶)，在30°C、200r/min下巨大芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)他，普通生酮基古龍酸菌搖瓶培養(yǎng)3 后，以10%接種量(體積分?jǐn)?shù))接入發(fā)酵培養(yǎng)基。(2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)750ml錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為75ml，溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵至對數(shù)中期，收集細胞并用細菌保護液Oiiagen)處理后，保存于-80°C用于總RNA抽提。(3)酸脅迫收集上述混菌發(fā)酵和普通生酮基古龍酸菌單獨發(fā)酵過程中培養(yǎng)至對數(shù)中期的細胞，分別加入2. 8ml和0. 6ml 2mol/L HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至4. 0和4. 5，脅迫2h，收集細胞并用細菌保護液Oiiagen)處理后，保存于-80°C用于總RNA抽提。4.總 RNA 抽提細菌總 RNA 抽提按照 RNAprotect Bacteria Reagent AND RNeasy Mini Kit 試劑盒toiagen)說明書進行，并用DNase I去除殘留DNA。通過測定總RNA在^0nm、230nm 和^Onm處的吸光值，進行定量及純度檢測，并用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳確認RNA的完整性。5.表達譜芯片分析(1)芯片合成表達譜芯片由上?？党缮锕こ逃邢薰疚蠥gilent (Agilent，Santa Clara, CA, USA)依據(jù)普通生酮基古龍酸菌基因組全序列設(shè)計合成。(2)芯片雜交用Cy3_dUTP和Cy5_dUTP標(biāo)記mRNAs，委托上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿?。(3)芯片掃描與數(shù)據(jù)分析通過Agilent Manner獲取圖像并在10 μ m條件下進行掃描像素值。圖像使用 Feature Extraction進行定量分析，得到圖像定量和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)。實施例1在混合培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)的普通生酮基古龍酸菌中膜轉(zhuǎn)運蛋白基因的表
達差異表1混菌培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)的普通生酮基古龍酸菌中膜轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達差異
權(quán)利要求
1.一種檢測混合培養(yǎng)微生物基因表達水平的方法，其特征在于基于目的微生物基因組序列的特異性探針的設(shè)計合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中利用表達譜芯片技術(shù)測定基因的表達水平。
3.一種用于篩選混合發(fā)酵培養(yǎng)的目的微生物中涉及環(huán)境因子減弱其發(fā)酵能力的基因的方法，包括(1)目的微生物單獨培養(yǎng)與混合培養(yǎng)；(2)混合培養(yǎng)的微生物經(jīng)環(huán)境因子處理和未經(jīng)處理的情況下，測定目的微生物在不同培養(yǎng)條件下的基因表達水平；(3)目的微生物混合培養(yǎng)時基因表達水平較單獨培養(yǎng)時顯著地增高或者降低，則鑒定這些基因與混合培養(yǎng)的目的微生物發(fā)酵產(chǎn)酸密切相關(guān)；(4)若在環(huán)境因子處理后混合培養(yǎng)的目的微生物中這些基因的表達水平較未經(jīng)處理時顯著降低或者增高，則鑒定這些基因與環(huán)境因子減弱混菌發(fā)酵產(chǎn)酸密切相關(guān)；(5)比較與混合培養(yǎng)的目的微生物發(fā)酵產(chǎn)酸密切相關(guān)的基因和與環(huán)境因子減弱混菌發(fā)酵產(chǎn)酸密切相關(guān)的基因，獲得參與環(huán)境因子抑制混菌發(fā)酵產(chǎn)酸的關(guān)鍵基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，可以通過權(quán)利要求1所述方法獲得關(guān)鍵基因。
5.通過利用權(quán)利要求3的方法獲得與酸脅迫抑制混菌發(fā)酵產(chǎn)酸的關(guān)鍵基因為鐵離子轉(zhuǎn)運基因。
全文摘要
調(diào)控酸脅迫抑制維生素C發(fā)酵菌株產(chǎn)酸的基因，屬于發(fā)酵制備維生素C的基礎(chǔ)研究及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。確定生產(chǎn)菌株中調(diào)控酸脅迫誘導(dǎo)2-KLG產(chǎn)量降低的關(guān)鍵基因有助于制定出針對性強的代謝工程策略。本發(fā)明利用表達譜芯片技術(shù)分析了混合培養(yǎng)的微生物中特定微生物的基因表達情況，尤其是膜轉(zhuǎn)運蛋白基因。與單獨培養(yǎng)相比，混菌培養(yǎng)的普通生酮基古龍酸菌中共有45個膜轉(zhuǎn)運蛋白基因上調(diào)，15個膜轉(zhuǎn)運蛋白基因下調(diào)。值得注意的是，這其中有7個鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白基因被抑制表達。酸脅迫后，鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白基因卻過量表達。發(fā)酵時添加鐵離子抑制混菌發(fā)酵產(chǎn)酸。以上結(jié)果表明，鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白在酸脅迫誘導(dǎo)混菌發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG產(chǎn)量降低的過程中發(fā)揮反作用。
文檔編號C12Q1/02GK102286614SQ20111016673
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者劉立明, 楊皓茹, 陳堅 申請人:江南大學(xué)